專利名稱：一種熒光靶向納米材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術領域，具體涉及一種熒光靶向納米材料及其制備方法。
背景技術：
近年來，靶向投遞系統(tǒng)已經成為了治療和診斷癌癥的重要手段之一，它可以提高診斷試劑的靶向性，減少其在非靶部位的聚集。隨著腫瘤分子水平的不斷進展，在腫瘤細胞表面發(fā)現了一系列受體，它們與腫瘤生長增殖密切相關并在腫瘤組織過度表達，這些腫瘤特異性的受體為腫瘤治療提供了靶點。葉酸受體在多種腫瘤組織過度表達，而在正常組織處則呈低水平或不表達。葉酸(folic acid，FA)是一種小分子維生素，結構式如下圖，它可被還原為四氫葉酸，后者是一碳單位轉移酶的輔酶，參與一碳單位代謝和嘌呤、胸腺嘧啶的從頭合成。基體主動攝取葉酸的途徑有兩種第一種機制是通過低親和力的葉酸結合蛋白，直接將葉酸導入包漿；第二種機制是通過高親和力的特異性葉酸結合蛋白，即葉酸受體介導細胞內化，將葉酸攝入胞漿。與其他靶向分子如單克隆抗體相比，FA相對分子質量小、無免疫原性、價廉易得、穩(wěn)定性好、與藥物或載體之間的化學鍵合簡單易行。因此以葉酸為靶向分子構建遞藥系統(tǒng)已成為主動靶向治療腫瘤的研究熱點之一。研究表明可采用聚合物作為熒光靶向納米材料的載體，Kouichi Ohe等報道了用 ROMP聚合方法制備三嵌段共聚物，并將葉酸和吲哚菁綠偶聯至聚合物，實現對腫瘤細胞的熒光示蹤。但其制備方法復雜，并且無法有效弓I入活性端基以便進一步活化。CN 1919181A公開了一種以可降解聚酯和多氨基聚合物共聚，將靶向分子葉酸和異硫氰酸熒光素接枝到聚合物表面的熒光靶向納米膠束，穩(wěn)定性好，且以葉酸受體介導，可實現熒光素靶向示蹤。其缺點在于共聚物載體合成復雜，對于引入活性分子有一定難度。經檢索國內外專利文獻，廣泛查閱國內外公開出版物，未見有與本發(fā)明完全相同的技術方案。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出一種熒光靶向納米材料及其制備方法。本發(fā)明提出的靶向熒光納米材料的制備方法，以聚合物為納米材料載體，并對該聚合物進行疊氮化修飾，然后借助點擊化學反應，將靶向分子葉酸和熒光示蹤化合物偶聯
3到聚合物鏈上，得到熒光靶向偶合物，再經過超聲分散得到穩(wěn)定的靶向性熒光納米材料。具體步驟如下(1)制備疊氮化聚合物載體將聚合物溶于有機溶劑中，聚合物在有機溶劑中的質量濃度為 10%，加入疊氮化鈉，疊氮化鈉與聚合物的質量比為1 1 10 1，在20 100°C下反應5 12小時；將上述反應液倒入甲醇中，析出白色沉淀，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥，得疊氮化聚合物載體；(2)制備靶向熒光聚合物將步驟(1)得到的疊氮化聚合物溶于DMSO中，加入靶向分子、熒光示蹤化合物，攪拌下，通過點擊化學反應將熒光示蹤化合物、靶向分子偶聯到聚合物載體上，反應時間1 10小時，將反應液倒入甲醇中，析出黃色沉淀，過濾，洗滌濾餅，真空干燥，得到靶向熒光聚合物；(3)制備靶向熒光納米材料將步驟( 得到的靶向熒光聚合物溶于四氫呋喃中，配制成質量濃度為 10%的四氫呋喃溶液，緩慢滴加水，水與THF溶液的體積比為1 5，攪拌1 10小時，透析法除去THF，然后經過超聲分散，得到穩(wěn)定分散的納米材料。(4)靶向熒光材料靶向性示蹤將步驟C3)獲得的穩(wěn)定分散的靶向熒光材料加入到宮頸癌細胞中，在37°C 5% CO2 飽和溫度下培養(yǎng)4- ，用磷酸緩沖液沖洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀察靶向熒光材料對癌細胞進行識別。步驟(1)所述聚合物為對氯聚乙烯、聚對氯甲基苯乙烯、聚苯乙烯、聚乙氧基醚、 聚丙氧基醚、聚己內酯或聚丙烯酰胺中的一種。所述聚合物的分子量為4000 40000g/ mol ο所述的靶向分子為經細胞膜上高表達葉酸受體介導進入細胞的化合物為葉酸。所述的熒光示蹤化合物為炔基香豆素、炔基羅丹明或炔基甲基菁。所述的熒光示蹤化合物與聚合物、靶向分子葉酸與聚合物的質量比分別均為 0. 1/1 1/1。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明得到的靶向熒光納米材料，聚合物載體結構簡單，便于合成及進一步功能化，納米材料分布均勻，可以有效到達腫瘤部位，通過熒光物質的示蹤作用，在實驗和檢測過程中，直觀方便的考察靶向作用及病變發(fā)生情況。


