α?胰凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)在合成雙吲哚基?二氫吲哚?2?酮類化合物中的應(yīng)用及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了α?胰凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)在合成雙吲哚基?二氫吲哚?2?酮類化合物中的應(yīng)用及方法，在α?胰凝乳蛋白酶的催化下能將通式1和通式2在甲醇或乙醇溶液中生成雙吲哚基?二氫吲哚?2?酮類化合物，該方法的催化過程簡單易操作，收率最高可達(dá)97％，表現(xiàn)出極佳的底物適應(yīng)性，不但豐富了酶的多功能性的研究，也為雙吲哚基?二氫吲哚?2?酮類化合物的合成提供了一條高效的合成途徑。
【專利說明】
a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)在合成雙間哄基-二氨間哄- 2-酬類化合物中的應(yīng)用及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)在合成雙嗎I噪基-二 氨嗎I噪-2-酬類化合物中的應(yīng)用，還設(shè)及制備雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗎I噪因為其特殊的結(jié)構(gòu)特征自1866年被發(fā)現(xiàn)W來，已經(jīng)成為包括醫(yī)藥，香料，農(nóng)業(yè) 化學(xué)品，顏料和材料科學(xué)等諸多領(lǐng)域的研究熱點，運些工作清楚地顯示了嗎I噪在有機合成 中所占有的重要地位。
[0003] 雙嗎I噪類結(jié)構(gòu)，存在于許多藥物當(dāng)中。運類衍生物被證實具有廣泛的生物活性，比 如抗追原蟲，抗病毒，抗菌抗腫瘤，抗驚厥，帕金森癥的治療和有效的SARS冠狀病毒3CL蛋白 酶抑制劑。其中，雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬被發(fā)現(xiàn)是一類具有顯著抗炎，抗HIV，抗腫瘤活性 的物質(zhì)。一系列的3,3-雙嗎I噪基嗎I噪酬被發(fā)現(xiàn)具有抗癌，抗病毒的活性。有趣的是，據(jù)報道， 某些雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬衍生物可W強烈地作用于一系列的腫瘤細(xì)胞，但是不會針對 正常的細(xì)胞。雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬骨架在藥物化學(xué)中的廣泛應(yīng)用引起化學(xué)家們極大的 興趣W開發(fā)高效實用的合成途徑，在已經(jīng)報道的方法當(dāng)中，此類雜環(huán)合成最直接的方法是 催化說紅與嗎I噪之間的=組分串聯(lián)反應(yīng)得到對應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物。
[0004] a-膜凝乳蛋白酶（a-化ymohypsin from bovine pancreas)也被稱作糜蛋白酶， 是從牛的新鮮膜腺中提取分離出的膚鏈內(nèi)切酶，是一種絲氨酸蛋白酶，能將與芳香控或其 他大型疏水性側(cè)鏈(Tyr、Trp、Phe、Met、Leu)結(jié)合的膚從鍵的簇基端水解。作為一種被研究 的很清楚的水解酶，a-膜凝乳蛋白酶的立體結(jié)構(gòu)已被闡明，是由241個氨基酸殘基組成的單 一膚鏈，分子中包含5對二硫鍵。a-膜凝乳蛋白酶的分子量約為25KDa，最適抑為8-9，其活性 位點為第57位的組氨酸、第102位的天冬氨酸和第195位的絲氨酸，由運=個活性位點組成 的催化=聯(lián)體結(jié)構(gòu)起著催化中屯、的作用。
[0005] 在合成具有天然產(chǎn)物類似結(jié)構(gòu)的方法研究中，用簡捷高效的方法合成目標(biāo)產(chǎn)物一 直W來是科學(xué)家們研究的興趣所在。因此，為雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的合成提 供一條高效的合成途徑，也為豐富酶的多功能性的研究是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供a-膜凝乳蛋白酶在催化通式1和通式2的傅 克反應(yīng)生成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物中的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之二在于提供制備 雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[000引2、l、a-膜凝乳蛋白酶在甲醇溶液或乙醇溶液中催化通式1和通式2的傅克反應(yīng)生 成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物中的應(yīng)用：
[0009；
[0010] Ri任選為H或甲基;R2任選為H、F、Cl、化、硝基、甲基或甲氧基;R3任選為H或甲基;R 4任選為H、F、化、甲基或甲氧基。
[00川優(yōu)選的，所述Ri任選為H或甲基;R2任選為H、F、化、硝基或甲氧基;護(hù)為H; R4任選為 H、F、甲基或甲氧基。
[001 ^ 優(yōu)選的，所述Ri任選為H或甲基;R2任選為H、F或甲氧基;護(hù)為H; R4任選為H、F、甲基 或甲氧基。
