一種以fmyyssr-2標(biāo)記對煙草原料進(jìn)行鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)研宄領(lǐng)域，具體是一種以FMYYSSR-2標(biāo)記（即分子標(biāo)記技 術(shù)）對煙草原料進(jìn)行鑒定的方法，由于本方法以煙草物種DNA的特異性作為鑒定依據(jù)，因此 與傳統(tǒng)鑒定方法相比，有更加客觀、更加準(zhǔn)確、更加可靠的優(yōu)勢。
【背景技術(shù)】
[0002] 在煙草原料的鑒別檢驗(yàn)工作中，多是通過外觀判斷、評(píng)吸等手段進(jìn)行煙草原料鑒 定，個(gè)別煙草原料鑒別檢驗(yàn)涉及相關(guān)的化學(xué)成分檢測。但就目前來看，部分形態(tài)的煙草原料 (如煙絲、煙沫等)，很難從外觀上進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)，煙草與其他植物之間、各煙草種類之間也 很難完全以化學(xué)成分檢測及評(píng)吸來進(jìn)行鑒別；而且上述鑒別要求檢驗(yàn)人員不僅需要掌握相 關(guān)的原料特性、化學(xué)成分分析方法、感官評(píng)吸技術(shù)，還需具備煙草原料生產(chǎn)和分級(jí)技能，檢 驗(yàn)人員的培訓(xùn)難度大；另外，煙草原料本身的霉變和不法分子所采取的染色、加香加料等手 段，也加大了檢驗(yàn)人員進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的難度。
[0003]DNA分子標(biāo)記技術(shù)屬于分子生物學(xué)研宄范疇，是從DNA水平區(qū)分不同物種甚至是 同一物種不同個(gè)體之間的選擇性標(biāo)記技術(shù)[1_ 7]。自上世紀(jì)80年代以來，隨著聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，DNA分子生物學(xué)研宄發(fā)展迅猛，目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十 種之多，如限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RestrictionFragmentLengthpolymorphism, RFLP)[8]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAH))?、序列特異 性擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記（SequenceCharacterizedAmplifiedRegions,SCAR)[1°]、內(nèi)含子長度多 態(tài)性標(biāo)記（intron-lengthpolymorphism,ILP)[n]、單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotide Polymorphism，SNP)[12]、簡單序列重復(fù)標(biāo)記（SimpleSequenceRepeats,SSR)[13]等。由于 在DNA分子水平，不同物種間甚至是同一物種不同個(gè)體之間都能得到很好的區(qū)分，因此DNA 分子標(biāo)記技術(shù)作為物種分類鑒定的一種手段，已被廣泛地應(yīng)用于屬間、種間、品種間的分類 鑒定和親緣關(guān)系研宄中，幾乎可以對所有的生物種類進(jìn)行分類鑒定 [14_24]，在目前物種鑒定 技術(shù)中發(fā)展最快，也最為熱門。表1列出了DNA分子標(biāo)記技術(shù)在各類鑒定中的應(yīng)用。
[0004] 表1DNA分子標(biāo)記技術(shù)在各類鑒定中的應(yīng)用
目前的煙草原料鑒別檢驗(yàn)技術(shù)，以樣品的外觀、口感及化學(xué)成分特征為基礎(chǔ)，只能外 在、間接地反映煙草物種的特性，導(dǎo)致目前的鑒別檢驗(yàn)易受外界環(huán)境、檢驗(yàn)人員主觀感受 差異、加工條件及煙草本身器官組織變化等因素的影響，準(zhǔn)確性、可靠性有較大局限；而以 DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行煙草原料鑒定，是以煙草基因組序列信息為基礎(chǔ)，可內(nèi)在、直接地反 映煙草的特性，以其進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)不受上述諸多因素的影響。因而以DNA分子標(biāo)記技術(shù)來 對煙草原料進(jìn)行鑒定，無疑將會(huì)更加準(zhǔn)確、可靠。
[0005] 中國專利公開了云南紅云紅河集團(tuán)申報(bào)的一種應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定商品 卷煙的方法，通過識(shí)別單品種或混合品種的特征條帶，掌握所鑒定樣品的原料品種組成，達(dá) 到辨別真?zhèn)蔚哪康摹?br>[0006] 隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的動(dòng)植物基因組已經(jīng)被測序出來。迄今為 止，在前科里，已有栽培番前（Solanumlycopersicum)，馬鈴薯（Solanumtuberosum)， 辣椒（Capsicumannuum)，本氏煙（Nicotianabenthamiana)，潘那利番前（Solanum pennellii)，野生醋栗番前（Solanumpimpinellifolium)，（Nicotianatabacum)等的基因 組序列或基因組草圖被公布出來。這為我們開發(fā)煙草特異的分子標(biāo)記提供了可能。作為面 向市場和應(yīng)用、具有權(quán)威性和法律效應(yīng)的鑒定技術(shù)，必須準(zhǔn)確可靠，簡單易行。基于SSR的 分子標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳就可較為方便的完成樣品檢測。而其他基于SNP等的 分型手段，還必須經(jīng)過sanger測序等一系列方式，增添不必要的成本和步驟。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供的一種以FMYYSSR-2標(biāo)記對煙 草原料進(jìn)行鑒定的方法。