圖1為本發(fā)明實施例1中疊氮化聚對甲基苯乙烯載體的紅外表征圖；圖2為本發(fā)明實施例2中葉酸-香豆素-疊氮化聚對甲基苯乙烯偶合物；圖3為本發(fā)明實施例3中葉酸-香豆素-疊氮化聚對氯甲基苯乙烯納米膠束的平均粒徑分布和TEM表征圖；圖4為本發(fā)明實施例3中制備的納米膠束在細胞試驗中的靶向識別共聚焦圖片。
具體實施例方式以下通過實施例進一步描述本發(fā)明，但不限于這些實施例。實施例1 制備疊氮化聚對氯甲基苯乙烯載體(1)將5g聚對氯甲基苯乙烯溶于50mL DMSO中，加入IOg疊氮化鈉，室溫下反應 5小時，將上述反應液倒入甲醇中，析出白色沉淀，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥，得到疊氮化聚對氯甲基苯乙烯載體。(2)將2g聚對氯甲基苯乙烯溶于200mL DMSO中，加入20g疊氮化鈉，100°C下反應 2小時，將上述反應液倒入甲醇中，析出白色沉淀，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥，得到疊氮化聚對氯甲基苯乙烯載體。(3)將5g聚對氯甲基苯乙烯溶于IOOmL DMSO中，加入15g疊氮化鈉，50°C下反應 4小時，將上述反應液倒入甲醇中，析出白色沉淀，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥，得到疊氮化聚對氯甲基苯乙烯載體。如圖1為疊氮化聚對甲基苯乙烯載體的紅外譜圖。2100CHT1處為疊氮化后疊氮基團的紅外吸收，說明成功進行了疊氮化修飾。實施例2 制備靶向熒光聚合物(1)分別取葉酸2.0g，炔基香豆素1.5g，實施例1(1)制備的疊氮化聚對氯甲基苯乙烯6. Og,溶于20mL DMSO中，室溫攪拌反應3小時，然后將反應液倒入甲醇中，析出黃色沉淀，過濾，洗滌濾餅，真空干燥，得到靶向熒光聚合物葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯。(2)分別取葉酸1.5g，炔基羅丹明3.0g，實施例1(2)制備的疊氮化聚對氯甲基苯乙烯10g，溶于30mL DMSO中，室溫攪拌反應5小時，然后將反應液倒入甲醇中，析出黃色沉淀，過濾，洗滌濾餅，真空干燥，得到靶向熒光聚合物葉酸-羅丹明-聚對氯甲基苯乙烯。(3)分別取葉酸3.0g，炔基甲基菁3.0g，實施例1(3)制備的疊氮化聚對氯甲基苯乙烯15g，溶于40mL DMSO中，室溫攪拌反應3小時，然后將反應液倒入甲醇中，析出黃色沉淀，過濾，洗滌濾餅，真空干燥，得到靶向熒光聚合物葉酸-甲基菁-聚對氯甲基苯乙烯。如圖2為葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯的核磁表征。化學位移6. 5-8. 5的峰說明葉酸及香豆素成功偶聯。實施例3 制備靶向熒光納米材料(1)將實施例2(1)得到的葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯溶于四氫呋喃中，配制成5%的四氫呋喃溶液5mL，緩慢滴加水10mL，攪拌5小時，透析法除去四氫呋喃，然后經過超聲分散，得到穩(wěn)定分散的納米材料。(2)將實施例2(2)得到的葉酸-羅丹明-聚對氯甲基苯乙烯溶于四氫呋喃中，配制成的四氫呋喃溶液10mL，緩慢滴加水50mL，攪拌10小時，透析法除去四氫呋喃，然后經過超聲分散，得到穩(wěn)定分散的納米材料。(3)將實施例2(3)得到的葉酸-甲基菁-聚對氯甲基苯乙烯溶于四氫呋喃中，配制成10%的四氫呋喃溶液30mL，緩慢滴加水150mL，攪拌1小時，透析法除去四氫呋喃，然后經過超聲分散，得到穩(wěn)定的納米材料。如圖3為實施例3(1)中葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯納米材料的平均粒徑分布及TEM電鏡表征。從圖中可看出平均粒徑為86納米，電鏡結果為80-100nm，與平均粒徑分布結果相同。
