專利名稱：一種改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制備方法
一種改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制備方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色譜固定相技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種新型改性環(huán)糊精手性雜 化整體色譜固定相的制備方法。
背景技術(shù)：
手性是生命過程的基本特征，構(gòu)成生命體的有機(jī)分子絕大多數(shù)都是手性分子。 人們使用的藥物絕大多數(shù)具有手性，被稱為手性藥物。研究手性化合物對于科學(xué) 研究以及人類健康有著重要意義。研究手性化合物首先要分別得到兩個對映異構(gòu) 體。手性化合物的分離和提純也成為人們關(guān)注的熱點課題。
近20年來，用色譜方法分離手性化合物取得了顯著進(jìn)展，已廣泛應(yīng)用于許多 領(lǐng)域，如藥物化學(xué)、不對稱合成和生物分析等，不僅可以測定光學(xué)純度，也可用于 大量制備光學(xué)異構(gòu)體。手性色譜技術(shù)的核心是設(shè)計和制備適用范圍廣的手性色譜 固定相。然而，飛速發(fā)展的制藥工業(yè)對手性藥物和中間體的分離的要求對新型手 性固定相的開發(fā)提出了更多要求。制備更多具有廣泛選擇性，穩(wěn)定性好，制備容 易的新型手性色譜固定相得到了人們廣泛的關(guān)注。
適用于手性分離的環(huán)糊精及其衍生物鍵合固定相是現(xiàn)在應(yīng)用較廣的手性色譜 固定相，它們大部分具有多種用途，樣品容量大，穩(wěn)定性高，分析速度快的優(yōu)點。環(huán) 糊精手性色譜固定相廣泛應(yīng)用于多種分離模式，對于許多類型分析物具有廣泛選 擇性。環(huán)糊精分子具有略呈錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在其空洞結(jié)構(gòu)中，外 側(cè)上端(較大開口端)由C2和C3的仲羥基構(gòu)成，下端(較小開口端)由C6的伯 羥基構(gòu)成，具有親水性，而空腔內(nèi)由于受到C-H鍵的屏蔽作用形成了疏水區(qū)。它 的疏水性空洞內(nèi)可嵌入各種有機(jī)化合物，形成包接復(fù)合物，并改變被包接物的物 理和化學(xué)性質(zhì)；可以在保持環(huán)糊精大環(huán)基本骨架不變情況下引入官能團(tuán)擴(kuò)大其應(yīng) 用范圍。這些優(yōu)勢使得環(huán)糊精類手性選擇器對多種旋光異構(gòu)體特別是手性氨基酸 都具有卓越分離能力，并在手性多肽和其他手性生物分子的分離中具有極大的潛 力。整體柱，又稱棒柱、連續(xù)床、原位柱、無塞柱，具有制備方法簡單、內(nèi)部結(jié) 構(gòu)均勻、重現(xiàn)性好、柱效高和可進(jìn)行快速分離等優(yōu)點，并在多種分離模式中獲得 了應(yīng)用，成功的分離了肽、蛋白質(zhì)、類固醇、芳烴、聚合物、低聚核苷酸、氨基 酸等多種物質(zhì)，其物理性質(zhì)以及內(nèi)部微化學(xué)環(huán)境也得到了廣泛的研究。與傳統(tǒng)填 充柱相比，整體柱能夠克服填充柱塞子的制作、高壓填充過程以及顆?？變?nèi)傳質(zhì) 速度慢等不足，具有重復(fù)性好、易于修飾、在寬pH范圍穩(wěn)定等優(yōu)點。整體柱通 常分為聚合物整體柱和硅膠整體柱兩類，聚合物整體柱在有機(jī)溶劑中的溶脹會導(dǎo) 致孔結(jié)構(gòu)的變化，影響柱效和分離效果。硅膠整體柱機(jī)械強(qiáng)度理想，在孔結(jié)構(gòu)控 制方面有一定優(yōu)勢，但是在多孔內(nèi)壁引入功能團(tuán)進(jìn)行改性非常困難，在干燥和熱 處理過程中柱床極易收縮和斷裂，限制了其應(yīng)用。有機(jī)-無機(jī)雜化材料是材料領(lǐng)域 的研究熱點，采用溶膠-凝膠法，可以在溫和的條件下制備有機(jī)-無機(jī)雜化材料。 在無機(jī)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中引入有機(jī)部分，有機(jī)官能團(tuán)均勻分布于骨架與孔壁，柔韌性好 的有機(jī)基團(tuán)提高了材料的機(jī)械強(qiáng)度水熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，材料的表面性質(zhì)也
