一種同步鑒別動物源性成分的pcr方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肉及動物產(chǎn)制品中動物源性成分鑒定的檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種 利用線粒體DNA鑒定山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛源性成分的PCR方法及試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 動物源性成分鑒定源于對動物飼料中添加牛羊成分的檢測。1985年英國發(fā)生"瘋 牛病"，并在隨后的幾年里傳播至歐洲多個國家和地區(qū)。"瘋牛病"不僅給這些國家?guī)斫?jīng) 濟損失，還帶來政治上的危機。后來研宄證明，飼料中添加的含有"瘋牛病"致病因子朊蛋 白的牛羊源成分是傳播該病的重要媒介，因此世界各國明令禁止在飼料中添加牛羊源性成 分，并對此進(jìn)行嚴(yán)格檢測。如今，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，肉類及其產(chǎn)制品已經(jīng)成為人們營養(yǎng) 所需和日常消費的重要來源。但另一方面，較高的肉類生產(chǎn)成本和價格致使部分不法商販 以次充好、摻假造假事件及所謂的"掛羊頭賣狗肉"時有發(fā)生，"假牛肉事件"和"馬肉風(fēng)波" 等食品問題便是典型案例，這不僅損害了消費者的利益，同時帶來諸多社會問題。當(dāng)今的食 品種類更加豐富多樣化，一部分加工食品改變了外觀和氣味；與之同時，網(wǎng)絡(luò)銷售也給摻假 造假帶來了可乘之機。
[0003] 早期肉類鑒別主要依賴于感官和形態(tài)學(xué)檢驗，這些檢驗方法受到儀器、人員經(jīng)驗 和樣本處理過程等諸多局限性，準(zhǔn)確性低，尤其對于深加工的肉類以及飼料中添加的動物 源性成分基本無法鑒別。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，鑒定技術(shù)發(fā)展了形態(tài)學(xué)分析和成分鑒定 方法，在這個過程中基本確立了以特征性的蛋白和核酸作為靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢驗的思路，如 今形成了蛋白檢驗和DNA分析兩個不同的檢測方向。經(jīng)過20多年的發(fā)展，兩種鑒別技術(shù)在 精度和靈敏度均有極大提高。但是當(dāng)肉類經(jīng)過物理處理如切碎、混合、腌制、蒸煮和熏烤等 過程后失去了原有形態(tài)和質(zhì)地，蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)很難滿足對這些樣品檢測的需要。而DNA 尤其是線粒體DNA(mtDNA)具有耐熱性強、不依賴于細(xì)胞形態(tài)、種間多態(tài)性好等特點，表現(xiàn) 出更高的準(zhǔn)確度和精度以及重復(fù)性，成為近年來物種鑒定"DNA條形碼"技術(shù)發(fā)展的首選靶 標(biāo)。
[0004] 國家監(jiān)管部門先后頒布多項法律法規(guī)來規(guī)范動物性食品加工銷售的多個環(huán)節(jié)，在 技術(shù)上也制定了一系列的方法標(biāo)準(zhǔn)用于常見肉類動物成分的檢測。但另一方面，大部分現(xiàn) 行國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測對象為單一物種或同類物種，檢測效率低，對于未知物種更是難以鑒定。 同時，多數(shù)方法基于熒光定量PCR技術(shù)，存在對儀器要求高、試劑相對價格高等特點，對大 批量樣品進(jìn)行篩選的成本高、耗時長，難以在基層檢測部門開展推廣應(yīng)用。因此，建立一種 簡便易行且可以同時鑒定多種動物源性成分的檢測方法以便提高檢測工作效率，這對未知 動物源性成分的溯源鑒定也具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有物種鑒定技術(shù)中一次只能鑒定一個物種、而多重PCR技術(shù)又存在特 異性低的不足，本發(fā)明提供了一種能在一次PCR操作中鑒別山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、 駱駝和牦牛8種動物源性成分的方法，及由此獲得的物種鑒定檢測試劑盒。
[0006] 申請人經(jīng)過對多種常見物種的mtDNA全序列做精細(xì)對比，獲得了山羊、綿羊、水 牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛8個物種的mtDNA特異性插入-缺失片段，因此可在PCR擴增 后依據(jù)擴增產(chǎn)物同時鑒定這些物種，提高了檢測效率。
[0007] 本發(fā)明的方法，包括如下步驟：
[0008] 1)提取待檢測樣品的基因組DNA，將提取的樣品基因組DNA溶于TE溶液中保存?zhèn)?用；
[0009] 2)利用PCR引物對檢測樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)；
[0010] 所用引物序列如下：
[0011] 上游引物：CCTCCCTAAGACTCAAGGAA(SEQIDNO:1)、
[0012] 下游引物：AGCGGGTTGCTGGITTCACG(SEQIDNO:2);
[0013] 3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，依據(jù)PCR產(chǎn)物條帶大小和有無可判定檢測樣品中是 否含有上述8種動物源性成分，其中山羊、綿羊、鹿、水牛、家牛、牦牛、豬和駱駝擴增后獲得 對應(yīng)片段大小分別為 760bp、737bp、537bp、486bp、481bp、464bp、429bp和 359bp。
