本發(fā)明涉及近紅外熒光染料領域，具體涉及一種七甲川菁熒光染料近紅外熒光染料，可進行腫瘤靶向光動力學治療。本發(fā)明還公開了其合成方法，以及在腫瘤精準診斷和治療中的應用。

背景技術：

目前，癌癥已成為危害我國居民健康的最大的罪魁禍首，嚴重威脅著人類的健康。臨床上用于治療腫瘤的方法有外科手術法、化學藥物治療、放射性治療等。其中，光熱光動治療技術是一種新興的無副作用的治療技術，它是利用一類具有良好光熱轉換效率的光熱試劑在近紅外光的照射下，將一部分能量以熱量形式釋放，并產生活性氧分子。光熱治療與傳統(tǒng)治療方法相比，具有以下優(yōu)勢作為一種非侵入式的治療手段，毒、副作用低，簡便易行，患者幾乎無不適感，無風險，適用于各種人群。光熱光動治療既可以作為主要治療方式，也可以作為協(xié)同治療方式，在治療膀胱、食道、頭頸部、腦部、肺部、前列腺、腹腔內腔、胸腺和皮膚的癌癥或惡性腫瘤方面得到運用。

近紅外熒光探針被賦予了無損在位連續(xù)監(jiān)測生物體內各參數(shù)的潛能，也在生物醫(yī)學檢測領域蘊藏著巨大的應用前景，必將在體內特異性分子的識別，尤其是腫瘤特異性分子的診斷中發(fā)揮重要的作用。

吲哚菁綠是是一種具有近紅外特征吸收峰的三碳花菁染料，吸收范圍600-850nm，分子量為775道爾頓，它具有摩爾消光系數(shù)高、熒光量子產率和光熱轉換效率高，熔點低以及最大吸收波長可調諧范圍大等特點，是美國食品藥物監(jiān)督局(fda)唯一批準用于臨床的近紅外造影劑。具有光熱，光聲和光動力響應，在光照環(huán)境下會加速分解，icg在水溶液中的不穩(wěn)定性及在血漿中的快速清除率限制了它在熒光成像、目標組織定位方面的應用。吲哚菁綠具有濃度依賴的聚集，較差的穩(wěn)定性，非特異性的蛋白結合以及缺少靶向，因此在生物體內會快速降解，限制了其在腫瘤治療方面的進一步應用。

事實上利用熒光染料進行腫瘤的檢測和診斷還面臨一系列的問題，如常用的腫瘤成像是用與腫瘤特異性的靶向片斷化學結合，形成特異性菁染料標記復合物，這些靶向片斷包括代謝底物，還有一些膜表面分子等。但這些方法用于腫瘤成像均有其局限性，因為靶向片段只能檢測到部分特異性腫瘤細胞，這些細胞具有明確的表面分子特性，僅是多樣性腫瘤細胞中的少部分。而且化學結合可能會改變靶分子的特異性和親合力。因此有必要發(fā)展簡單且可直接用于非侵入性腫瘤成像的新型染料。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了能有效靶向腫瘤細胞的近紅外染料，這種染料能大量蓄積在腫瘤細胞，從而起到活體診斷功能，最終通過光照達到殺傷腫瘤細胞的效果。這種染料可制備成光學療法的抗癌制劑。

本發(fā)明的目的在于提供新的具有藥用價值的式(i)的化合物，其光熱作用和光動力學均可殺傷癌細胞，可用于制備新型的抗癌制劑。

本發(fā)明的目的還在于提供具有式(i)的化合物的藥理作用方式，其結合小窩蛋白2，促進高表達腫瘤細胞的攝取。

本發(fā)明另一個目的在于提供一種含有式(i)的化合物作為有效成分的光學影像診斷制劑。

本發(fā)明合成了一種式(i)化合物：

結構式i的近紅外染料是吲哚菁綠的衍生物，因此，本發(fā)明的結構式i的近紅外染料其生物相容性及體內安全性與其它近紅外探針相比具有了明顯的優(yōu)勢。

本發(fā)明的結構式i化合物以下簡稱icg-03，它的最大吸收峰約在780nm，對應的最大熒光發(fā)射峰約為830nm。其紫外吸收光譜見圖3，熒光光譜見圖3。

