磺酸基石墨烯量子點生物熒光探針及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磺酸基石墨烯量子點生物熒光探針及其應用。
【背景技術】
[0002]近些年來，量子點在生物醫(yī)學領域的應用已經成為人們廣泛關注的研究熱點之一。量子點在體內外成像，靶向標記特異組織和細胞等方面均取得了新的進展。同時，近年來，石墨烯因獨特的性能而受到越來越多的關注，如大的比表面積、高的載流子迀移率、優(yōu)異的機械靈活性、良好的熱/，化學穩(wěn)定性以及對環(huán)境友好的特征等。石墨烯量子點(GQDs)除了具有石墨烯的優(yōu)異性能外，由于尺寸在1nm以下，表現出更強的邊緣效應和小尺寸效應，可以表現出獨特的光化學性質。GQDs毒性低、具有良好的水溶性、熒光穩(wěn)定性和生物兼容性，可順利進入細胞，在腫瘤細胞的成像研究方面具有廣泛的應用前景被應用于細胞不同組分。與其他的碳材料相比，由于GQDs可以進一步功能化，因此在細胞診斷、藥物傳遞等方面有更強的可行性與與操作性，因此在生物醫(yī)學領域有廣泛的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種磺酸基石墨烯量子點(Sulf0-GQDs)生物熒光探針及其應用。
[0004]為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種磺酸基石墨烯量子點生物熒光探針，其特征在于該探針是在細胞培養(yǎng)基中加入磺酸基石墨烯量子點，其濃度為10-100 mg/Lo
[0005]一種上述的石墨烯量子點生物熒光探針在標記腫瘤細胞核中的應用。
[0006]在細胞水平，石墨烯量子通過激光控制控制識別、標記腫瘤細胞核的具體過程: 乳腺癌細胞(4T1)，宮頸癌細胞(Hela)，肝癌細胞(7721)，神經干細胞(C17.2)，胃黏膜細胞(GES-1)在瓶底部貼壁達到80%后，將含有10-100 mg/L Sulfo-GQDs的細胞培養(yǎng)基與細胞共孵育0.5-12 ho利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞與Sulfo-GQDs作用情況(Sulfo-GQDs激發(fā)波長:405 nm)。最初，Sulfo-GQDs聚集在細胞膜周圍，并沒有進入細胞內。去除培養(yǎng)基后，細胞在共聚焦顯微鏡的激光照射15 min過程中(405 nm激發(fā))，Sulfo-GQDs逐漸進入細胞核，最終在細胞核內聚集。
[0007]在細胞水平，石墨烯量子通過溫度控制識別、標記腫瘤細胞核的具體過程:
乳腺癌細胞(4T1)，宮頸癌細胞(Hela)，肝癌細胞(7721)在瓶底部貼壁達到80%后，
將含有10-100 mg/L Sulfo-GQDs的培養(yǎng)基與細胞共孵育0.5_12 h。去除培養(yǎng)基后，利用激光共聚焦顯微鏡的溫度變化裝置控制溫度，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞與Sulfo-GQDs 作用情況(Sulfo-GQDs 激發(fā)波長:405 nm)。實驗發(fā)現，Sulfo-GQDs 在 37 0C條件下，僅聚集在細胞膜周圍，并沒有進入細胞，當培養(yǎng)溫度升高到38 0C, Sulfo-GQDs逐漸進入細胞核，最終在細胞核內聚集。
[0008]在體內，使用小鼠為動物模型，石墨烯量子點識別、標記腫瘤細胞核的具體過程: 利用BALB/C雌性小鼠為動物模型，并利用乳腺癌細胞(4T1)，宮頸癌細胞(Hela)Jf癌細胞(7721)建立腫瘤模型進行實驗。50-100 mg/kg Sulfo-GQDs通過尾靜脈注射進入荷瘤小鼠體內，0.5-2 h小時后，處死小鼠，將脾，肺，瘤組織取出后，組織樣品制成20Mffl厚的冷凍切片樣品，用于進行激光共聚焦顯微鏡觀察Sulfo-GQDs在小鼠體內的分布情況，發(fā)現Sulfo-GQDs在正常器官組織內分布比較分散，在組織間質內分散；而在腫瘤組織內Sulfo-GQDs可以特異性靶向腫瘤細胞核，在細胞核內大量聚集，和細胞實驗所得結果一致。說明此量子點可以特異性靶向到腫瘤組織細胞核內，而在正常組織里無此性能。