[0014] 作為優(yōu)選，在步驟2)同時設(shè)置陽性和陰性對照組。
[0015] 步驟2)的PCR反應(yīng)程序如下：
[0016] 95°C變性 5min;95°C變性 30s，退火 61. 5°C35s，72°C延伸 30s為一個循環(huán)，共計 30 個循環(huán)；然后72°C保持lOmin。結(jié)束后降溫至4°C。
[0017] 所述的陽性對照為完好的山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦?；蚪MDNA 樣品，陰性對照為雙蒸水。
[0018] 本發(fā)明還提供一種適用山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛成分檢測的PCR 試劑盒，其包含下列試劑及合適濃度：
[0019]PCRA液：含有dNTP、MgCl2、PCRbuffer、Taq聚合酶、引物和雙蒸水。
[0020] PCRB液：含有陽性DNA模板，包括山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝、牦牛的基 因組DNA。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以在一次PCR反應(yīng)中檢測山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、 鹿、駱駝和牦牛8個物種，且具有良好的特異性和靈敏性。相對現(xiàn)有檢測技術(shù)大大提高了檢 測效率，尤其對于未知物種成分的溯源檢測具有重要意義。相比更為復(fù)雜的多重PCR技術(shù)， 本發(fā)明在一定程度上提高了靈敏度，更為重要的是一次PCR就可以鑒定8個物種，大大提高 了篩選和檢測的效率。本發(fā)明基于PCR技術(shù)平臺開發(fā)，對實驗室設(shè)備要求不高，適于絕大多 數(shù)單位應(yīng)用。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明對山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛的DNA樣品的PCR擴增 電泳檢測結(jié)果。圖中所示為泳道編號1-8和對應(yīng)產(chǎn)物大?。ǖ诙袛?shù)字是對應(yīng)PCR產(chǎn)物大 小，單位bp) :1 :山羊；2:綿羊；3 :鹿；4:水牛；5:家牛；6:牦牛；7:豬；8:駱駝。參照分子 量標(biāo)注依次是 1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp*100bp。
[0023] 圖2是本發(fā)明對8種動物DNA樣品PCR產(chǎn)物SspI酶切鑒定的檢測結(jié)果。圖中各泳 道標(biāo)注了物種名稱，其酶切后對應(yīng)產(chǎn)物片段大小如下：山羊：291bp、192bp、160bp和118bp; 綿羊：300bp、213bp和 75bp;鹿：391bp和 146bp;水牛：486bp;家牛：303bp和 178bp;耗牛： 214bp、178bp和 73bp;豬：300bp和 129bp;駱駝：359bp。
【具體實施方式】
[0024] 申請人經(jīng)過對山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛8個物種及常見動物（包 括雞、鴨、鼠、兔、狗、馬、驢、魚類）的mtDNA全序列做精細(xì)對比，發(fā)現(xiàn)了這些物種的保守序列 以及所轄區(qū)間特有的變異序列，這段變異序列在物種間存在插入-缺失多態(tài)性，因此可以 用于物種鑒定。在保守區(qū)設(shè)計引物，經(jīng)過PCR條件優(yōu)化后完全能夠達(dá)到預(yù)期效果且擴增片 段大小與預(yù)期結(jié)果一致，特異性和穩(wěn)定性良好，更為重要的是可在一步PCR中同時鑒定這8 個物種，提高了物種溯源研宄和檢測效率。
[0025] 下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法過程做進(jìn)一步說明。但實例僅限于說明，并不限 于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克 (Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn) 行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護 和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。
[0026] 實施例1引物設(shè)計
[0027] 根據(jù)GenBank所公布的基因序列，以山羊（⑶229278)、鹿（HQ191428)、水牛 (AF702618)、牛（EU177861)、綿羊（KF938337)、牦牛（KM233416)、豬（AF486867)和駱駝 (AP003423)的mtDNA全序列為模板，通過比對分析8個物種和常見物種（雞、鴨、兔、鼠、馬、 狗）的mtDNA序列，根據(jù)其基因序列的特異性和保守性，利用Primerpremier5.0軟件，設(shè) 計多個物種的通用引物，該引物與上述山羊、綿羊、水牛、家牛、豬、鹿、駱駝和牦牛8個物種 的mtDNA序列配對。引物序列如下所示：
[0028] 通用下游引物（SEQIDNO:1) :AGCGGGTTGCTGGITTCACG、
[0029]通用上游引物（SEQIDNO:2)