實施例4 制備靶向熒光納米材料(1)將實施例3(1)獲得的穩(wěn)定分散的葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯納米材料加入到宮頸癌細胞中，在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)4- ，用磷酸緩沖液沖洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀察靶向熒光材料對癌細胞進行識別。(2)將實施例3( 獲得的穩(wěn)定分散的葉酸-羅丹明-聚對氯甲基苯乙烯納米材料加入到宮頸癌細胞中，在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)4- ，用磷酸緩沖液沖洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀察靶向熒光材料對癌細胞進行識別。(3)將實施例3C3)獲得的穩(wěn)定分散的葉酸-甲基菁-聚對氯甲基苯乙烯納米材料加入到宮頸癌細胞中，在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)4- ，用磷酸緩沖液沖洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀察靶向熒光材料對癌細胞進行識別。如圖4為葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯納米材料對宮頸癌細胞的靶向性識別共聚焦圖片。從圖中可看出，葉酸-香豆素-聚對氯甲基苯乙烯納米材料可對宮頸癌細胞進行有效地靶向性識別。
權利要求
1.一種熒光靶向納米材料的制備方法，其特征在于以聚合物為納米材料載體，并對該聚合物進行疊氮化修飾，然后借助點擊化學反應，將靶向分子葉酸和熒光示蹤化合物偶聯到聚合物鏈上，得到熒光靶向納米材料，具體步驟如下(1)制備疊氮化聚合物載體將聚合物溶于有機溶劑中，聚合物在有機溶劑中的質量濃度為19Γ10%，加入疊氮化鈉， 疊氮化鈉與聚合物的質量比為1 廣10 :1，在2(T100°C反應5 12小時；將上述反應液倒入甲醇中，析出白色沉淀，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥，得疊氮化聚合物載體；(2)制備靶向熒光聚合物將步驟(1)得到的疊氮化聚合物溶于DMSO中，加入靶向分子、熒光示蹤化合物，攪拌下，通過點擊化學反應將熒光示蹤化合物、靶向分子偶聯到聚合物載體上，反應時間廣10 小時，將反應液倒入甲醇中，析出黃色沉淀，過濾，洗滌濾餅，真空干燥，得到靶向熒光聚合物；(3)制備靶向熒光納米材料將步驟(2)得到的靶向熒光聚合物溶于THF中，配制成質量濃度為19Γ10%的THF溶液， 緩慢滴加水50mL，水與THF溶液的體積比為1 :5，攪拌廣10小時，透析法除去THF，然后經過超聲分散，得到穩(wěn)定分散的納米材料； (4)靶向熒光材料靶向性示蹤將步驟(3)獲得的穩(wěn)定分散的靶向熒光材料加入到宮頸癌細胞中，在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)4-5h，用磷酸緩沖液沖洗三次，使用共聚焦顯微鏡觀察靶向熒光材料對癌細胞進行識別。
2.根據權利要求1所述的熒光靶向納米材料的制備方法，其特征在于所述聚合物為對氯聚乙烯、聚對氯甲基苯乙烯、聚苯乙烯、聚乙氧基醚、聚丙氧基醚、聚己內酯或聚丙烯酰胺中的一種。
3.根據權利要求1或2所述的熒光靶向納米材料的制備方法，其特征在于所述聚合物的分子量為 400(T40000g/mol。
4.根據權利要求1或2所述的熒光靶向納米材料的制備方法，其特征在于靶向分子為經細胞膜上高表達葉酸受體介導進入細胞的化合物葉酸。
5.根據權利要求1或2所述的熒光靶向納米材料的制備方法，其特征在于熒光示蹤化合物為炔基香豆素、炔基羅丹明或炔基甲基菁。
6.根據權利要求1或2所述的熒光靶向納米材料的制備方法，其特征在于熒光示蹤化合物與聚合物、靶向分子葉酸與聚合物的質量比均為0. 1/廣1/1。
全文摘要
一種熒光靶向納米材料及其制備方法。制備方法是以聚合物為納米材料載體，并對其進行疊氮化修飾，然后借助點擊化學反應，將靶向分子葉酸和熒光示蹤化合物偶聯到聚合物鏈上，得到熒光靶向偶合物，再經過超聲分散得到穩(wěn)定的靶向性熒光納米材料。本發(fā)明得到的靶向熒光納米材料，分布均勻，可以有效到達腫瘤部位，通過熒光化合物的示蹤作用，在實驗和檢測過程中，直觀方便的考察靶向作用及病變發(fā)生情況。本發(fā)明的優(yōu)點是制備方法簡便；熒光納米體系穩(wěn)定；靶向分子葉酸可提高熒光材料的靶向性。
文檔編號C09K11/06GK102260495SQ20111014836
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權日2011年6月3日
發(fā)明者侯潔, 張奇, 曹美榮, 白芳, 白鋼 申請人:南開大學