由于icg-03近紅外染料帶兩個不同活性羧基，在活化后，可分別與帶氨基的生物活性分子反應，通過控制反應物配比可調節(jié)其標記比例，因而在探針設計中具有明顯的優(yōu)勢。icg-03可作為該類生物活性分子在生物體內代謝過程研究的示蹤劑，以及可作為腫瘤檢測和早期診斷的造影劑。

icg-03不溶于乙醚等非極性試劑，在水等強極性試劑中溶解度低，易溶于乙腈、甲醇等極性試劑中。含有羧基官能團，可與蛋白質和核酸等生物活性分子上的氨基發(fā)生縮合，進而可以對它們進行標記。此外，由于icg-03在700到900納米之間有強的近紅外熒光發(fā)射(熒光發(fā)射峰約為830nm)，并且此波段近紅外光能穿透深層組織。因此，標記有icg-03的蛋白質和核酸等生物活性分子可充當活體組織成像的探針。這些充分表明，icg-03在活體組織成像以及在位活體檢測等研究領域有著潛在的廣泛的應用前景。

本發(fā)明解決的問題在于提供一種具有腫瘤特異性靶向的近紅外熒光染料及其應用，這種染料能夠被腫瘤細胞自發(fā)吸收和累積，特異性聚集于腫瘤部位，具有了腫瘤特異性靶分子和成像的雙重功能，可用于臨床腫瘤檢測和診斷。

本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一種具有腫瘤特異性靶向的近紅外熒光染料，該近紅外熒光染料的化學結構式為i

所述的具有腫瘤特異性靶向的近紅外熒光染料在制備腫瘤診斷試劑中的應用。所述的腫瘤診斷試劑是能夠與腫瘤細胞特異性結合，并誘發(fā)熒光的腫瘤診斷試劑。所述的腫瘤診斷試劑是靶向內吞小窩蛋白2高表達的腫瘤細胞或腫瘤組織。所述的腫瘤診斷試劑是顯示腫瘤形成部位的診斷試劑。所述的腫瘤診斷試劑是用于在活體成像儀中對腫瘤細胞或組織顯示近紅外熒光的腫瘤診斷試劑。

本發(fā)明的化合物是腫瘤特異性靶向的近紅外熒光染料。盡管不希望受理論約束，發(fā)明人相信本發(fā)明化合物的抗癌作用是基于其光動力學和光熱效應。

藥物組合物：可以任何本文所述適應癥，包括抑制腦膠質瘤細胞、乳腺癌細胞增殖的治療有效量，任選地與藥學上可接受的添加劑、載體或賦形劑組合，來制備基于式i化合物，或其藥學上可接受的鹽或前藥，包括酯的藥物組合物。治療有效量可隨著要治療的感染或病況、其嚴重性、所應用的治療方案、所用藥劑的藥動學性質以及受治療的患者而改變。

本發(fā)明還包括藥物制劑，該制劑包含作為活性成分的式(i)化合物或其酯或前藥或藥學上可接受的載體。上述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，是指一種或幾種惰性的、非毒性的固體或液體填充物、稀釋劑，助劑等，它們不逆向與活性化合物或病人發(fā)生作用。

本發(fā)明組合物的劑型可以是片劑、膠囊、丸劑、栓劑、軟膠囊、口服液、混懸劑、注射液等藥劑學上常用的劑型?？诜盟幤湍z囊含有傳統(tǒng)的賦形劑如填充物、稀釋劑、潤滑劑、分散劑以及粘合劑。

本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域中熟知的方法進行制備。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：

本發(fā)明提供的具有腫瘤特異性靶向的近紅外熒光染料，為七甲川菁染料，自發(fā)熒光非常低。這種染料能夠被腫瘤細胞自發(fā)吸收和累積，特異性聚集于腫瘤部位，而不是正常細胞，從而成為腫瘤特異性靶分子成像。當荷瘤裸鼠注射icg-03結合成像可觀察到這種染料能夠被腫瘤組織特異性吸收，因此說明該染料具有成像和靶分子的雙重功能。

本發(fā)明提供的icg-03染料為基礎的近紅外活體成像技術克服了腫瘤細胞的異質性，可依據(jù)腫瘤細胞高表達的特點設計具有共性的特異性靶分子結合物，通過觀察染料與其它腫瘤細胞的特異性結合從而將近紅外活體成像技術應用于更多腫瘤的早期預警和快速診斷。