[0013] 2、制備雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的方法，包括如下步驟：
[0014] W通式1、通式2為底物，a-膜凝乳蛋白酶為催化劑，甲醇溶液或乙醇溶液為溶劑， 在25~30°C下攬拌反應(yīng)，制得雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物；
[0015]
[0016] r1任選為H或甲基;R2任選為H、F、C1、Br、硝基、甲基或甲氧基;R3任選為H或甲基;R 4任選為H、F、化、甲基或甲氧基。
[0017] 優(yōu)選的，所述Ri任選為H或甲基;R2任選為H、F、化、硝基或甲氧基;護(hù)為H;R4任選為 H、F、甲基或甲氧基。
[001引優(yōu)選的，所述r1任選為H或甲基;R2任選為H、F或甲氧基;R3為H; R4任選為H、F、甲基 或甲氧基。
[0019] 優(yōu)選的，所述甲醇溶液或乙醇溶液為含體積分?jǐn)?shù)15~30%水的溶液。
[0020] 優(yōu)選的，所述通式1和通式2的摩爾比為1: 2。
[0021] 優(yōu)選的，a-膜凝乳蛋白酶的酶量為0.93~1.87kU。
[0022] 優(yōu)選的，制備雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物過程中監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完成 后過濾掉a-膜凝乳蛋白酶，用乙酸乙醋洗涂，使產(chǎn)品都溶于濾液中，用無水硫酸鋼干燥濾 液，將濾液濃縮，濃縮物W乙酸乙醋/石油酸為淋洗劑通過快速柱色譜法純化得到目標(biāo)產(chǎn) 物。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于:a-膜凝乳蛋白酶作為一種綠色環(huán)保的生物催化劑，可催 化說紅(及其衍生物)和嗎I噪(及其衍生物)之間的反應(yīng)，在甲醇溶劑中通過傅克反應(yīng)合成雙 嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物，得到了很高的收率(收率最高可達(dá)97%)，并且表現(xiàn)出極 佳的底物適應(yīng)性。該方法擴大了 a-膜凝乳蛋白酶在催化化學(xué)轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，不但豐富了酶 的多功能性的研究，也為雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的合成提供了一條高效的合成 途徑。該方法的催化過程簡單易操作，是有機合成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的一 種實用方法。
【附圖說明】：
[0024]圖1為a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的時間進(jìn)程(反應(yīng)條件:說紅(0.30mmol)， 嗎隙(0.60mmo 1)，去離子水(0.2mL)，甲醇(0.8mL)，a-膜凝乳蛋白酶(0.93kU，固體粉末)在 30°C條件下攬拌反應(yīng)。收率通過硅膠柱層析分離后得到）。
[002引圖2為說紅與2-甲基嗎I噪的傅克反應(yīng)(a反應(yīng)條件：說紅（0.30mmol)，2-甲基嗎I噪 (0.60mmo 1)，去離子水(0.2mL)，甲醇（0.8mL)，a-膜凝乳蛋白酶(0.93kU，固體粉末)在30°C 條件下攬拌反應(yīng)60h; b收率通過硅膠柱層析分離后得到）。
[0026] 圖3為a-膜凝乳蛋白酶催化傅克反應(yīng)的對比實驗。
[0027] 圖4為a-膜凝乳蛋白酶催化傅克反應(yīng)可能的機理。
[0028] 圖5為a-膜凝乳蛋白酶催化通式1與通式2反應(yīng)生成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化 合物反應(yīng)式。
【具體實施方式】
[0029] 下面將結(jié)合優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0030] -、a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)合成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬的溶劑的篩選
[0031] 采用化合物la(說紅)和化合物2a(嗎I噪）在不同溶劑中的反應(yīng)作為模型反應(yīng)進(jìn)行 a-膜凝乳蛋白酶在不同溶劑中催化效果的探究，對17種不同的溶劑進(jìn)行了比較，實驗結(jié)果 見表1。
[0032] 當(dāng)選擇溶劑如二甲基亞諷，N，N-二甲基甲酯胺運類極性非質(zhì)子性溶劑(表1，序號 1，2)的時候，并沒有觀察到反應(yīng)的發(fā)生。而在二氯甲燒，1,2-二氯乙燒中（表1，序號14,15) 反應(yīng)的活性明顯提高，均得到了73%的收率。在極性質(zhì)子性溶劑甲醇與乙醇中（表1，序號 16,17)反應(yīng)選擇性地生成了雙嗎I噪取代的產(chǎn)物?；诖税l(fā)現(xiàn)，對此溶劑控制產(chǎn)物生成的反 應(yīng)分別進(jìn)行了研究。綜上所述，選擇1，2-二氯乙燒作為單取代傅克反應(yīng)合成3-徑基氧化嗎I 噪衍生物的溶劑，而用甲醇為雙取代傅克反應(yīng)合成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的溶 劑。實驗結(jié)果見表1。
[0033] 表1溶劑的篩選a
