本發(fā)明屬于生物降解領(lǐng)域，具體地說，涉及一種采用金屬離子強(qiáng)化嗜熱溶胞菌用于抗生素菌渣減量化的方法。

背景技術(shù)：

抗生素在人類的生存和發(fā)展以及畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大的作用。到目前為止，抗生素在其應(yīng)用領(lǐng)域依然是無法被其他物質(zhì)所取代的。抗生素菌渣是抗生素生產(chǎn)過程的必然產(chǎn)物。這些菌渣因含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸，2008年前一直被采用干燥加工等技術(shù)處理后或作為飼料、飼料添加劑，或作為肥料、生產(chǎn)復(fù)合肥的原料被進(jìn)行綜合利用。但因?yàn)榭股鼐锌股貧埩糨^高，如頭孢菌素C 在菌渣中的殘留約2 ～ 2. 5mg/g ，青霉素在菌渣中的殘留約1～2mg/g，紅霉素在菌渣中的殘留約0. 2～ 0.9mg/g ，土霉素在菌渣中的殘留約0. 5 ~ 2. l mg/g，四環(huán)素在菌渣中的殘留約0. 5 ~ 2mg/g這些殘留物最終都會通過食物鏈進(jìn)入動物體內(nèi)和人體內(nèi)。長期攝入含有氨基糖苷類抗生素殘留的食品會導(dǎo)致腎毒性和耳毒性；長期攝入含有頭孢類青霉素類抗生素殘留的食品導(dǎo)致哮喘、紫斑；另外它會使病原菌耐藥性增加，從而帶來預(yù)防與治療某些人類疾病和牲畜家禽疾病的困難，最后導(dǎo)致無藥可治；而將它們作肥料使用會造成土壤中的微生物生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重失調(diào)，土壤肥力下降，加速石漠化沙漠化；同時影響我國畜產(chǎn)品的出口貿(mào)易。

2008年后，國家將抗生素菌渣列為危險廢物，按危險廢物處置只能焚燒。我國己經(jīng)成為全球最大的抗生素原料藥生產(chǎn)國和出口國，原料藥產(chǎn)量己占全球總產(chǎn)量的80%，其中出口占到全世界原料藥市場的70%以上。2012 年全國生產(chǎn)抗生素約14 萬噸，其菌渣超過150萬噸。菌渣的焚燒成本己成為抗生素工業(yè)生存和發(fā)展的瓶頸。

對抗生素菌渣的處理，一直都在尋求更妥善的處置途徑。許多科研機(jī)構(gòu)及制藥企業(yè)開展了抗生素菌渣無害化處置和不同用途的研究。環(huán)境保護(hù)部門也非常重視和鼓勵抗生素菌渣處置等新技術(shù)的開發(fā)。例如，比較成功的有1) 藥渣炭化處置；2) 生物質(zhì)能熱電聯(lián)供技術(shù)，但是，有關(guān)微生物降解領(lǐng)域的研究還很少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種嗜熱微生物復(fù)合菌劑處理抗生素菌渣的方法，特別是一種采用金屬離子強(qiáng)化嗜熱溶胞菌用于抗生素菌渣減量化的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種采用金屬離子強(qiáng)化嗜熱溶胞菌用于抗生素菌渣減量化的方法，包括以下步驟：

（1）嗜熱溶胞菌活化

以液體培養(yǎng)基為試驗(yàn)活化嗜熱溶胞菌所用的培養(yǎng)基，取嗜熱溶胞菌按體積比6-12%接種于液體培養(yǎng)基中，置于55-65℃、110-130 r/min條件下的恒溫?fù)u床中恒溫培養(yǎng)66-80 h，將菌液取出后稀釋100-1000000倍，得稀釋液，在無菌條件下將稀釋液滴于固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行平板涂布分離，將涂布后的平板倒置于55-65℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20-28h，微生物在固體培養(yǎng)基上會形成單個菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，在固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，得到單菌，將分離后得到的單菌菌株在2-6℃冰箱中保存，備用；