目前國內和國際上已開展的近紅外腫瘤成像研究主要采取的方法是將與腫瘤特異性的靶向片斷化學結合，形成特異性菁染料標記復合物，但均有其局限性，因為靶向片段只能檢測到具有特異性標志的腫瘤細胞，這些細胞具有明確的表面分子特性，僅是多樣性腫瘤細胞中的少部分。而本發(fā)明提供的icg-03染料為基礎的近紅外活體成像技術克服了腫瘤細胞的異質性，是具有廣譜特異性的腫瘤標志，能夠實現(xiàn)染料與更多腫瘤細胞特異性結合。

附圖簡要說明：

圖1七甲川菁熒光染料的質譜

圖2七甲川菁熒光染料的氫譜

圖3七甲川菁熒光染料的光譜性質

圖4七甲川菁熒光染料與icg的光穩(wěn)定性比較

圖5七甲川菁熒光染料與icg的體外成像和光熱性質比較

圖6七甲川菁熒光染料與icg的體內成像和光熱性質比較

圖7七甲川菁熒光染料光動力學特性a)u87細胞在不同狀態(tài)下光動力學檢測效果b)深色為凋亡細胞，淺色為正常細胞，在不同條件下的殺傷效果

圖8七甲川菁熒光染料的細胞增殖抑制試驗

圖9七甲川菁熒光染料的荷瘤小鼠的治療效果

圖10七甲川菁熒光染料的動物靶向性a)和細胞靶向性b)

圖11icg-03染料的合成過程

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。需要說明的是，下述實施例僅是用于說明，而并非用于限制本發(fā)明。本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的教導所做出的各種變化均應在本申請權利要求所要求的保護范圍之內。

實施例1

本發(fā)明化合物i的制備

1、將苯肼對磺酸(5g)加入到甲基異丙基酮的甲醇溶液中(8.55/15毫升)，加熱這種溶液到117℃，攪拌5h后，溶劑蒸發(fā)。再加入50毫升乙醚到油狀產物中，得到一個粉紅色的粉末，即(3)號化合物。然后，將棕紅色粉粉(6g)加氫氧化鈉(1.5克)溶液中，溶劑為甲醇(10毫升)和異丙醇(10毫升)，該溶液在82℃攪拌15分鐘后，冷卻至室溫，大量的(3)號化合物分離出來，用于下一步的純化。m/z＝261.27，核磁共振譜(500兆赫，氯仿)δ7.90(d，2h)7.49(s，h)2.10(s，3h)1.44(s，6h)

2、化合物3(6克)和1-(溴甲基)苯(4.77毫升)溶解在36毫升甲苯。將混合物攪拌在氮氣保護下回流5h，當混合物冷卻，除去溶劑并將固體濾掉，用甲苯洗滌，最后在高真空下干燥，得到(4)號化合物。m/z＝352.1，核磁共振譜(500兆赫，氯仿)δ9.30(s，h)7.98(s，h)7.80(s，h)7.23(d，5h)4.72(s，h)4.53(s，h)1.44(s，6h)。

3、包含三氯氧磷(17.5毫升)的20毫升二氯甲烷溶液逐滴加入到二甲基甲酰胺溶液中(20毫升)，二氯甲烷需冰浴下。30分鐘后，加入5克環(huán)己酮(化合物5)，混合物在80℃加熱回流攪拌3h，在冰水浴中，保持它過夜后產生黃色固體(6)號化合物。m/z＝172.61，核磁共振譜(500兆赫，氯仿)δ9.87(s，2h)3.53(s，h)2.48(d，4h)2.18(s，h)1.90(s，h)1.83(s，2h)1.73(s，h)。

4、化合物4(8.53克)，化合物6(2克)溶解在50毫升乙醇。將混合物攪拌，回流8h，冷卻后得到的粗粉(7)號化合物，再溶于乙醇。m/z＝840.38，核磁共振譜(500兆赫，氯仿)δ9.30(s，h)7.98(s，h)7.88(s，1h)7.80(s，h)7.34(s，h)7.28(s，5h)7.23(d，5h)7.02(s，h)6.45(s，h)6.09(s，h)5.45(s，h)5.25(d，2h)4.84(d，3h)2.60(s，4h)1.79(s，6h)1.46(d，8h)。