[0034
[00351
[i
[0037] a反應(yīng)條件：說紅（0.30mmol)，嗎隙（0.45mmol)，去離子水（O.lmL)，溶劑（0.9mL)， 口-膜凝乳蛋白酶(〇.93kU，固體粉末)在25°C條件下攬拌反應(yīng)。b收率通過硅膠柱層析分離后 得到。
[0038] 二、含水量對a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的影響
[0039] 在之前大量的酶催化非專一性實驗中發(fā)現(xiàn)，有機溶劑中適量水的加入能很大程度 地影響酶催化反應(yīng)的效果，因此，研究了在甲醇中不同水的含量對a-膜凝乳蛋白酶催化說 紅和嗎I噪之間的傅克反應(yīng)的影響(表2)。在底物摩爾比為說紅:嗎I噪= 1:2的情況下，隨著含 水量從0增加到20% (表2,序號1-5)，雙取代產(chǎn)物的收率銳增到非常優(yōu)異的93%，而在繼續(xù) 增大含水量的時候反應(yīng)的收率開始降低(表2,序號6-10)。因此，20%被確定為該反應(yīng)的最 佳水含量。
[0040] 表2水含量對a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的影響a
[00'
[00'
[00'
[0044] a反應(yīng)條件:說紅(0.30mmol),嗎I噪(0.60mmol),去離子水(〇-〇. 60mL),甲醇（1. 〇- 0.4mL)，a-膜凝乳蛋白酶(〇.93kU，固體粉末)在25°C條件下攬拌反應(yīng)72h"b收率通過硅膠柱 層析分離后得到。
[0045] S、酶量對a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的影響
[0046] 為了最大限度地利用催化劑的催化效率，對反應(yīng)體系的酶量進(jìn)行了篩選，W期使 用最少的a-膜凝乳蛋白酶來催化此模型反應(yīng)。從雙取代反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)我們不難看出反應(yīng) 是發(fā)生在一當(dāng)量的說紅和二當(dāng)量的嗎I噪之間，因為說紅和嗎I噪摩爾比為1:2的時候已經(jīng)得 到了相當(dāng)滿意的收率，出于原子經(jīng)濟的考慮，就W此比例為最佳底物摩爾比進(jìn)行酶量的考 察(表3)。在進(jìn)行了一系列酶量的實驗之后我們看到在酶量為0.93kU時得到了最好的93% 的收率(表3,序號3)。所W選擇0.93kU的酶量為a-膜凝乳蛋白酶催化雙嗎I噪取代反應(yīng)最佳 催化劑量。
[0047] 表3酶量對a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的影響a
[00'
[00'
[00加]a反應(yīng)條件：說紅（0.30mmol),日引噪（0.60mmol),去離子水（0.2mL),甲醇（0.8mL), 口-膜凝乳蛋白酶(0.31-2.18^，固體粉末)在25°(：條件下攬拌反應(yīng)7211。叫欠率通過硅膠柱層 析分離后得到。
[0051 ]四、溫度對a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的影響
[0052] 鑒于溫度對于酶催化反應(yīng)的重要性，研究了溫度對a-膜凝乳蛋白酶催化的雙嗎I噪 取代反應(yīng)的影響(表4)。從表4中可W看到在15°C到30°C之間運幾個溫度條件下都得到了不 錯的收率(表4,序號1-4)，其中在30°C的時候得到了最佳的效果，收率達(dá)到了96% (表4,序 號4)。而在溫度繼續(xù)升高時，收率開始慢慢下降，在60°C時有一個急速的下降，下降到僅僅 8% (表4,序號7)。綜上結(jié)果，選定30°C為該反應(yīng)最適宜反應(yīng)溫度。
[0053 ] 表4溫度對a-膜凝a蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的影響a
[0化4
^AACC1
[0056] a 反應(yīng)條件：說紅（Q.sQmmol),日引噪（O.eOmmol),去離子水（0.2mL),甲醇（0.8mL), 口-膜凝乳蛋白酶(〇.93kU，固體粉末)在不同溫度攬拌反應(yīng)72h"b收率通過硅膠柱層析分離 后得到。
[0057] 五、a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的時間進(jìn)程
[0058] 在對a-膜凝乳蛋白酶催化的模型反應(yīng)進(jìn)行了一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化后，緊接著在 最優(yōu)條件下對模型反應(yīng)的時間進(jìn)程進(jìn)行了探索。進(jìn)一步研究了 a-膜凝乳蛋白酶催化雙嗎I噪 取代反應(yīng)的時間進(jìn)程（圖1)。從圖1中可W得出在反應(yīng)開始的初始階段，雙取代產(chǎn)物的收率 急速上升，在反應(yīng)的前72小時，收率隨著時間的增加而增加，并于72小時的時候達(dá)到最高的 96%，之后再延長反應(yīng)時間，收率并沒有繼續(xù)增加。
[0059] 六、a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的對照實驗