[0009] 本發(fā)明的研宄過程及原理在于：廣泛收集了目前在煙草中已經(jīng)開發(fā)和發(fā)表的SSR 標(biāo)記，作為篩選和過濾的基礎(chǔ)。具體分析步驟包括：1、取擬南芥、本氏煙（國際上普遍采用 的一種模式煙草種，與普通煙草親緣關(guān)系較近）、栽培煙草、番茄和土豆作為參考序列，將候 選標(biāo)記進(jìn)行比對；2、過濾掉能和擬南芥、番前和土豆能比對上的SSR標(biāo)記。3、選取能和本氏 煙、栽培煙草均能比對上，且擴(kuò)增序列單一的SSR標(biāo)記。4、篩選的標(biāo)記掃描美國國立生物技 術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI)數(shù)據(jù)庫的所有物種 基因序列信息，驗(yàn)證上述引物在煙草中的特異性。經(jīng)過篩選，最終確定以FMYYSSR-2標(biāo)記， 對樣品是否為煙草進(jìn)行鑒定。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種以FMYYSSR-2標(biāo)記對煙草原料進(jìn)行鑒定的方法，在以十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)法，對各個(gè)品種標(biāo)準(zhǔn)煙草樣品的DNA進(jìn)行提取后，以所設(shè)計(jì)的引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，在經(jīng)過電泳分析后，確定煙草物種的特異性條帶位置；再以同樣的方法對樣品進(jìn)行處理 后，視其在相應(yīng)位置有無條帶產(chǎn)生來判斷該樣品是否為煙草，具體步驟如下： 1) FMYYSSR-2標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)，上下游引物序列分別為TGCACATAGGAAACACTTTAGTACA 和TTGAGATTTGGGTTCTTACCAA; 2) 煙草樣品及待測樣品DNA提?。海?)取不同樣品分別將其組織碾磨成細(xì)粉末，放入2 mL離心管中。（2)加入600~800yL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65°C水浴預(yù)熱)，每 3~5min輕輕震蕩幾次，20min后12000r/min離心10~15min。（3)小心吸取上清液，加 入等體積的苯酷：氯仿(各400yL)溶液，混勾，4 °C，12000r/min，離心10~15min;(4)小 心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勾，4 °C，12000r/min，離心10~15min，重復(fù)2~3次， 以蛋白層不出現(xiàn)為止。（5)取上清，-20 °C沉淀1~2h，4 °C，12000r/min，離心10~15min; (6)棄去上清液，用50%~70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥后（一般干燥10~15min)， 于-20 °C或者-70 °C下保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 3)PCR反應(yīng)按以下程序進(jìn)行：解鏈溫度95°C，30秒，退火溫度55°C，30秒，延伸溫 度68 °C，30秒，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。
[0012] 4)取25yL的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析，在確定煙草物種的特異性條帶位置后，視 樣品在相應(yīng)位置有無條帶產(chǎn)生來判斷該樣品是否為煙草。結(jié)果如圖1所示。從電泳結(jié)果可 以看出，所有煙草樣品均能擴(kuò)出明顯的特異性條帶(約200bp處)，該條帶在樣品1-4中均 能擴(kuò)出，在樣品5-8中均未見擴(kuò)出。這說明樣品1-4為煙草，樣品5-8為非煙草。
[0013] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：本方法以煙草物種DNA的特異性作為鑒定依 據(jù)，因此與傳統(tǒng)鑒定方法相比，有更加客觀、更加準(zhǔn)確、更加可靠的優(yōu)點(diǎn)。
[0014] 本發(fā)明與云南紅河集團(tuán)所申報(bào)專利的具體區(qū)別體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)： 1.本發(fā)明的SSR標(biāo)記在設(shè)計(jì)時(shí)經(jīng)過了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳镄畔W(xué)分析，針對煙草物種的特異位 點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，這與云南的專利申報(bào)內(nèi)容有著本質(zhì)區(qū)別。
[0015] 2.本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物與云南專利所設(shè)計(jì)的引物序列不同。我們引物設(shè)計(jì)的出 發(fā)點(diǎn)，是為了滿足煙草原料鑒別檢驗(yàn)工作的需求，具體來說，我們設(shè)計(jì)的引物是為了鑒定待 測樣品是否為煙草樣品，這與云南專利的用途方面有著顯著差異。
[0016] 3.本發(fā)明設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記與云南專利的SSR標(biāo)記用途不同：云南專利所設(shè)計(jì)的 SSR標(biāo)記用于商品卷煙的真假判定；我們所設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記用于煙草與非煙草樣品的判定， 這在涉案煙草原料的處理中非常重要。
【附圖說明】
[0017] 圖1.煙草鑒定DNA分子標(biāo)記FMYYSSR-2的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果， 圖中：1.K326;2.云煙97;3.林煙草；4.絨毛狀煙草；5.樣品1;6.樣品2;7.樣品 3;8?樣品 4;9?樣品 5;10?樣品 6;11?樣品 7;12?樣品 8.M，trans2KDNAmarker〇
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例做進(jìn)一步描述： 實(shí)施例1 1.FMYYSSR-2標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)。上下游引物序列分別為TGCACATAGGAAACACTTTAGTACA和TTGAGATTTGGGTTCTTACCAA。
[0019] 2.煙草樣品及待測樣品DNA提取：⑴取不同樣品分別將其組織碾磨成細(xì)粉末， 放入2mL離心管中。（2)加入600yL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65°C水浴預(yù)熱)， 每3min輕輕震蕩幾次，20min后12000r/min離心10min。（3)小心吸取上清液，加入等 體積的酚：氯仿(各400yL)溶液，混勻，4 °C，12000r/min，離心10min; (4)小心吸取上 清液，加入等體積的氯仿，混勾，4 °C，12000r/min，離心10min，重復(fù)2次，以蛋白層不出現(xiàn) 為止。（5)取上清，-20 °C沉淀1h，4 °C，12000r/min，離心10min;(