（2）金屬離子強(qiáng)化嗜熱溶胞菌對菌渣減量化處理

將步驟（1）中冷藏的單菌接種到液體培養(yǎng)基中活化20-28 h得嗜熱溶胞菌菌液，在離心管中加入抗生素菌渣后，加入體積比為6-12%的OD_600nm為0.6-0.8的嗜熱溶胞菌菌液，加入金屬離子溶液，將有機(jī)負(fù)荷和pH值分別調(diào)節(jié)至0.8-1.2 kgCOD/(m³·d)和6.8-7.2，然后將其均置于溫度55-65℃，轉(zhuǎn)速110-130 r/min恒溫?fù)u床中進(jìn)行強(qiáng)化減量化處理，處理時間為1-48h。

進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基組成為：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0，121℃條件下滅菌20 min；固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量比為2%的瓊脂。

進(jìn)一步地，所述金屬離子為鉀離子、鈉離子或鈣離子。所述金屬離子的濃度為100-400μmol·L^-1。

進(jìn)一步地，所述抗生素菌渣包括但不限于頭孢菌素菌渣、土霉素菌渣、紅霉素菌渣和青霉素菌渣。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中嗜熱溶胞菌按體積比10%接種于液體培養(yǎng)基中，置于60℃、120 r/min條件下的恒溫?fù)u床中恒溫培養(yǎng)72 h。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中稀釋液在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度為60℃，培養(yǎng)時間為24 h。

進(jìn)一步地，步驟（2）中有機(jī)負(fù)荷和pH值分別調(diào)節(jié)至1.0 kgCOD/(m³·d)和7.0，將其均置于溫度60℃，轉(zhuǎn)速120 r/min恒溫?fù)u床中進(jìn)行強(qiáng)化減量化處理。

其中，嗜熱溶胞菌是從上海麥森醫(yī)療科技有限公司購買的商業(yè)菌種。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明提供一種在抗生素菌渣中加入金屬離子強(qiáng)化嗜熱溶胞菌，使抗生素菌渣減量化，并使菌渣中的抗生素殘留降低的方法。本發(fā)明采用金屬離子強(qiáng)化的嗜熱溶胞菌作為抗生素菌渣處理菌株，其在有氧發(fā)酵的條件下使抗生素菌渣減量40%以上，菌渣中的抗生素殘留去除率最高達(dá)90%以上。本方法的優(yōu)點(diǎn)是抗生素菌渣減量化程度高，殘留去除率高。此法簡單，易于操作，占地面積小，投資成本低，并且不會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和環(huán)保效益。

附圖說明

圖1 不同濃度金屬離子對SS的影響（a: Na⁺; b: K⁺; c: Ca²⁺）；

圖2 不同濃度金屬離子對SCOD的影響（a: Na⁺; b: K⁺; c: Ca²⁺）；

圖3 不同濃度金屬離子對NH₄⁺-N的影響（a: Na⁺; b: K⁺; c: Ca²⁺）。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。下面以青霉素菌渣為例進(jìn)行試驗(yàn)，但并不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的方法用于處理其它抗生素菌渣時具有相近的減量化效果，這里不一一贅述。

實(shí)施例1 嗜熱溶胞菌的活化

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為試驗(yàn)活化嗜熱溶胞菌所用的培養(yǎng)基，其液體培養(yǎng)基具體組成成分如下：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH=7.0，121℃條件下滅菌20 min。固體培養(yǎng)基即為液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