[0060] 為了驗證該雙取代反應(yīng)是由a-膜凝乳蛋白酶催化的，做了一系列對照實驗(表5)。 在用牛血清蛋白和雞蛋清蛋白代替a-膜凝乳蛋白酶催化反應(yīng)時，分別得到了 29%和16%的 收率(表5,序號12和13)，說明了反應(yīng)主要是由a-膜凝乳蛋白酶催化的，排除了是被非特異 性的蛋白表面氨基酸殘基催化的可能。然后依然分別用尿素和鹽酸脈對酶進(jìn)行了 2小時的 預(yù)處理，被尿素 W及鹽酸脈處理過的酶催化雙取代反應(yīng)僅僅分別得到了 24%與56%的收率 (表5,序號2和4)。而與此同時尿素與鹽酸脈單獨催化此反應(yīng)分別得到12%與40%的收率 (表5,序號3和5)，在對其做了酶活力的測定后顯示被尿素處理過的酶活力僅剩9.3U/mg，而 被鹽酸脈處理過的酶活力也降到17.2U/mg。因為尿素和鹽酸脈可W破壞酶的S維空間結(jié) 構(gòu)，所W可W認(rèn)為酶的=維結(jié)構(gòu)在催化該反應(yīng)中起到了至關(guān)重要的作用。接下來分別對活 性位點的^個不同的氨基酸殘基進(jìn)行了抑制處理。用DCC對a-膜凝乳蛋白酶進(jìn)行了 2小時的 處理后催化該反應(yīng)時，我們發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的收率降到了 14% (表5,序號6)，而單獨DCC催化 僅得到了痕量的雙取代產(chǎn)物(表5,序號7)。而被DPEC處理過的酶催化反應(yīng)得到了44%的收 率(表5,序號8)，但是DPEC本身可W催化得到30%的雙取代產(chǎn)物(表5,序號9)。經(jīng)過酶活力 的測定我們發(fā)現(xiàn)被DPEC處理過的酶活力僅剩8.3U/mg。最后，用PMSF對酶進(jìn)行了處理，同樣 得到了不錯的效果，此時被PMSF處理過的酶催化得到46 %的收率(表5，序號10 )，而PMSF單 獨可W催化得到40%的收率(表5,序號11)，對被PMSF處理過的酶進(jìn)行酶活測定后我們發(fā)現(xiàn) 其活力僅有4.4U/mg。綜上所述，可W認(rèn)為是a-膜凝乳蛋白酶催化了說紅和嗎I噪間的雙取代
[00 反應(yīng)。[0061 ] 表5a-膜凝a蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的對照連騎a
[00
[00
[00化]a反應(yīng)條件:說紅(0.3〇mm〇 1)，日引噪(0.60mmo 1)，去離子水(0.2mL)，甲醇(0.8mL)， 曰-膜凝乳蛋白酶(〇.93kU，固體粉末)在30°C條件下攬拌反應(yīng)。b收率通過硅膠柱層析分離后 得到。e活力定義:在溫度為25°C，抑為7.8的條件下，每分鐘水解化molN-苯甲酯-レ酪氨酸 乙醋的酶量為lU"d將〇.93kU的酶溶于8M的尿素溶液(將480mg尿素溶于ImL去離子水中）于 室溫下攬拌處理2小時后將水通過凍干除去。e將〇.93kU的酶溶于6mM的鹽酸脈溶液（將 573mg鹽酸脈溶于ImL去離子水中）于室溫下攬拌處理2小時后將水通過凍干除去。f將 0.93kU的酶溶于ImM的DCC溶液(將206mg DCC溶于ImL去離子水中）于室溫下攬拌處理2小時 后將水通過凍干除去。g將0.93kU的酶溶于0.3mM的DEPC溶液(將43.4化DEPC溶于1血抑為 8.04的憐酸緩沖液中）于室溫下攬拌處理2小時后將水通過凍干除去。h將〇.93kU的酶溶于 0.6mM的PMSF溶液(將105mg PMSF溶于ImL四氨巧喃中）于室溫下攬拌處理2小時后將有機溶 劑旋干。
[0066] 屯、a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的底物擴展
[0067] 在對反應(yīng)的條件進(jìn)行了一系列優(yōu)化之后，為了驗證a-膜凝乳蛋白酶對催化運類型 反應(yīng)的底物適應(yīng)性，考察了多種不同取代基和不同取代位置的說紅和嗎I噪之間的反應(yīng)。如 表6與圖2所示，a-膜凝乳蛋白酶作為一個高效的催化劑催化得到了對應(yīng)的多種不同取代的 3,3-二嗎I噪基氧化二酬的產(chǎn)物，并獲得了良好的收率。當(dāng)說紅的1位被甲基取代的時候與具 有不同取代基的嗎I噪都顯示出良好的反應(yīng)性能(表6,序號4，13和14)。當(dāng)說紅的5位為吸電 子取代基的時候(表6,序號3，7,12,15,17和18)，與5位具有吸電子和供電子的嗎I噪大都表 現(xiàn)出良好到優(yōu)秀的反應(yīng)效果，其中（表6,序號3,12，15,19和21)得到了非常好的收率。當(dāng)說 紅的5位為供電子基的時候得到了非常好的反應(yīng)效果(表6,序號11和23)。需要注意的是當(dāng) 嗎I噪的1位被甲基取代后，與不同類型的說紅都顯示出相對較差的反應(yīng)活性(表6,序號5-7， 16,20和22)。此外，我們擴展了說紅跟2-甲基嗎I噪的雙取代傅克反應(yīng)，經(jīng)過72小時的反應(yīng) 后，得到了 85%的收率。綜合底物的收率，a-膜凝乳蛋白酶對發(fā)生在甲醇中的雙取代傅克反 應(yīng)表現(xiàn)出了非常出色的催化能力。
[0068] 表6 a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)的底物擴展a
[006
[0070]
[(
[0072] a反應(yīng)條件：1 (0.30mmol),2(0.60mmol),去離子水(0.2mL),甲醇(0.8mL) ,a-膜凝 乳蛋白酶(〇.93kU，固體粉末)在30°C條件下攬拌反應(yīng)。b收率通過硅膠柱層析分離后得到。
[0073] 八、a-膜凝乳蛋白酶催化傅克反應(yīng)的對比實驗與可能的機理