可以通過反應(yīng)單體的有機(jī)基團(tuán)進(jìn)行控制調(diào)節(jié)。有機(jī)基團(tuán)通過穩(wěn)定的Si-C鍵共價連 接在硅膠基質(zhì)上。作為分離材料，雜化材料能夠結(jié)合硅膠和聚合物基質(zhì)材料的優(yōu) 勢避免其不足。這種雜化硅膠材料可用于制備CEC整體固定相，反應(yīng)物中加入含 官能團(tuán)的單體，不需要再對基質(zhì)進(jìn)一步的衍生，從而提高制備重現(xiàn)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型改性環(huán)糊精手性雜化 整體色譜固定相的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制備方法，具體步驟為， 一、色譜柱的預(yù)處理
(1)毛細(xì)管的預(yù)處理 將毛細(xì)管柱依次用稀酸、稀堿沖洗10 60分鐘，用水洗至中性；取氫氟酸充 入毛細(xì)管，兩端封口后靜置l 2h，用水洗至中性，氮氣或空氣吹干備用； 所述的毛細(xì)管柱為石英基質(zhì)，內(nèi)徑為1微米 1毫米；
所述的稀酸選自鹽酸，硫酸或者硝酸中的一種，優(yōu)選為鹽酸；其中，鹽酸濃 度為0. lmol/L;硫酸濃度為0. lmol/L;硝酸濃度為0. lmol/L;
所述的稀堿選自氫氧化鈉溶液或者氫氧化鉀溶液中的一種，氫氧化鈉溶液濃度為lmol/L;氫氧化鉀溶液濃度為lmol/L;
所述的氫氟酸濃度為10 20%;
(2)不銹鋼柱的預(yù)處理 不銹鋼柱管用熱NaOH水溶液抽洗4 5次，以除去管內(nèi)壁的油漬和污物，用 水沖洗至中性，最后用丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑沖洗2 3次，烘干備用； 所述的NaOH水溶液濃度為50g / L 100g / L， 溫度為40 70°C;
二、 整體固定相基質(zhì)的制備
將四乙氧基硅烷(TE0S)，帶有機(jī)官能團(tuán)的硅垸化試劑，溶劑，超分子模板混 合均勻，其中，帶有機(jī)官能團(tuán)的硅垸化試劑與溶劑摩爾比是1:4 1:8，超聲脫氣 后，充入預(yù)先處理過的不銹鋼柱管或毛細(xì)管中，兩端封口，在20 4(TC溫度下反 應(yīng)；反應(yīng)完成后，依次用乙醇、水洗去表面活性劑、殘余的反應(yīng)試劑以及小分子 聚合物；
所述的帶有機(jī)官能團(tuán)的硅烷化試劑選自帶有氨基、環(huán)氧基、醛基、異氰酸酯 基硅垸化試劑中的一種，其濃度根據(jù)硅垸化試劑的種類不同調(diào)整；
所述的溶劑選自甲醇、乙醇、水中的一種或兩種，其含量根據(jù)需要制備的整 體基質(zhì)的孔隙率調(diào)整；
所述的帶有機(jī)官能團(tuán)的硅垸化試劑與溶劑摩爾比根據(jù)采用的帶有機(jī)官能團(tuán)的 硅垸化試劑的種類決定，范圍為1:4 1:8;
所述的表面活性劑選自陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或非離子表面 活性劑中的一種，其種類根據(jù)有機(jī)官能團(tuán)的硅烷化試劑種類選擇，所用用量根據(jù) 需要制備的整體基質(zhì)的孔徑大小調(diào)整；
所述反應(yīng)溫度為20 40°C，反應(yīng)時間為12 24h;
三、 手性選擇器的引入 (1)直接化學(xué)修飾
將改性環(huán)糊精溶于緩沖溶液中，溶液緩慢流過合成好的有機(jī)-無機(jī)雜化整體 柱，在20 6(TC溫度下，反應(yīng)完成后用過量的水沖洗，將未完全反應(yīng)得環(huán)糊精和 溶劑洗出柱外，得到整體色譜固定相；圖1為天冬氨酸-e-C D直接化學(xué)修飾帶 有環(huán)氧基團(tuán)的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱；