取嗜熱溶胞菌按10%（v/v）接種于液體培養(yǎng)基中，置于60℃、120r/min條件下的恒溫?fù)u床中恒溫培養(yǎng)72h。將菌液取出后，采用10倍梯度稀釋法進(jìn)行稀釋，制得10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的稀釋液，在無菌條件下將各個濃度的0.1 mL稀釋液滴于固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行平板涂布分離，將接種好的平板倒置于60℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。稀釋10^-4后進(jìn)行平板涂布的菌株生長情況。嗜熱溶胞菌在固體培養(yǎng)基上會呈現(xiàn)出不同的群體形態(tài)特征，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單菌，在固體培養(yǎng)基上劃線分離，根據(jù)其形態(tài)特征的不同分離純化，得到單菌。將分離后得到的菌株在4℃冰箱中保存，以便后續(xù)使用。其中嗜熱溶胞菌是從上海麥森醫(yī)療科技有限公司購買的商業(yè)菌種。

實(shí)施例2 青霉素菌渣的處理

在50 mL離心管中加入青霉素菌渣后，加入10%（v/v）的OD_600nm = 0.8的嗜熱菌菌液，加入金屬離子溶液，使其濃度分別在100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1和400 μmol·L^-1并設(shè)置空白對照組，有機(jī)負(fù)荷和pH值分別調(diào)節(jié)至1.0 kgCOD/(m³·d)和7.0左右。然后，將其均置于溫度60℃，轉(zhuǎn)速120 r/min恒溫?fù)u床中進(jìn)行強(qiáng)化減量化試驗(yàn)，每一濃度金屬離子條件下設(shè)置2組平行試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中蒸發(fā)掉的水分用蒸餾水補(bǔ)足至初始反應(yīng)容積，在1 h、2 h、4 h、16 h、24 h、38 h和46 h從搖床中取出離心管，測定SS、SCOD和NH₄⁺-N濃度。

（1）SS的去除率的變化

Na⁺、K⁺和Ca²⁺濃度分別為100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1和400 μmol·L^-1和未加入金屬離子條件下嗜熱溶胞菌對青霉素菌渣減量化過程中SS的變化情況見圖1。

由圖1可知，金屬離子在一定濃度范圍內(nèi)，3種金屬離子在嗜熱溶胞菌好氧消化青霉素菌渣減量化過程均具有促進(jìn)作用。Na⁺的濃度在200 μmol·L^-1時對青霉素菌渣有較好的減量效果，48 h后，菌渣的去除率達(dá)到90.96%，說明菌渣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞外聚合物遭到破壞，嗜熱溶胞菌釋放的主要為蛋白酶和淀粉酶的胞外酶在Na⁺的促進(jìn)下強(qiáng)化了菌渣的減量化效果，Na⁺在100 μmol·L^-1 和400 μmol·L^-1濃度下菌渣的去除率分別達(dá)到66.20%和65.12%，且在反應(yīng)前6 h菌渣的去除效果明顯。過低或過高濃度的金屬離子雖對減量化效果有一定的促進(jìn)作用，但作用效果不明顯。K⁺在ATP水解，磷的傳遞過程中起著重要作用，K⁺濃度為200 μmol·L^{-1時菌渣的}去除率達(dá)82.32%，隨著反應(yīng)進(jìn)行，菌渣中的固體物質(zhì)不斷溶解，SS逐漸減小。K⁺濃度為100 μmol·L^-1和400 μmol·L^-1時SS也下降明顯，菌渣的去除率分別達(dá)到40.27%和47.73%，說明K⁺在適宜的濃度范圍內(nèi)對青霉素菌渣的減量效果也有促進(jìn)作用。Ca²⁺活化中心蛋白酶，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長與分泌， Ca²⁺在改變酶分子維持酶活性中心的穩(wěn)定性和高活性中起著重要作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，Ca²⁺濃度為100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1和400 μmol·L^{-1時菌渣的}去除率分別為46.09%、78.66%和64.38%，減量效果相對明顯，對嗜熱溶胞菌對青霉素菌渣的減量化起到了促進(jìn)作用，且達(dá)到相同減量效果的時間較沒有加入金屬離子的時間大為降低。