[0074] 為了確定在生成雙取代反應(yīng)的第二步中酶是否參與了反應(yīng)，做了如圖3所示的對 比實驗。在30°C下，將單取代的產(chǎn)物3a與嗎I噪W摩爾比1:1的比例加入到甲醇與水的混合溶 劑中，然后分別用加入酶與不加入酶做對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有酶和其他催化劑加入的情況 下，并不能自發(fā)地生成雙取代的4a，而在加入酶的反應(yīng)中我們得到了 97%的收率，由此可W 斷定酶在第二步嗎I噪基的取代中也參與了反應(yīng)。
[0075] 在確定了 a-膜凝乳蛋白酶參與了每一步反應(yīng)W及前面的一系列對照實驗之后，基 于曰-膜凝乳蛋白酶的活性中屯、，我們提出了一個a-膜凝乳蛋白酶催化說紅與嗎I噪間傅克反 應(yīng)可能的催化機理。如圖4所示，首先，說紅中3位的幾基被a-膜凝乳蛋白酶活性位點中Asp- His-Ser催化S聯(lián)結(jié)構(gòu)中的195位的絲氨酸活化，然后質(zhì)子化的幾基被富電子的嗎I噪進(jìn)攻， 形成一個締胺正離子的中間體，在絲氨酸中氧負(fù)離子的作用下脫去質(zhì)子，得到單取代的氧 化嗎I噪。在極性質(zhì)子性溶劑甲醇中，單取代的產(chǎn)物中徑基被活潑質(zhì)子奪走生成一分子水，然 后生成亞胺離子，經(jīng)過分子間的亞胺締胺互變，得到了一個新的締胺正離子，然后又一分子 的嗎I噪進(jìn)攻此中間體，形成新的締胺正離子，再次通過絲氨酸中氧負(fù)離子奪去中間體中的 質(zhì)子，最后從a-膜凝乳蛋白酶中脫落得到最終的雙嗎I噪基取代的氧化嗎I噪。
[0076] 九、a-膜凝乳蛋白酶催化的傅克反應(yīng)生成雙嗎I噪基-二氨嗎I噪-2-酬類化合物的實 驗
[0077] 根據(jù)上述優(yōu)化條件獲得a-膜凝乳蛋白酶催化通式1與通式2反應(yīng)生成雙嗎I噪基-二 氨嗎I噪-2-酬類化合物（圖5)，其最佳條件為:在lOmL的圓底燒瓶中依次加入0.3mmol通式1 的化合物，0.6mmol通式2的化合物，0.8血甲醇，0.2mL去離子水，0.93WJa-膜凝乳蛋白酶，在 30°C下攬拌反應(yīng)，用薄層色譜進(jìn)行反應(yīng)的監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，將酶過濾掉，用乙酸乙醋洗涂 濾餅使得產(chǎn)品都溶于濾液中，隨后用無水硫酸鋼干燥濾液，將濾液濃縮后得粗產(chǎn)品，然后將 粗產(chǎn)品通過快速柱色譜法純化得到雙取代目標(biāo)產(chǎn)物(石油酸:乙酸乙醋=1:1-3:1)。
[0078] 獲得的產(chǎn)物經(jīng)氨核磁共振波譜法檢測，數(shù)據(jù)如下：
[0079] 從會物iM。、.
[0080]
[0081 ] 1h 醒R(600MHz，DMS0-d6)Sl0.95(s，2H)，10.59(s，lH)，7.37(d，J = 7.7Hz，2H), 7.25-7.24(m,4H),7.03-6.99(m,3H),6.96-6.93(m,lH),6.87(s,2H),6.82-6.80(t J = 6.8&6.7,2扣.1化 NMR(150MHz，DMS0-d6)Sl79.30，141.85，137.47，135.16，128.31，126.26, 125.41,124.80,121.95,121.44,121.30,118.74,114.90,112.10,110.08,53.14.
[0082]化合物(4b):
[00^
[0084] 1h 醒R(600MHz，DMS0-d6)Sll.02(s，2H)，10.68(s，lH)，7.39(d，J = 8.1Hz，2H), 7.27(d J = 8.1Hz，2H)，7.11-6.98(m，5H)，6.94(d J = 2.2Hz，2H)，6.84(t J = 7.細(xì)z，2H) .13c 醒R(150MHz，DMS0-d6)Sl79.21，159.18，157.61，137.49，136.91，126.10，124.94, 121.54,121.12,118.89,114.68,114.58,114.25,113.00,112.84,112.19,110.86,53.67.
[0085] 化合物(4c):
[0086]
[0087] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.：M(s，lH)，11.10(s，2H)，8.25(dd，J = 8.7,2.3Hz， lH)，8.02(d，J = 2.2Hz，lH)，7.41(d，J = 8.2Hz，2H)，7.24(dd，J=19.4,8.4Hz，3H)，7.06(t， J = 7.細(xì)z，2H)，7.00(d，J = 2.5Hz，2H)，6.86(t，J = 7.6Hz，2H).Uc醒R(150MHz，DMS0-d6)S 179.39,148.30,142.74,137.55,135.81,125.91,125.10,121.69,120.82,120.58,119.07, 113.37,112.:34,110.39,53.08.
[008引化合物(4d):
[OC
[0090] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.03(s，2H)，7.42(d，J = 8.1Hz，2H)，7.37(dd，J = 16.6,7.8Hz，2H)，7.26(d J = 8.1Hz，2H)，7.19(d J = 7.8Hz，lH)，7.07(dd J=14.2,7.1Hz, 3H)，6.93(d，J = 2.4Hz，2H)，6.86(t，J = 7.細(xì)z，2H)，3.31(s，3H).UCNMR(150MHz，DMS0-d6) 5177.43,143.26,137.48,134.24,128.45,126.17,125.08,124.83,122.62,121.46, 121.20,118.80,114.64,112.11,109.09,52.70,26.71.