改性環(huán)糊精為在保持環(huán)糊精大環(huán)基本骨架不變情況下引人各種官能團(tuán)，所得 到具有不同性質(zhì)或功能的產(chǎn)物，如帶有氨基酸、氨基、羰基、醛基等反應(yīng)性基團(tuán) 的環(huán)糊精衍生物；其濃度根據(jù)該種改性環(huán)糊精的溶解度調(diào)整；所述的緩沖溶液為具有一定pH值和緩沖能力的NaOH溶液或者Na2C03溶液， 緩沖溶液的pH與濃度根據(jù)改性環(huán)糊精的種類調(diào)整； 所述的反應(yīng)溫度為20 6(TC， 12 24h; (2)間接鍵合
控制改變間隔臂的種類和長度克服環(huán)糊精龐大且具有較復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 的空間阻礙作用，得到具有不同微化學(xué)環(huán)境的手性固定相；
間隔臂可先與改性環(huán)糊精結(jié)合再接枝到有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)上去，也可以 先與有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)的相應(yīng)官能團(tuán)反應(yīng)再將環(huán)糊精偶聯(lián)到有機(jī)-無機(jī)雜化 整體基質(zhì)上去；圖2所示為采用戊二醛作為間隔臂將改性環(huán)糊精對帶有環(huán)氧基團(tuán) 或氨基的有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)進(jìn)行間接表面化學(xué)修飾；多種異氰酸酯，帶不同 官能團(tuán)的三乙氧基硅垸及琥珀酰亞胺碳酸鹽，戊二醛等均可作為間隔臂；
具體步驟為
將作為間隔臂的化合物溶于緩沖溶液中，上述溶液緩慢流過合成好的有機(jī)-
無機(jī)雜化整體基質(zhì)，在20 6(TC溫度下，反應(yīng)完成后用過量的水沖洗，將未完全 反應(yīng)得間隔臂洗出柱外；充入改性e-CD溶液，在20 60。C溫度下反應(yīng)，反應(yīng)完 成后過量的水清洗除去未反應(yīng)物質(zhì)；
所述的間隔臂為多種異氰酸酯，帶不同官能團(tuán)的三乙氧基硅垸及琥珀酰亞胺 碳酸鹽，戊二醛等能分別與有機(jī)無機(jī)雜化整體材料及改性環(huán)糊精所帶活性官能團(tuán) 反應(yīng)的化合物；其濃度根據(jù)其溶解度和反應(yīng)活性調(diào)整；
所述的改性環(huán)糊精為在保持環(huán)糊精大環(huán)基本骨架不變情況下引人各種官能 團(tuán)，所得到具有不同性質(zhì)或功能的產(chǎn)物，如帶有氨基酸、氨基、羰基、醛基等反 應(yīng)性基團(tuán)的環(huán)糊精衍生物；其濃度根據(jù)該種改性環(huán)糊精的溶解度調(diào)整；
所述的緩沖溶液為具有一定pH值和緩沖能力的NaOH溶液或者Na2C03溶液等， 緩沖溶液的PH與濃度根據(jù)反應(yīng)物的種類調(diào)整；
所述反應(yīng)溫度為20 60°C， 12 24h;
本發(fā)明制備的手性整體柱的評價
將所制備的不銹鋼色譜柱或毛細(xì)管柱安裝到相應(yīng)的色譜儀器上，通入適當(dāng)流 動相，采用多種手性樣品對所制備的固定相的手性分離能力進(jìn)行評價；
所述流動相為磷酸鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液、醋酸鹽緩沖溶液等鹽溶液 與甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑的混合物，其混合比例根據(jù)不同有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì) 及改性環(huán)糊精種類調(diào)整；所述手性樣品為手性氨基酸、手性藥物、手性多肽等多種不同性質(zhì)手性化合物。