（2）SCOD的變化

SCOD的變化趨勢可以反映菌渣溶解的程度，接種嗜熱溶胞菌后，隨著嗜熱菌胞外酶的釋放，水解反應(yīng)的進(jìn)行，菌膠團(tuán)和胞外聚合物水解，細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)物得以釋放，使SCOD得以升高，各種金屬離子對SCOD的影響如圖2所示。

從圖2中可以看出，K⁺濃度為200 μmol·L^-1時SCOD增長迅速，在4 h左右達(dá)到最大值，此時胞內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等由固相轉(zhuǎn)移到液相，SCOD值出現(xiàn)明顯的升高，比空白試驗(yàn)提前20 h達(dá)到最大值，且最大值略高于空白試驗(yàn)，在達(dá)到相同溶胞率時大大縮短了反應(yīng)時間。K⁺濃度為100 μmol·L^-1條件下，反應(yīng)前期SCOD增長緩慢，16 h后開始大幅增長，24 h時達(dá)到最大值，最高可達(dá)3700 mg/L，但仍低于K⁺濃度為200 μmol·L^-1時的SCOD濃度，之后SCOD開始明顯下降。K⁺濃度為400 μmol·L^-1條件下，反應(yīng)前期SCOD增長迅速，在16 h左右達(dá)到最大值，16 h后SCOD含量下降，顯然過高或過低濃度的K⁺均未對嗜熱溶胞菌的溶胞效果起到明顯的促進(jìn)作用。Na⁺濃度為200 μmol·L^-1時，SCOD在2 h時迅速達(dá)到最大，最高可達(dá)3 943mg/L，相比空白提高了32.36%，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，SCOD開始下降，可能是部分有機(jī)物揮發(fā)，以及嗜熱溶胞菌可能利用溶解的有機(jī)質(zhì)作為碳源生長。而當(dāng)加入的金屬離子為Ca²⁺時，SCOD濃度的變化并不明顯，對嗜熱溶胞菌的溶胞效果未起到明顯的促進(jìn)作用。

（3）NH₄⁺-N的濃度的變化

Na⁺、K⁺和Ca²⁺濃度分別為100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1和400 μmol·L^-1和未加入金屬離子條件下嗜熱溶胞菌好氧消化青霉素菌渣過程中NH₄⁺-N的變化情況見圖3。

在水解過程中NH₄⁺-N的濃度會影響后續(xù)厭氧消化實(shí)驗(yàn)的性能和所產(chǎn)生的甲烷的含量，菌渣中NH₄⁺-N含量與溶胞作用相關(guān)，細(xì)胞壁破裂釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì)，通常6.25 g的蛋白質(zhì)中含有約1 g的氮，這些氮主要分布在懸浮固體中，蛋白質(zhì)在高溫消化時會不斷溶出，溶出率不斷增高，菌渣中的蛋白質(zhì)在嗜熱溶胞菌的作用下溶解，同時菌渣在高溫條件下，發(fā)生水解作用，生成多肽、二肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，氨基酸進(jìn)一步水解成有機(jī)酸、氨及CO₂，并且高溫能促進(jìn)NH₄⁺-N轉(zhuǎn)為氨氣，揮發(fā)出去，從而溶液中NH₄⁺-N的含量經(jīng)歷一個先升高后降低的過程。在添加金屬離子后，NH₄⁺-N濃度的變化趨勢如圖3所示，高濃度的Na⁺在4 h時NH₄⁺-N濃度比空白提高15.68%，比空白試驗(yàn)提前了20 h達(dá)到最大值。同樣在4 h時，K⁺濃度在200 μmol·L^-1條件下NH₄⁺-N濃度達(dá)到102.04 mg/L，之后NH₄⁺-N的濃度逐漸趨于平緩最后下降，而過高或過低濃度的K⁺存在的條件下，NH₄⁺-N濃度的變化趨勢也為先升高后降低，但變化趨勢較小。而加入Ca²⁺后，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，NH₄⁺-N濃度一直降低。