[00川化合物（4e):
[0092]
[0093] 1h 醒R(600MHz，DMS0-d6)Sl0.59(s，lH)，7.37(d，J = 8.3Hz，2H)，7.25-7.20(m, 4H)，7.08(t，J = 7.細(xì)z，2H)，6.98(d，J = 7.7Hz，lH)，6.92(t，J = 7.5Hz，lH)，6.88(s，2H)， 6.83(t，J=7.5Hz，2H)，3.70(s，6H).Uc 醒R(150MHz，DMS0-d6)Sl79.00，141.76，137.83， 134.99,128.94,128.35,126.53,125.36,122.01,121.47,118.86(s),113.99,110.14, 52.89,32.80.
[0094] 化合物(4f):
[0095]
[0096] iHMlR(600MHz，DMS0-d6)Sl0.44(s，lH)，7.36(d，J = 8.3Hz，2H)，7.26(d，J = 8.1Hz，2H)，7.08(t，J = 7.6Hz，2H)，6.91(d，J = 7.6Hz，3H)，6.82(ddd，J = 12.1，10.9, 5.0化，4扣，3.70(3，細(xì)），3.60(3,3扣.1化醒尺（1501化，0150-(16)8178.88，155.19，137.85， 136.33,135.14,129.00,126.54,121.49,118.87,113.98,112.66,110.37,110.20,55.80， 53.37,32.80.
[0097] 化合物(4g):
[0098
[0099] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sl0.83(s，lH)，7.44(dd，J = 8.3，1.8Hz，lH)，7.42-7.35 (m，3H)，7.29(d，J = 8.1Hz，2H)，7.12(t，J = 7.6Hz，2H)，7.01(d，J = 8.3Hz，lH)，6.97(s, 2H)，6.89(t，J = 7.5Hz，2H)，3.70(s，6H).i3CMlR(150MHz，DMS0-d6)Sl78.58，141.16， 137.90,137.39,131.26,129.05,127.89,126.39,121.72,121.23,119.10,113.79,113.26, 112.22,110.36,53.19,32.82.
[0100] 化合物(4h):
[0101：
[0102] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sl0.88(d，J=18.3Hz，2H),10.56(s，lH),7.31-7.16(m, 4H)，6.99(d，J = 7.7Hz，lH)，6.96-6.85(m，3H)，6.76(d，J = 8.1Hz，lH)，6.71-6.61(m，2H)， 6.53(d，J = 8. IHz'lH)，2.12(s，3H)，1.99(s，3H).i3c 匪R(150MHz，DMS0-d6)Sl79.83, 141.75,136.11,135.50,134.42,132.53,128.25,127.63,125.97,121.72,120.25,120.22, 120.13,118.43,110.98,110.82,109.93,52.99,13.66,13.48.
[0103] 化合物(4i):
[0104]
[010引 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.l6(s，2H)，10.74(s，lH)，7.42(dd，J = 8.8,4.7Hz， 2H)，7.28(dd J = 9.8,7.8Hz，2H)，7.07(d，J = 7.7Hz，lH)，7.04(d J = 2.5Hz，2H)，7.02- 6.89(m，5H).Uc NMR(150MHz，DMS0-d6)Sl79.08，157.54，156.01，141.79，l：M.43，134.20， 128.58.126.80.126.35.125.39.122.21.114.81.113.16.110.29.109.90.109.73.105.74, 105.58,52.79.
[01061 化會物I Ml-').
[0107
[0108」MKCt300Mhz,DMSU-d6；610.Y9U,2H),10.58(s,lH),7.26-7.20(m,4H),7.00(d, J = 7.7Hz，lH)，6.94(t，J = 7.甜z，lH)，6.86(s，2H)，6.72-6.67(m，4H)，3.52(s，細(xì)）.l3CNMR (150MHz，DMS0-d6)8179.23,152.94,141.93,135.05,132.69,128.28,126.63,125.63， 125.44,121.94,114.17,112.51,110.93,109.91,103.90,55.64,53.02.
[0109] '1-八
[0110]
[0111] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.29(s，2H),10.81(s，lH)，7.47-7.42(m，4H)，7.30(t, J = 7.6Hz，lH) ,7.25-7.21 (m，3H) ,7.10 (d，J = 7.7Hz，lH) ,7.03-7.01 (m，3H) .13c 匪 R (150MHz，DMS0-d6) 8179.01，141.74,136.25,1:34.15,128.74,127.84,126.51,125.38， 124.18.123.24.122.31.114.37.111.66.110.38.52.74.
[0112] 化合物（41)，
[0113
[0114] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.21 (s，2H), 10.77(s，lH)，7.42(dt，J = 22.1,11.1Hz, 2H)，7.12(t，J = 8.9Hz，2H)，7.06(d，J=12.2Hz，3H)，6.94(dd，J=15.0,8.9Hz，4H).Uc NMR (150MHz，DMS0-d6)8179.00,159.29,157.65,156.06,137.99,136.08,134.19,126.92， 126.17,115.07,114.92,114.16,113.29,113.22,112.97,111.12,110.00,109.83,105.59, 105.43,53.29.
[011引化合物(4m):
[0116
[0117] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sl0.89(s，2H)，10.81(s，lH)，7.44(dd，J = 8.3，l.細(xì)z， lH)，7.32(d J = 8.9Hz，3H)，7.01(d J = 8.3Hz，lH)，6.95(d J = 2.3Hz，2H)，6.76(dd J = 8.8,2.1Hz，2H)，6.71(s，2H)，3.56(s，6H).1化匪R(150MHz，DMS0-d6)Sl78.85，153.16， 141.33,137.43,132.77,131.18,127.99,126.47,125.83,113.69,113.43,112.77,112.08, 111.14,103.69,55.72,53.33.