5、將3-巰基丙酸(219μl)添加到化合物7(1克)的二甲基甲酰胺溶液20毫升。在黑暗條件下，將三乙胺(350μl)逐滴加入到混合物中，攪拌24小時，加入300毫升乙醚后，icg-03即可得到，最后經柱層析純化。m/z＝910.06，核磁共振譜(500兆赫，氯仿)δ8.69(d，2h)7.82(s，2h)7.62(d，2h)7.35(m，12h)6.32(d，2h)5.50(s，4h)3.18(s，2h)2.89(s，3h)2.40(s，3h)1.75(s，13h)0.82(s，1h)。

實施例2

不同細胞系及人源荷瘤裸鼠模型對icg-03染料的吸收

將對數(shù)生長期的u87(腦膠質瘤細胞)、mcf7(乳腺癌細胞)、hepg2(人肝癌細胞)，a549(人肺癌細胞)，mda-mb-231(人乳腺癌細胞株)、panc1(人胰腺癌細胞株)和l02(人正常肝細胞)經過胰酶消化處理，將細胞分別轉接到激光共聚焦培養(yǎng)皿中，細胞密度約為3×10⁵個/cm²。之后將共聚焦培養(yǎng)皿置于恒溫細胞培養(yǎng)箱中(37℃，5％o2)培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，分別加入經過濾膜過濾的0.2mlicg-03溶液，孵育2小時。然后將細胞用冷的pbs溶液(ph7.4)洗滌兩次用于激光共聚焦顯微鏡的雙通道熒光成像。

在表觀上觀察腫瘤細胞內icg-03的熒光強度，進而反映出其腫瘤細胞靶向能力，從而比較icg-03對不同腫瘤細胞系的靶向能力大小。如圖10-b所示，孵育2h后，在u87、mda-mb-231、a549以及mcf-7細胞內可以觀察到icg-03的紅色熒光信號，且在u87中的信號強度最大；與之相比，在相同時間點，hepg2以及panc1細胞系內的icg-03熒光信號明顯低于上述腫瘤細胞，幾乎沒有信號輸出，其結果與下述體內腫瘤靶向性相符。

為了考察icg-03腫瘤的靶向能力，將通過無損在位近紅外熒光成像技術，實時檢測icg-03在u87(腦膠質瘤細胞)、mcf7(乳腺癌細胞)、hepg2(人肝癌細胞)，a549(人肺癌細胞)，mda-mb-231(人乳腺癌細胞株)、panc1cells(人胰腺癌細胞株)荷瘤鼠體內的動態(tài)分布。選用765nm波長的激光光源，作為激發(fā)光源照射小鼠全身，并用高靈敏度的近紅外電感耦合照相機獲到荷瘤小鼠體內的熒光信號，由于icg-03的最大發(fā)射波長約在820nm左右，所以選800nm的長通濾光片濾除其他散射光干擾，之后用計算機軟件捕獲成像的熒光圖片。用150μl氨基甲酸乙酯(20mg/ml)分別將u87(腦膠質瘤細胞)、mcf7(乳腺癌細胞)、hepg2(人肝癌細胞)，a549(人肺癌細胞)，mda-mb-231(人乳腺癌細胞株)、panc1cells(人胰腺癌細胞株)荷瘤鼠麻醉，固定于夾板上。給藥前預先采集荷瘤鼠的背景熒光圖。將200μlicg-03(0.5mg/ml)溶液通過尾靜脈注射到麻醉的荷瘤鼠體內，在給藥后不同時間點分別采集荷瘤小鼠的熒光成像圖。

為了進一步探究icg-03的靶向能力，本實例構建了六種小鼠腫瘤模型，均于腋下接種腫瘤細胞u87、mda-mb-231、a549、mcf-7、hepg2以及panc1，分別于尾靜脈注射相同濃度的icg-03溶液，通過小動物近紅外成像系統(tǒng)來觀察其在腫瘤部位的熒光強度，進而反應出其腫瘤靶向能力。如圖10-a所示，靜脈注射的icg-03探針2h后，小鼠全身均能檢測出較強的熒光信號；在注射12h后，u87、mda-mb-231、a549以及mcf-7荷瘤鼠的腫瘤部位的熒光信號達到最大值，而其他器官無明顯的熒光信號；在注射后24h時，腫瘤內仍能檢測到明顯的熒光信號；相比之下，hepg2以及panc1荷瘤鼠在注射后12h，腫瘤部位未能觀察到熒光信號。注射了icg-03的u87、mda-mb-231、a549以及mcf-7荷瘤鼠的t/n值在0～24h時內有較大的變化，且在12小時內達到最大值，其中腫瘤組織和周圍正常對照組織熒光信號比值可達～9.7(u87)，而通常的腫瘤部位與正常組織熒光信號比值達到3即可認為具有腫瘤主動靶向作用，顯示其具有重要潛在應用前景，而hepg2以及pane1荷瘤鼠的t/n值無明顯的變化。

