一種負(fù)載阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米藥物，具體涉及一種負(fù)載阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是機(jī)體的細(xì)胞異常增殖形成的新生物，常表現(xiàn)為機(jī)體局部的異常組織產(chǎn)生腫塊。腫瘤的形成，是在各種致瘤因素作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂的結(jié)果。過去十年里，全球癌癥發(fā)病率增長(zhǎng)了 22 %，未來還將以每年千分之一的比例遞增，腫瘤已成為威脅人類健康乃至生命的頭號(hào)殺手?；熓侵委熌[瘤的的主要手段，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物主要包括阿霉素、紫杉醇、喜樹堿、順鉑等。但由于對(duì)這些藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞缺少特異選擇性，大多數(shù)病人不得不忍受化療藥物帶來的嚴(yán)重的毒副作用，生活質(zhì)量的下降，以及反復(fù)的治療療程。為了有效提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，從而減輕患者的痛苦，研究一種理想的化療模式即將化療藥物在準(zhǔn)確的時(shí)間遞送至準(zhǔn)確的病灶部位，并保證藥物具有足夠長(zhǎng)的作用時(shí)間成為亟需解決的問題。
[0003]納米技術(shù)是在現(xiàn)代物理學(xué)、化學(xué)和工程技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上誕生的高技術(shù)學(xué)科，其核心是利用納米材料的特殊性能，來實(shí)現(xiàn)普通材料所不能達(dá)到的功能和用途。納米藥物載體是指通過物理或化學(xué)的方式將藥物分子包載在納米材料載體上，形成藥物-載體的復(fù)合體系，其具有顯著提高靶區(qū)的藥物濃度，從而改善藥物的利用率和治療效果，并降低不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用H2N-PEG-COOH修飾具有低毒性、高生物相容性和表面易修飾等特性的納米鉆石，合成納米鉆石-聚乙二醇載體，明顯提高了納米鉆石的分散性，減弱了其易在人體組織中聚集的特性。最后通過靜電作用使納米鉆石-聚乙二醇載體吸附阿霉素從而制備得到納米鉆石藥物，并研究了該藥物的抗腫瘤活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種負(fù)載阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所制備的納米鉆石藥物分散性較好。
[0005]本發(fā)明提供的一種負(fù)載阿霉素的納米鉆石藥物的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)取真空干燥的羧基化納米鉆石，按每毫克羧基化納米鉆石加入1-1.5mL的濃度為0.1M、pH為5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每毫克羧基化納米鉆石加入0.2mg EDC, 0.25mg NHS，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h，反應(yīng)完畢后以15000rpm高速離心5min棄除上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；接著將活化的羧基化納米鉆石沉淀物迅速分散到濃度為0.1Μ、ρΗ為8.4的硼酸緩沖溶液中，經(jīng)過短暫超聲分散形成懸濁液，再按每毫克活化的羧基化納米鉆石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，待反應(yīng)結(jié)束，以15000rpm高速離心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸緩沖溶液高速離心洗滌三次，獲得納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)沉淀物；
[0007](2)取真空干燥的納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H) Img,按每毫克ND-PEG-C00H加入1-1.5mL的濃度為0.1M、pH為8.0的硼酸緩沖溶液中，超聲分散I小時(shí)形成懸濁液，再按每毫克ND-PEG-COOH加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于搖勻儀上反應(yīng)6小時(shí)后，以15000rpm高速離心5min收集上清液，并用0.1Μ、ρΗ為8.0的硼酸緩沖溶液繼續(xù)以15000rpm高速離心5min洗滌三次，制得納米鉆石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/D0X)納米藥物，真空干燥，冷藏，避光保存。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明選用的納米鉆石材料具有生物相容性好、無毒、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面易修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)；PEG因其在水溶液和一些溶劑中具有極好的溶解性、無毒且具有低的免疫原性等優(yōu)勢(shì)，使制備過程具有靈活性。本發(fā)明所得到的納米藥物分散性較前期研究尤為突出，可以保持四天才沉降，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)療效也強(qiáng)于游離阿霉素。通過納米載體ND-PEG與人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG載體具有生物兼容性；將納米載體納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG)在硼酸緩沖溶液作用下，物理吸附阿霉素，制備得到ND-PEG/D0X納米藥物，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞攝取ND-PEG/D0X實(shí)驗(yàn)，表明ND-PEG/D0X可以進(jìn)入細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；經(jīng)體外腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制表明ND-PEG/D0X具有能量依賴，是網(wǎng)格蛋白決定機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞；經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的活性，表明該納米藥物不僅可以降低化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，而且能提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，所以ND-PEG/D0X可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0009]圖1各種納米顆粒的紫外吸收光譜圖