[011引化合物(4n):
[0119]
[0120] iHMlR(600MHz，DMS0-d6)Sl0.94(s，2H)，7.39(d，J = 8.3Hz，4H)，7.17(d，J = 6.9Hz，lH)，7.06(d，J = 27.3Hz，3H)，6.82(d，J=15.3Hz，4H)，3.61(s，細(xì)），3.33(s，3H).Uc NMR(150MHz,DMS0-d6)5l77.63,153.18,143.42,134.25,132.84,128.54,126.68,125.80, 125.25,122.77,114.10,112.72,111.26,108.97,103.73,55.63,52.77,26.63.
[0121] 化合物(4o):
[0122]
[0123] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.22(s，2H)，7.45(dd，J = 9.1，4.4Hz，2H)，7.36(dd，J = 11.0,7.6Hz，2H)，7.17(d J = 7.7Hz，lH)，7.06(d J = 8.5Hz，3H)，6.94(d J = 8.7Hz，4H), 3.30(s，3H).Uc NMR(150MHz，DMS0-d6)Sl77.23，157.60，156.07，143.19，l：M.24，133.58， 128.71,126.85,126. :34,125.07,122.89,114.61,113.23,109.99,109.81,109.29,105.70， 105.54,52.40,26.71.
[0124] 化合物(4p):
[01
[0126] 1h 醒R(600MHz，DMS0-d6)Sl0.92(s，2H)，10.75(s，lH)，7.35(d，J = 8.5Hz，2H), 7.16-7.05(m，3H)，7.01(d，J=1.9Hz，2H)，6.79(d，J = 8.7Hz，4H)，3.60(s，6H) .1化醒R (150MHz，DMS0-d6) 8179.:34,159.26,157.69,153.16,138.21,136.84,132.81,126.56， 125.84,114.79,114.64,113.63,113.04,112.88,112.72,111.12,110.82,103.85,55.70, 53.67.
[0127] 化合物(4q):
[012f
[01 巧]1h 匪R(600MHz，DMSO-ds)s 10.78(s，IH)，7.39(ddd，J= 10.7，8.0，3.2Hz，4H)， 7.19-7.11(m，4H)，7.11-7.05(m，lH)，7.03(d，J = 3.6Hz，2H)，6.93(td，J = 7.4,3.8Hz，2H), 3.72(s，6H).Uc NMR(150MHz，DMS0-d6)Sl79.04，159.25，157.68，138.09，137.93，136.78， 129.14,126.50,121.72,121.36,119.10,114.87,114.72,113.47,113.08,112.92,110.96, 110.31,53.54,32.79.
[01301 從合蜘一.
[0131
[0132] NMR(600MHz,DMS0-d6)5ll.43(s,lH),11.29(s,2H),8.27(ddJ = 8.7,2.0Hz, lH)，8.04(s，lH)，7.44(dd，J = 9.2,4.6Hz，2H)，7.26(d，J = 8.7Hz，lH)，7.14(d，J = 2.0Hz， 2H)，6.94(t，J = 8.5Hz，4H). 1化 NMR( 150MHz，DMS0-d6)Sl79.20，157.65，156.12，148.15， 142.95,135.07,1:34.27,127.10,126.02,120.64,113.64,113.26,110.59,110.20,110.02， 105.34,105.18,52.71.
[0133] 化合物(4s):
[0134
[013引 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.39(s，lH)，10.98(s，2H)，8.27(dd，J = 8.6，l.Wz， lH)，8.07(d J=1.5Hz，lH)，7.34(d J = 8.7Hz，2H)，7.25(d J = 8.6Hz，lH)，7.02(d J = 2.2Hz，2H)，6.77(d，J=8.8Hz，2H)，6.74(s，2H)，3.58(s，6H).Uc NMR(150MHz，DMS0-d6)5 179.43,153.24,148.36,142.77,135.75,132.84,126.36,125.91,120.60,112.89,112.70, 111.28,110.30,103.46,55.70,53.04.
[0136]化合物(4t):
[01
[013引 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.24(s，2H)，10.92(s，lH)，7.46(dd，J = 8.2,4.4Hz， 2H)，7.34(d J = 8.0Hz，lH)，7.30(s，lH)，7.10(d J = 8.甜z，3H)，7.00(dJ=10.2Hz，2H), 6.95( t，J = 8.6Hz，2H) ."C 匪 R( 150MHz，DMS0-d6)Sl78.80,157.66,156.13,140.74， 136.40,134.24,128.61,126.97,126.36,126.19,125.26,114.07,113.34,111.85,110.00， 109.91,105.59,105.43,53.10.
[0139]化合物(4u):
[0140；
[0141] 巧醒 R(600MHz, DMS0-d6)Sl0.82(s，1H), 7.41 (t，J= 12.3Hz，2H), 7.31 (dd，J = 15.1，8.3Hz，3H)，7.26(s，lH)，7.12(t，J = 7.甜z，2H)，7.06(d，J = 8.3Hz，lH)，6.98(s，2H)， 6.90(t，J=7.4Hz，2H)，3.71(s，6H).Uc 醒R(150MHz，DMS0-d6)Sl78.70，140.75，137.90， 137.01,129.05,128.40,126.40,126.08,125.21,121.71,121.24,119.10,113.26,111.66, 110.35,53.23,32.82.