[0009]能夠實現這種體內特異靶向細胞核的性能，主要由于以下兩個方面決定:體內腫瘤組織壓力增加，體內腫瘤細胞表面產生了額外的表面張力；Sulf0-GQDs材料表面的電荷、粒徑及結構等性質，使Sulfo-GQDs在無額外的表面張力作用下，不能進入細胞。因此在細胞水平，通過溫度及激光控制，給予一定表面張力時，Sulfo-GQDs對正常細胞及腫瘤細胞無選擇性。
[0010]本發(fā)明方法的優(yōu)點和特點如下所述:
(I)石墨烯量子點對細胞核進行標記識別的方法簡單，可控性強，不需要對材料進行二次修飾。
[0011](2)石墨烯量子點對細胞核進行標記識別的方法，穩(wěn)定性好。
[0012](3)在體內可以直接標記腫瘤細胞的細胞核，無需任何腫瘤靶向分子修飾，過程簡單，靶向效率高。
【附圖說明】
[0013]圖1石墨稀量子點通過激光控制進入細胞核，對細胞核進行標記。
[0014]圖2石墨烯量子作為細胞細胞核標記試劑與傳統(tǒng)細胞核標記試劑(4，6-聯脒-2-苯基吲哚)DAPI的穩(wěn)定性對比。a:激光照射Sulfo-GQDs靶向4T1細胞核后，細胞固定后，研究其不同時間激光照射下的光穩(wěn)定性；b =DAPI染核后，進行不同時間激光照射后的光穩(wěn)定性。標尺:20 Mm。
[0015]圖3石墨稀量子點通過溫度控制進入細胞核，對細胞核進行標記。a:Sulfo_GQDs靶向細胞核圖片；b:細胞原圖。標尺:5 Pm。
[0016]圖4石墨烯量子點在體內不進入正常組織細胞核。石墨烯量子點在體內不進入正常組織細胞核，a:肺組織切片，b:脾組織切片。綠色=Sulfo-GQDs ;紅色:SYT0_17紅色細胞核染料。標尺:10 Pm。
[0017]圖5石墨烯量子點在體內靶向、識別標記腫瘤細胞核。標尺:10 Mffl0 a)乳腺癌；b)肝癌；c)宮頸癌。
【具體實施方式】
[0018]現將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。所述的磺酸基石墨烯量子點的制備方法如下:芘(200 g, TCI,純度98%)在熱硝酸條件下冷凝回流攪拌24 h硝酸化為1，3，6-三硝基芘。冷卻至室溫后，混合物用去離子水稀釋，用0.22 _濾膜過濾除酸。所得產物，攪拌條件下快速分散到Na2SO3S液中。混合物轉移到聚四氟乙烯反應釜中，200 °C條件下，高壓鍋內反應12 ho冷卻至室溫后，得到黑色膠體產物，且沒有不溶副產物出現。膠體放入透析袋(分子量:3500 Da)內透析以去除去鈉鹽。
[0019]實施例1:在細胞水平，石墨烯量子通過激光控制識別、標記腫瘤細胞核的具體過程:
乳腺癌細胞(4T1)在瓶底部貼壁達到80%后，將含有60 mg/L Sulfo-GQDs的培養(yǎng)基與細胞共孵育12 ho利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞與Sulfo-GQDs作用情況(Sulfo-GQDs激發(fā)波長:405 nm)。最初，Sulf0-GQDs聚集在細胞膜周圍，并沒有進入細胞內。去除培養(yǎng)基后，細胞在共聚焦顯微鏡的激光照射15 min過程中(405 nm激發(fā))，Sulf0-GQDs逐漸進入細胞核，最終在細胞核內聚集。具體結果參見圖1。在圖2中，我們進行Sulfo-GQDs和常見染核材料DAPI的光穩(wěn)定性對比，發(fā)現Sulfo-GQDs在激光照射條件下不會發(fā)生光淬滅現象，反而存在熒光增強現象，如圖2a，而DAPI在40 min的長時間照射下發(fā)生嚴重的光漂白現象，如圖2b。
[0020]實施例2:在細胞水平，石墨烯量子通過溫度控制識別、標記腫瘤細胞核的具體過程:
