本發(fā)明屬于熒光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備方法及抗壞血酸的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

抗壞血酸(aa)又稱(chēng)維生素c，大量存在于食品、動(dòng)物體液及人體中，廣泛參與機(jī)體的氧化、還原等代謝過(guò)程，其在生物化學(xué)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，是生命體中重要的抗氧化劑、輔酶因子及神經(jīng)傳遞素相關(guān)酶的組成成分。眾所周知，aa的缺乏將導(dǎo)致壞血病的發(fā)生，但是攝入過(guò)量也會(huì)引起尿結(jié)石、腹瀉、胃痙攣等。因此，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地檢測(cè)aa的含量是至關(guān)重要的。

傳統(tǒng)的用于抗壞血酸檢測(cè)的方法主要有：光學(xué)法、色譜法、電化學(xué)法、流動(dòng)注射分析法、高效液相色譜法等，然而這些方法存在設(shè)備費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜和費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。因此發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、低成本的抗壞血酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)環(huán)境、生命、醫(yī)學(xué)以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等都具有重要的意義。近年來(lái)，人們致力于抗壞血酸檢測(cè)的化學(xué)傳感器的研究。其中，熒光傳感法(即熒光探針?lè)?成為了當(dāng)前廣泛應(yīng)用的分析方法。熒光傳感法因其靈敏度高和便捷等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)重金屬、有機(jī)小分子等物質(zhì)的強(qiáng)有力的工具。但是常用的熒光探針如半導(dǎo)體量子點(diǎn)和有機(jī)熒光分子，或者毒性高或者光穩(wěn)定性差。

石墨烯量子點(diǎn)(graphenequantumdots，gqds)是一種由少數(shù)幾層石墨烯片組成的碳基納米材料，具有化學(xué)惰性高、毒性低、生物相容性好和光穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，在超級(jí)電容器、光伏器件、生物成像等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。目前合成gqds的方法主要有兩大類(lèi)：自上而下和自下而上法。這兩種制備方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，例如自下而上法可以較好地調(diào)控gqds的尺寸和形貌，但是其合成過(guò)程不僅耗時(shí)而且需特定的有機(jī)前驅(qū)體，更重要的是所制備的gqds水溶性差、分散性低。相對(duì)而言，自上而下法可以簡(jiǎn)便、大規(guī)模地制備水溶性的gqds。但是這種方法也具有分離困難、尺寸難以控制等缺點(diǎn)。為了獲得粒徑及層數(shù)可控的石墨烯量子點(diǎn)，一些科研人員發(fā)展了一種限域空間內(nèi)制備gqds的方法。例如：有課題組采用自下而上的方法，在層狀鎂鋁水滑石材料的二維限域空間內(nèi)插層了檸檬酸鹽，并在二維空間的限域作用下，通過(guò)水熱處理檸檬酸鹽，獲得了層數(shù)可控的石墨烯量子點(diǎn)。但是，如何利用納米級(jí)反應(yīng)空間，采用自上而下的方法，限域制備粒徑可控的高性能熒光氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，還未被開(kāi)發(fā)出來(lái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備方法及抗壞血酸的檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的方法可獲得尺寸均一、光穩(wěn)定性高的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)，以其作為熒光探針，可快速完成抗壞血酸的檢測(cè)，且準(zhǔn)確性良好。

本發(fā)明提供了一種氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備方法，包括：

a)將碳氮源、三甲基苯、硫酸和乙醇混合后注入有序介孔二氧化硅中，在60～100℃下加熱2～8h，再在120～180℃下反應(yīng)3～10h，然后在700～1000℃氮?dú)鈿夥障录訜?～5h，得到碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物；所述碳氮源為吡咯或喹啉；

b)將所述碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物在濃硝酸蒸汽中反應(yīng)，得到氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)。