[0010]圖2各種納米顆粒的分散性照片圖
[0011]圖3不同pH對(duì)納米藥物ND-PEG/D0X體外釋藥的影響
[0012]圖4A用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的散點(diǎn)圖
[0013]圖4B流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞攝取ND-PEG/D0X的散點(diǎn)圖
[0014]圖5A流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的熒光強(qiáng)度圖
[0015]圖5B流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞攝取ND-PEG/D0X的熒光強(qiáng)度圖
[0016]圖6A不同濃度的納米藥物ND-PEG/D0X對(duì)體外培養(yǎng)H印G2細(xì)胞活性的影響
[0017]圖6B不同濃度的納米藥物ND-PEG/D0X對(duì)體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞活性的影響
[0018]圖6C不同濃度的納米藥物ND-PEG/D0X對(duì)體外培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞活性的影響
[0019]圖7A納米藥物ND-PEG/D0X對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間IfepG2細(xì)胞活性的影響
[0020]圖7B納米藥物ND-PEG/D0X對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間HeLa細(xì)胞活性的影響
[0021]圖7C納米藥物ND-PEG/D0X對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間MCF-7細(xì)胞活性的影響
[0022]圖8 MCF-7細(xì)胞內(nèi)吞納米藥物ND-PEG/D0X的機(jī)制
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下為實(shí)施例中使用的材料:
[0024]納米鉆石(ND，元素六，直徑大約140nm, Ireland)。
[0025]阿霉素(DOX)是鹽酸多柔比星，分子式為C27H29NO11.HCl,分子量為579.99，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格按C27H29NO11.HCl計(jì)算為10mg。
[0026]聚乙二醇(H2N-PEG-COOH,分子量為2000)為上海西寶生物有限公司生產(chǎn)。
[0027]硼酸(H3BO3，分子量為61.83)為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)。
[0028]氫氧化鈉(NaOH，分子量為39.99)為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)納米粒子的制備
[0031]準(zhǔn)確稱取1.0mg羧基化納米鉆石，分別經(jīng)過二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇(C2H5OH)、蒸餾水(H2O)洗滌后，置于1.0mL MES(0.1M、ρΗ5.8)緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，接著加入0.2mg EDC,0.25mg NHS，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h，待反應(yīng)結(jié)束后以15000rpm高速離心5min，除去上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；
[0032]把活化羧基的納米鉆石沉淀物迅速分散到1.0mL BBS (0.1M、pH8.4)緩沖溶液中，超聲分散1min形成懸濁液，接著加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，待反應(yīng)完畢，以15000rpm高速離心5min收集上清液，并用蒸饋水繼續(xù)以15000rpm高速離心5min洗滌三次，獲得納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)納米粒子，置于真空干燥箱中保存?zhèn)溆谩０盐捶磻?yīng)的H2N-PEG-COOH上清液小心移取到干凈的燒杯中靜置，待測(cè)定ND-PEG-C00H納米顆粒上偶聯(lián)H2N-PEG-COOH的質(zhì)量。
[0033]精確稱取Img H2N-PEG-COOH,用BBS (0.1M，pH8.4)溶解并定容于1ml的比色管中，分別量取0.8ml, 0.56mL、0.4ml, 0.16ml,0.08mL置入2ml的EP管中，按摩爾比向其中入相應(yīng)體積的熒光胺，再加入一定體積使溶液總體積為2mL，立即渦流10秒，放置5分鐘，采用熒光分光光度法設(shè)激發(fā)波長(zhǎng)為385nm，測(cè)485nm處的熒光強(qiáng)度，以H2N-PEG-COOH摩爾濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制H2N-PEG-COOH標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，用反應(yīng)前加入H2N-PEG-COOH的總量減去反應(yīng)后上清液中H2N-PEG-COOH質(zhì)量，即得到每毫克ND粒子偶聯(lián) H2N-PEG-COOH 的量為 0.15mg。
[0034](2)納米鉆石-聚乙二