本發(fā)明采用改性環(huán)糊精作為手性選擇器，利用整體色譜柱易于進(jìn)行表面修飾 和制備重復(fù)性好的特點，結(jié)合自組裝和表面化學(xué)修飾的方法，根據(jù)分離需要調(diào)整 孔徑和孔分布與環(huán)糊精分子匹配，以此進(jìn)一步可以控制主客體分子的特異物理作 用，制備環(huán)糊精整體手性色譜固定相；研究其對于不同類型手性化合物選擇性及 其內(nèi)在手性識別機(jī)制，將制備的整體手性色譜固定相用HPLC，毛細(xì)管電色譜等多 種分離方式對手性氨基酸，手性多肽及其他手性生物分子進(jìn)行分離。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是-
(1) 將改性環(huán)糊精手性選擇器與原位聚合有機(jī)-無機(jī)雜化整體色譜柱相結(jié)合 制備新型手性色譜固定相，在方法上有較強(qiáng)的創(chuàng)新性；
(2) 本發(fā)明充分利用改性環(huán)糊精對手性分子的手性選擇性，應(yīng)用范圍更廣泛；
(3) 本發(fā)明與傳統(tǒng)的手性分離柱相比，手性雜化整體色譜柱更加穩(wěn)定、高效、 結(jié)構(gòu)均勻，制備方法更靈活，重復(fù)性好；
(4) 本發(fā)明結(jié)合帶有不同官能團(tuán)的原位聚合有機(jī)-無機(jī)雜化整體材料對孔徑 和表面微環(huán)境的精確控制，對研究不同結(jié)構(gòu)基質(zhì)的整體手性固定相的分離機(jī)理具 有重要意義。


圖1天冬氨酸-e-CD直接化學(xué)修飾帶有環(huán)氧基團(tuán)的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱；
圖2間接化學(xué)修飾化學(xué)合成路線圖3天冬氨酸改性環(huán)糊精鍵合整體柱分離DL-苯丙氨酸；
圖4氨基改性環(huán)糊精鍵合環(huán)氧基整體柱分離DL-Trp。
具體實施方式
以下提供本發(fā)明一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制備方法的具體實施方式
。
實施例1
將0. 0900g四乙氧基硅垸(TE0S)， 0. 1300g 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷 (APTES)， 0. 1700g乙醇，0. 0314g水，0. 0072g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)混合均勻，超聲脫氣后，充入預(yù)先處理過的毛細(xì)管中，兩端封口，常溫下反應(yīng)ioh。依次用乙醇，水洗去表面活性劑、殘余的反應(yīng)試劑以及小分子聚合物，得到整
體色譜固定相。將10%戊二醛溶液(乙醇/水=50/50)緩慢流過帶氨基丙基有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體柱柱體，反應(yīng)12h后水清洗；充入asp- e -CD溶液(乙醇/水=50/50， 0.03g/ml)，常溫反應(yīng)12h后水清洗；2。/。NaBH4磷酸鹽緩沖溶液(pH8.2)反應(yīng)2h后過量水清洗。圖3為天冬氨酸改性環(huán)糊精鍵合整體柱分離DL-苯丙氨酸。
實施例2
180 y L甲醇和25 u L 0. 1 M HC1混合均勻后，加入94 u L四乙氧基硅烷(TEOS)，68nL環(huán)氧基三乙氧基硅垸(ETES)， 30uL十二胺的甲醇溶液(0. Olg/100 u L)，混合均勻后，充入預(yù)先處理過的毛細(xì)管中，兩端封口，常溫下放置12h，然后于4(TC干燥48h。最后用無水乙醇沖洗除去十二胺。將適量改性P-CD溶于O. 1MNa2C03， pH為10.5緩沖溶液(NH2-0 -CD 0. lg/ml)緩慢流過柱體，70。C反應(yīng)16h，反應(yīng)完成后用過量的水沖洗。圖4為氨基改性環(huán)糊精鍵合環(huán)氧基整體柱分離DL-Trp。