本申請(qǐng)以有序介孔二氧化硅作為納米反應(yīng)器，將其介孔孔壁上覆蓋少層含氮石墨烯形成有序介孔n/c/二氧化硅納米復(fù)合物，然后使用硝酸蒸汽作為剪刀制備出了尺寸可控、水溶性好的n-gqds。更重要的是，n/c/二氧化硅的介孔結(jié)構(gòu)利于n-gqds的快速分離，從而避免了復(fù)雜、乏味的離心過(guò)程。此外，將未反應(yīng)的n/c/二氧化硅在空氣條件下煅燒去除碳成份，可以回收利用此納米反應(yīng)器?？傊玫乃嵴羝袛喾ê驮贿^(guò)濾策略實(shí)現(xiàn)了石墨烯量子點(diǎn)的高產(chǎn)率制備和簡(jiǎn)易分離。通過(guò)使用限域的納米反應(yīng)器，所獲得的石墨烯量子點(diǎn)粒徑均一、分散性好，解決了自上而下法合成n-gqds分離困難、產(chǎn)率低和尺寸難以控制等難題。研究表明，石墨烯量子點(diǎn)富含羥基和羧基等含氧官能團(tuán)不僅使其具有極佳的水溶性，而且以fe³⁺為熒光淬滅劑形成fe³⁺-n-gqds體系，加入生物小分子aa作為還原劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)aa的turn-on檢測(cè)，并實(shí)施了魚(yú)血中aa的檢測(cè)，獲得令人滿(mǎn)意的回收率。

本發(fā)明以有序介孔二氧化硅為模板，所述有序介孔二氧化硅按照以下方法制備：

將正硅酸乙酯、三嵌段共聚物p123、水和濃鹽酸混合均勻，100～130℃條件下反應(yīng)20～28h，將得到的產(chǎn)品洗滌、干燥后在空氣條件下，500～580℃退火4～8h，得到有序介孔二氧化硅。

其具體操作步驟如下：

將正硅酸乙酯、三嵌段共聚物p123、水和濃鹽酸混合均勻。將此溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，100～130℃條件下反應(yīng)20～28h。反應(yīng)結(jié)束后，用大量的超純水和乙醇洗滌并過(guò)濾，所得產(chǎn)品在50～60℃下干燥。最終，將烘干后的產(chǎn)品在空氣條件下，500～580℃退火4～8h，得到有序介孔二氧化硅sba-15。

其中，三嵌段共聚物p123的重均分子量(mw)為3000～10000，優(yōu)選為4000～6000，更優(yōu)選為5800。

獲得有序介孔二氧化硅模板后，將碳氮源、三甲基苯、硫酸和乙醇混合后注入有序介孔二氧化硅中，在60～100℃下加熱2～8h，再在120～180℃下反應(yīng)3～10h，然后在700～1000℃氮?dú)鈿夥障录訜?～5h，得到碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物；其中，所述碳氮源為吡咯或喹啉。其中，有序介孔sio2(sba-15)為模板，喹啉或吡咯作為碳氮源，三甲基苯作為擴(kuò)孔劑、硫酸作為催化劑，反應(yīng)后得到聚喹啉/sio2或聚吡咯/sio2，然后在700～1000℃氮?dú)鈿夥障录訜?～5h，得到碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物。

其中，所述碳氮源、三甲基苯、硫酸和乙醇的摩爾比為1：2～7：1～4：0.1～0.6。

得到碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物后，將其在濃硝酸蒸汽中反應(yīng)，利用簡(jiǎn)易的硝酸蒸氣切斷策略，在密閉反應(yīng)釜的空間內(nèi)，氧化切斷有序介孔n/c/sio2孔壁表面的含氮碳層，獲得氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(n-gqds)。

具體而言，所述步驟b具體為：

將碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物放入玻璃器皿中，將所述玻璃器皿放入含有濃硝酸的反應(yīng)釜中，120～160℃加熱1～3h，將玻璃器皿原位過(guò)濾，得到氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液。