乳腺癌細胞(4T1)在瓶底部貼壁達到80%后，將含有60 mg/L Sulfo-GQDs的培養(yǎng)基與細胞共孵育12 ho去除培養(yǎng)基后，利用激光共聚焦顯微鏡的溫度變化裝置來改變細胞培養(yǎng)溫度(37 0C, 38 0C和5% CO2),并利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞與Sulf0-GQDs作用情況(Sulfo-GQDs激發(fā)波長:405 nm)。實驗發(fā)現，Sulfo-GQDs在37 0C條件下，僅聚集在細胞膜周圍，并沒有進入細胞，當培養(yǎng)溫度升高到38 0C, Sulfo-GQDs逐漸進入細胞核，最終在細胞核內聚集。具體結果參見圖3。
[0021]實施例3:在體內，使用小鼠為動物模型，石墨烯量子點識別、標記腫瘤細胞核的具體過程:
利用BALB/C雌性小鼠為動物模型，并利用乳腺癌細胞(4T1)建立腫瘤模型進行實驗。60 mg/kg Sulfo-GQDs通過尾靜脈注射進入荷瘤小鼠體內，0.5小時后，處死小鼠，將脾，肺，瘤組織取出后，組織樣品制成20 μ?厚的冷凍切片樣品，用于進行激光共聚焦顯微鏡觀察Sulfo-GQDs在小鼠體內的分布情況，發(fā)現Sulfo-GQDs在正常器官組織內分布比較分散，在組織間質內分散(圖4);而在腫瘤組織內Sulfo-GQDs可以特異性靶向腫瘤細胞核，在細胞核內大量聚集，說明此量子點可以特異性靶向到乳腺癌腫瘤組織細胞核內(圖5a)。
[0022]實施例4:在體內，使用小鼠為動物模型，石墨烯量子點識別、標記腫瘤細胞核的具體過程:
利用BALB/C雌性小鼠為動物模型，并利用肝癌細胞(7721)建立腫瘤模型進行實驗。60 mg/kg Sulfo-GQDs通過尾靜脈注射進入荷瘤小鼠體內，0.5小時后，處死小鼠，將脾，肺，瘤組織取出后，組織樣品制成20 μ?厚的冷凍切片樣品，用于進行激光共聚焦顯微鏡觀察Sulfo-GQDs在小鼠體內的分布情況，在腫瘤組織內Sulfo-GQDs可以特異性靶向腫瘤細胞核，在細胞核內大量聚集，說明此量子點可以特異性革巴向到肝癌腫瘤組織細胞核內。(圖 5b)
實施例5:在體內，使用小鼠為動物模型，石墨烯量子點識別、標記腫瘤細胞核的具體過程:
利用BALB/C雌性小鼠為動物模型，并利用宮頸癌細胞(Hela)建立腫瘤模型進行實驗。60 mg/kg Sulfo-GQDs通過尾靜脈注射進入荷瘤小鼠體內，0.5小時后，處死小鼠，將脾，肺，瘤組織取出后，組織樣品制成20 μ?厚的冷凍切片樣品，用于進行激光共聚焦顯微鏡觀察Sulfo-GQDs在小鼠體內的分布情況，在腫瘤組織內Sulfo-GQDs可以特異性靶向腫瘤細胞核，在細胞核內大量聚集，說明此量子點可以特異性革G向到宮頸癌腫瘤組織細胞核內(圖5c)。
【主權項】
1.一種石墨烯量子點生物熒光探針，其特征在于該探針是在細胞培養(yǎng)基中加入磺酸基石墨稀量子點，其濃度為10-100 mg/Lo2.一種根據權利要求1所述的石墨烯量子點生物熒光探針在標記腫瘤細胞核中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磺酸基石墨烯量子點生物熒光探針及其應用。該探針是在細胞培養(yǎng)基中加入磺酸基石墨烯量子點，其濃度為10-100mg/L。石墨烯量子點對細胞核進行標記識別的方法簡單，可控性強，不需要對材料進行二次修飾。石墨烯量子點對細胞核進行標記識別的方法，穩(wěn)定性好。在體內可以直接標記腫瘤細胞的細胞核，無需任何腫瘤靶向分子修飾，過程簡單，靶向效率高。
【IPC分類】A61K49/00, G01N21/64
【公開號】CN105106974
【申請?zhí)枴緾N201510394852
【發(fā)明人】王艷麗, 潘登余, 姚晨婕, 李晨晨, 丁琳, 吳明紅
【申請人】上海大學
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年7月8日