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制備方法，其特征在于，具體步驟為(1)直接化學(xué)修飾將改性環(huán)糊精溶于緩沖溶液中，溶液緩慢流過合成好的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱，在20～60℃溫度下，反應(yīng)時間為12～24h，反應(yīng)完成后用水沖洗，將未完全反應(yīng)的環(huán)糊精和溶劑洗出柱外，得到整體色譜固定相；(2)間接鍵合間隔臂先與改性環(huán)糊精結(jié)合再接枝到有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)上去或者先與有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)的相應(yīng)官能團(tuán)反應(yīng)再將環(huán)糊精偶聯(lián)到有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)上去；得到具有不同微化學(xué)環(huán)境的整體色譜固定相。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制 備方法，其特征在于，在所述的步驟(1)中，所述的緩沖溶液為NaOH溶液或者 Na2C03溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制 備方法，其特征在于，在所述的步驟(1)中，所述的間隔臂選自多種異氰酸酯，帶不同官能團(tuán)的三乙氧基硅垸及琥珀酰亞胺碳酸鹽或者戊二醛中的一種。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制 備方法，其特征在于，在所述的步驟(2)中，所述的間接鍵合，采用間隔臂將改 性環(huán)糊精對帶有氨基、環(huán)氧基、醛基、或異氰酸酯基的有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)進(jìn) 行間接表面化學(xué)修飾；將作為間隔臂的化合物溶于緩沖溶液中，上述溶液緩慢流 過合成好的有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)，在20 6(TC溫度下，反應(yīng)完成后用過量的 水沖洗，將未完全反應(yīng)的間隔臂洗出柱外；充入改性e-CD溶液，在20 6(TC溫 度下反應(yīng)，反應(yīng)時間為12 24h，反應(yīng)完成后過量的水清洗除去未反應(yīng)物質(zhì)，得 到整體色譜固定相。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制 備方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為NaOH溶液或者Na2C03溶液。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相在手 性化合物分離中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型改性環(huán)糊精手性雜化整體色譜固定相的制備方法，具體步驟為(1)直接化學(xué)修飾將改性環(huán)糊精溶于緩沖溶液中，溶液緩慢流過合成好的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱，在20～60℃溫度下，反應(yīng)時間為12～24h，反應(yīng)完成后用水沖洗，將未完全反應(yīng)得環(huán)糊精和溶劑洗出柱外，得到整體色譜固定相；(2)間接鍵合間隔臂先與改性環(huán)糊精結(jié)合再接枝到有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)上去或者先與有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)的相應(yīng)官能團(tuán)反應(yīng)再將環(huán)糊精偶聯(lián)到有機(jī)-無機(jī)雜化整體基質(zhì)上去；得到具有不同微化學(xué)環(huán)境的整體色譜固定相。本發(fā)明的優(yōu)點性能更加穩(wěn)定、高效，結(jié)構(gòu)均勻，制備方法更靈活，重復(fù)性好；應(yīng)用范圍更廣泛。
文檔編號B01J20/30GK101537345SQ20091004808
公開日2009年9月23日 申請日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者張凌怡, 張維冰 申請人:蘇州匯通色譜分離純化有限公司