首先，將制備好的碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物放入玻璃器皿中。其次，將玻璃器皿放入含有濃硝酸的反應(yīng)釜中。再次，將此反應(yīng)釜放入120～160℃烘箱中加熱1～3h。最后，將反應(yīng)后的玻璃器皿原位過(guò)濾，收集黃色濾液，為n-gqds溶液。

此外，本發(fā)明還包括：將過(guò)濾后的沉淀在空氣條件下，520～580℃退火3～6h，回收有序介孔二氧化硅。

得到氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液后，將0.15～0.3mln-gqds溶液用1.6～2ml超純水(≥18.2mω)稀釋?zhuān)缓笠?0nm為間隔的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)n-gqds，狹縫為5～10nm進(jìn)行熒光測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激發(fā)波長(zhǎng)是340nm時(shí)，它的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度最大。因此，我們選擇340nm為激發(fā)波長(zhǎng)用于以下熒光實(shí)驗(yàn)。

取制備的n-gqds溶液和超純水于石英比色皿中，首先加入fe³⁺溶液，得到測(cè)試體系，測(cè)定不同aa濃度下的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)aa濃度繪制傳感曲線(xiàn)圖，然后用于檢測(cè)抗壞血酸。

本發(fā)明還提供了一種抗壞血酸的檢測(cè)方法，包括：

按照上述技術(shù)方案所述的制備方法制備氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液；

將所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液與fe³⁺溶液混合，得到fe³⁺-n-gqds混合液；

向所述fe³⁺-n-gqds混合液中加入待測(cè)物，測(cè)定得到的溶液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)物中抗壞血酸的含量。

其中，所述預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)按照以下方法得到：

按照上述技術(shù)方案所述的制備方法制備氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液；

將所述氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)溶液與fe³⁺溶液混合，得到fe³⁺-n-gqds混合液；

向所述fe³⁺-n-gqds混合液中加入系列濃度的抗壞血酸溶液，測(cè)定得到的溶液的熒光強(qiáng)度，建立恢復(fù)的熒光強(qiáng)度比f(wàn)/f0與濃度的工作曲線(xiàn)，其中，f為加入抗壞血酸溶液后的熒光強(qiáng)度，f0為未加入抗壞血酸溶液時(shí)的熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明利用納米反應(yīng)器限域n-gqds的制備方法并利用n-gqds的熒光“開(kāi)關(guān)”模式專(zhuān)一性檢測(cè)aa，是基于選用有序介孔sio2作為納米反應(yīng)器，在其孔壁表面覆蓋納米級(jí)厚度且可調(diào)的含氮石墨烯層，獲得有序介孔n/c/sio2復(fù)合物，利用酸蒸汽氧化切斷策略及介孔限域作用，制備粒徑、層數(shù)可控的n-gqds。n-gqds表面的富氧官能團(tuán)特別是酚羥基和羧基是其對(duì)fe³⁺具有較好選擇性的主要因素。此外，n-gqds表面的羧基對(duì)fe³⁺也具有較大的貢獻(xiàn)。基于以上分析，當(dāng)fe³⁺加入到n-gqds溶液之后形成了fe-n-gqds配合物，這個(gè)配合物利于光生電子從n-gqds到fe³⁺的轉(zhuǎn)移，從而淬滅熒光，加入aa后，利用fe³⁺作為氧化劑，通過(guò)加入具有還原作用及配位作用的aa改變氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的配位環(huán)境，進(jìn)而恢復(fù)n-gqds的熒光發(fā)射，達(dá)到turn-on檢測(cè)aa的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法制備得到的n-gqds粒徑尺寸均一，分布較窄，直徑在1.7～3.9nm范圍之間；分散性良好，均勻分散排布，高度小于2.0nm，說(shuō)明所合成的n-gqds由1-5層石墨烯構(gòu)成；由大量的c、o及微量的n元素構(gòu)成，具有較好的水溶性。以該量子點(diǎn)作為熒光探針對(duì)抗壞血酸具有良好的選擇性，且對(duì)抗壞血酸的檢測(cè)具有良好的準(zhǔn)確度。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中使用的玻璃器皿。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2制備的n-gqds的透射電鏡圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2制備的n-gqds的原子力顯微鏡圖(a)及高度圖(b)。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2制備的n-gqds的xps譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3fe³⁺-n-gqds對(duì)aa的傳感應(yīng)用圖，不同濃度aa下的fe³⁺-n-gqds溶液的熒光光譜圖(aa濃度從上到下依次是：0,10，20，30，40，50，60，70，80，90和100μm)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3fe³⁺-n-gqds對(duì)aa檢測(cè)的工作曲線(xiàn)，f0和f分別是340nm激發(fā)下，aa缺乏和存在下的熒光強(qiáng)度。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例3fe³⁺-n-gqds在50μm不同生物小分子存在下的淬滅性能，從左到右分別為：尿酸(aa)、果糖(fru)、葡萄糖(glc)、乙醇(et)、l-半胱氨酸(cys)、l-谷氨酸(l-gla)、l-亮氨酸(l-leu)和l-苯丙氨酸(l-phe)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1有序介孔的含氮高分子/sio2復(fù)合材料的制備