[0142] /k厶獻(xiàn)-
[0143]
[0144] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.l9(s，2H)，10.85(s，lH)，7.47(dd，J = 8.3，1.7Hz， lH)，7.41(dt，J=14.3,7.2Hz，2H)，7.33(d，J=1.4Hz，lH)，7.02(d，J = 7.9Hz，3H)，6.95- 6.85(m，4H).Uc NMR(150MHz，DMS0-d6)Sl78.51，157.55，156.02，141.11，136.70，134.16， 131.45,127.86,126.90,126.07,114.08,113.31,112.35,110.02,109.85,105.46,105.30， 52.94.
[0145] 化合物(4w):
[01
[0147] 1h NMR(600MHz，DMS0-d6)Sll.37(s，lH)，8.27(dd，J = 8.7,2.2Hz，lH)，8.04(d，J = 2. OHz，IH)，7.40(dd J= 17.5，9.9Hz，2H)，7.30( t J = 7.5Hz，2H)，7.23(d J = 8.7Hz，IH)， 7.12(t，J = 7.7Hz，2H)，7.04(s，2H)，6.90(t，J = 7.細(xì)z，2H)，3.73(s，6H).UCNMR(150MHz， DMSO-de)5179.18,148.23,142.79,137.96,135.66,129.24,126.26,125.95,121.82, 121.02,120.65,119.24,112.45,110.46,52.89,32.85.
[014引化合物(4x):
[0149；
[0150] 1h 醒R(600MHz，DMS0-d6)Sl0.87(s，2H)，10.55(s，lH)，7.36(d，J = 8.7Hz，2H), 7.02(d，J = 7.2Hz，3H)，6.93-6.86(m，2H)，6.85(s，2H)，6.80(d，J = 8.細(xì)z，2H)，3.64(d，J = 12.1Hz，3H)，3.60(s，6H).Uc 醒R(150MHz，DMS0-d6)Sl79.31，155.30，153.10，136.47, 135.41.132.83.126.73.125.81.114.26.113.00. 111.03.110.35.104.07.55.76.53.63.
[0151] 化合物（4z):
[0152]
[015；3] 11 …"i、、u………，…"w u。/?！?…(d，J = 22.8Hz，2H)，10.71(s，lH)，7.36(d，J = 8.3Hz，2H)，7.33(d J = 7.4Hz，lH)，7.29(t J = 7.5Hz，lH)，7.22(s，2H)，7.11(d J = 7.7Hz, lH)，7.00(t，J = 7.4Hz，lH)，6.94(t，J = 9.細(xì)z，4H)，2.31(s，6H).UCNMR(150MHz，DMS0-d6) 5179.58.141.94.136.00. 135.28.128.29.127.00.126.55.125.52.125.12.123.18, 121.96,121.01，114.46,111.90,110.07,53.28,21.99.
[0154]最后說明的是，W上優(yōu)選實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W在 形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. a-胰凝乳蛋白酶在甲醇溶液或乙醇溶液中催化通式1和通式2的傅克反應(yīng)生成雙吲 哚基-二氫吲哚-2-酮類化合物中的應(yīng)用：R1任選為H或甲基;R2任選為H、F、Cl、Br、硝基、甲基或甲氧基;R3任選為H或甲基;R 4任選 為H、F、Br、甲基或甲氧基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述R1任選為H或甲基;R2任選為H、F、Br、硝 基或甲氧基;R 3為H;R4任選為H、F、甲基或甲氧基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述R1任選為H或甲基;R2任選為H、F或甲氧 基;R 3為H;R4任選為H、F、甲基或甲氧基。4. 制備雙吲哚基-二氫吲哚-2-酮類化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟： 以通式1、通式2為底物，a-胰凝乳蛋白酶為催化劑，甲醇溶液或乙醇溶液為溶劑，在25 ~30°C下攪拌反應(yīng)，制得雙吲哚基-二氫吲哚-2-酮類化合物；R1任選為H或甲基;R2任選為H、F、Cl、Br、硝基、甲基或甲氧基;R3任選為H或甲基;R 4任選 為H、F、Br、甲基或甲氧基。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述R1任選為H或甲基;R2任選為H、F、Br、硝 基或甲氧基;R 3為H;R4任選為H、F、甲基或甲氧基。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述R1任選為H或甲基;R2任選為H、F或甲氧 基;R 3為H;R4任選為H、F、甲基或甲氧基。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述甲醇溶液或乙醇溶液為含體積分?jǐn)?shù)15 ~30 %水的溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述通式1和通式2的摩爾比為1:2。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:a-胰凝乳蛋白酶的酶量為〇. 93~1.87kU。10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：制備雙吲哚基-二氫吲哚-2-酮類化合物 過程中監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完成后過濾掉胰凝乳蛋白酶，用乙酸乙酯洗滌，使產(chǎn)品完全溶 于濾液中，用無水硫酸鈉干燥濾液，將濾液濃縮，濃縮物以乙酸乙酯/石油醚為淋洗劑通過 快速柱色譜法純化得到目標(biāo)產(chǎn)物。
【文檔編號】C12P17/16GK106047959SQ201610505290
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】官智, 薛靖文
【申請人】西南大學(xué)