實施例3

化合物的安全性試驗

為了考察藥物對正常組織的毒副作用，需要進行組織切片及病理學研究，6周齡的30大鼠，體重為200±10g，腹腔注射icg-03染料10mg/kg，四周后處死大鼠，肉眼觀察大鼠心、肝、脾、肺和腎有無變化，10％福爾馬林固定組織，切片做he染色。大鼠心、肝、脾、肺和腎有無明顯變化，組織病理與正常對照大鼠無顯著差別，該劑量約為小鼠成像檢測使用劑量的100倍，小鼠體重為20g，小鼠實驗劑量為0.1mg/kg，證明該劑量的安全性。結果表明，該染料對動物和細胞均沒有毒性，用于臨床腫瘤檢測和診斷顯示出良好的潛能。

實施例4

荷瘤裸鼠的光動力學和光熱治療

為了考察icg-03和icg的治療效果和毒副作用，將u87荷瘤裸鼠隨機分為5組(n＝10)，分別為生理鹽水對照組、激光照射對照組、非光照的icg-03(200μl，0.5mg/ml)、光照的icg-03(200μl，0.5mg/ml)和光照的icg(200μl，0.5mg/ml)，并每隔2天進行一次光照，對其進行治療。每只荷瘤裸鼠每兩天尾靜脈注射一次，每三天測量一次荷瘤裸鼠的體重并用游標卡尺測量荷瘤鼠腫瘤長度和寬度，治療周期為15天。

小鼠體重、腫瘤大小變化情況及存活率的計算公式如下：

腫瘤體積＝長度×(寬度)2×1/2；

存活率＝ns/nt×100％，ns和nt分別代表15天后每組小鼠的存活數(shù)量和小鼠總數(shù)。

在之前的實例中，已經驗證了icg-03的腫瘤靶向性、高效的協(xié)同pdt/ptt作用特性，以及在細胞水平的抗腫瘤療效。因此，在本部分實例中，將繼續(xù)探索icg-03的用于活體腫瘤治療的效果。由于icg-03可以自發(fā)的主動靶向聚集在體內的腫瘤部位，并且在近紅外的激光照射下，發(fā)出熒光信號。因此，可以應用腫瘤部位的熒光信號，來指導治療激光的照射部位，即靶向的腫瘤部位，用于光熱及光動治療，并提高光療治療的準確性。實驗選擇了皮下接種u87細胞的荷瘤裸鼠作為模型，隨機分為五個實驗組：生理鹽水組、laser組、icg-03組、icg-03&laser組及icg&laser組。在給藥的15天內，隔天給次藥，并且每三天記錄一次腫瘤的體積大小及小鼠的體重。在治療后15天內，生理鹽水對照組、僅光照組和icg-03無光照組腫瘤體積迅速增長，沒有表現(xiàn)出明顯腫瘤抑制作用；相對而言，icg&laser組則表現(xiàn)出的輕微的抑瘤作用，因為icg在光照的條件下，能產生一定的pdt/ptt效應，但是由于其光穩(wěn)定性較弱，因此不能實現(xiàn)很好的光療效果；而icg-03&laser組則表現(xiàn)出了突出的抗腫瘤效果，這是由于icg-03在尾靜脈注射后，在血液中分布，并由于主動靶向作用在腫瘤部位蓄積。當icg-03進入腫瘤細胞后，在808nm的激光的照射下，icg-03所產生的pdt/ptt效應定點在腫瘤內部發(fā)生作用，并且由于其較好的光穩(wěn)定性，表現(xiàn)出了更有效的光療效應，進而表現(xiàn)出更好的抑瘤作用。

治療期間荷瘤鼠存活率變化曲線能反映出小鼠的生存狀態(tài)。圖9-b表明，icg-03光照組小鼠存活率達到90％，相對于icg光照組60％的存活率以及僅光照組50％的存活率大大提高，而對照組小鼠及icg-03未光照組的存活率僅僅為30％。上述結果說明icg-03介導的pdt/ptt協(xié)同治療效果，可以顯著提高荷瘤鼠的存活質量，延長小鼠的存活時間。