將正硅酸乙酯、三嵌段共聚物p123(mw＝5800)、水和濃鹽酸混合均勻。將此溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，110℃條件下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用大量的超純水和乙醇洗滌并過(guò)濾，所得產(chǎn)品在60℃下干燥。最終，將烘干后的產(chǎn)品在空氣條件下，550℃退火6h，得到有序介孔二氧化硅sba-15。

取摩爾比為1：5：3：0.4的吡咯、三甲基苯、硫酸和乙醇混合溶液孕注到sba-15中，先在80℃烘箱中加熱6h，隨后在160℃烘箱中反應(yīng)8h，然后所得樣品在800℃氮?dú)鈿夥障录訜?h，得到碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物。

實(shí)施例2氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的制備

將實(shí)施例1制備好的碳/氮/二氧化硅納米復(fù)合物放入如圖1所示的玻璃器皿中，然后放入含有濃硝酸的反應(yīng)釜中，再將此反應(yīng)釜放入120～160℃烘箱中加1～3h。最后，將反應(yīng)后的玻璃器皿原位過(guò)濾，收集黃色濾液，為n-gqds溶液。

對(duì)所述n-gqds溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)圖2、圖3和圖4，圖2為本發(fā)明實(shí)施例2制備的n-gqds的透射電鏡圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例2制備的n-gqds的原子力顯微鏡圖及高度圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例2制備的n-gqds的xps譜圖。

由圖2可見(jiàn)n-gqds粒徑尺寸均一，分布較窄，直徑在1.7～3.9nm范圍之間。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析100個(gè)量子點(diǎn)的尺寸，該量子點(diǎn)的平均粒徑約為2.5nm。

從圖3中n-gqds的afm圖中可看出，n-gqds分散性良好，均勻分散排布，與它的tem結(jié)果吻合。所獲得的n-gqds高度小于2.0nm，說(shuō)明所合成的n-gqds由1-5層石墨烯構(gòu)成。

圖4中n-gqds的xps全譜圖顯示了一個(gè)弱的n1s(405ev)的特征峰和兩個(gè)明顯的c1s(284ev)和o1s(532ev)的特征峰，表明該量子點(diǎn)由大量的c、o及微量的n元素構(gòu)成，其中氮含量和氧含量分別約為5.304％和32.509％。n-gqds高的氧含量使其具有較好的水溶性，為其應(yīng)用提供了可能。

實(shí)施例3aa的檢測(cè)

將0.15～0.3ml實(shí)施例2制備的n-gqds溶液用1.6～2ml超純水(≥18.2mω)稀釋?zhuān)缓笠?0nm為間隔的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)n-gqds，狹縫為5～10nm進(jìn)行熒光測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激發(fā)波長(zhǎng)是340nm時(shí)，它的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度最大。因此，我們選擇340nm為激發(fā)波長(zhǎng)用于以下熒光實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)施例2制備的n-gqds過(guò)濾液用超純水(≥18.2mω)稀釋獲得檢測(cè)液。然后加入50μm的fe³⁺溶液，形成fe³⁺-n-gqds檢測(cè)平臺(tái)，然后加入aa，測(cè)定不同aa濃度下的熒光強(qiáng)度，而恢復(fù)的熒光強(qiáng)度比f(wàn)/f0與加入的aa量成線(xiàn)性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

結(jié)果參見(jiàn)圖5和圖6，圖5為本發(fā)明實(shí)施例3fe³⁺-n-gqds對(duì)aa的傳感應(yīng)用圖，不同濃度aa下的fe³⁺-n-gqds溶液的熒光光譜圖(aa濃度從上到下依次是：0,10，20，30，40，50，60，70，80，90和100μm)；圖6為本發(fā)明實(shí)施例3fe³⁺-n-gqds對(duì)aa檢測(cè)的工作曲線(xiàn)，f0和f分別是340nm激發(fā)下，aa缺乏和存在下的熒光強(qiáng)度。

圖5和6表明隨著aa濃度的增加，淬滅的n-gqds熒光逐漸恢復(fù)，且恢復(fù)的熒光強(qiáng)度比f(wàn)/f0在0.5-40μm范圍內(nèi)成一定的線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性方程為f/f0＝1.04461+0.05575*caa(r＝0.993)，式中f為加入aa后的熒光強(qiáng)度，f0為未加入aa時(shí)的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的傳感器對(duì)aa的線(xiàn)性范圍較寬，展現(xiàn)了其優(yōu)勢(shì)。

實(shí)施例4fe³⁺-n-gqds對(duì)aa的選擇性測(cè)試及n-gqds的光穩(wěn)定性測(cè)試

將fe³⁺-n-gqds檢測(cè)液放入石英比色皿中，然后分別加入50μm的干擾物質(zhì)多巴胺、尿酸、葡萄糖、果糖、乙醇、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-亮氨酸和l-苯丙氨酸。結(jié)果參見(jiàn)圖7，圖7為本發(fā)明實(shí)施例3fe³⁺-n-gqds在50μm不同生物小分子存在下的淬滅性能，從左到右分別為：尿酸(aa)、果糖(fru)、葡萄糖(glc)、乙醇(et)、l-半胱氨酸(cys)、l-谷氨酸(l-gla)、l-亮氨酸(l-leu)和l-苯丙氨酸(l-phe)。

由圖7可知，相比于以上干擾物質(zhì)極小的熒光增強(qiáng)，當(dāng)50μmaa加入到fe³⁺-n-gqds后，熒光增強(qiáng)為原來(lái)的4.89倍。這些結(jié)果表明所制備的fe³⁺-n-gqds對(duì)aa具有好的選擇性。

實(shí)施例5檢測(cè)魚(yú)血中的aa

水樣取自魚(yú)血漿，用其配制已知濃度的aa標(biāo)準(zhǔn)溶液。將fe³⁺-n-gqds檢測(cè)液放入石英比色皿中。然后分別加入10，30，40μm的fe³⁺，測(cè)定熒光強(qiáng)度，利用工作曲線(xiàn)計(jì)算aa的含量。利用本發(fā)明的熒光傳感器檢測(cè)到的aa的濃度為9.53μm,30.45μm，42.48μm，aa的回收率各是95.3±0.5％，101.5±1.0％和106.2±0.8％(表1)：

表1

從表1中可以看出：本發(fā)明所述的n-gqds可以應(yīng)用于魚(yú)血中aa的檢測(cè)，且具有較高的準(zhǔn)確度。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。