一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法，鈍齒棒桿菌的NCgl1221基因被敲除且同時(shí)增加了一個(gè)帶啟動(dòng)子的lysE基因，使得谷氨酸只能進(jìn)不能出且更多的精氨酸可以輸送至細(xì)胞外，同時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中外添加谷氨酸，使得合成精氨酸有更多的前體物質(zhì)，從而大幅度提高精氨酸的產(chǎn)量。
【專利說(shuō)明】
-種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心精氨酸是一種含有脈基的堿性氨基酸，在哺乳動(dòng)物中是半必需或條件性必需氨 基酸。近年來(lái)研究顯示，L-Arg能促進(jìn)各種免疫分子的合成從而可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn) 尿液循環(huán)并降低血液中氨的含量，同時(shí)作為生成NO的前體代謝產(chǎn)物，L-Arg還具備放松和擴(kuò) 張血管等重要功能。因此，L-Arg在醫(yī)藥和食品方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，備受國(guó)內(nèi)外研發(fā)和 生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的關(guān)注。目前，全世界レArg年需求量在15000噸W上，而實(shí)際年產(chǎn)量卻不到8000 噸，生產(chǎn)商主要集中在日本、美國(guó)和歐洲等國(guó)家，L-Arg在我國(guó)還主要依賴進(jìn)口，是藥用氨基 酸生產(chǎn)的瓶頸，每年在進(jìn)口L-Arg運(yùn)一個(gè)產(chǎn)品上的費(fèi)用達(dá)4到5億元人民幣，所W加強(qiáng)L-Arg 的生產(chǎn)研究是很有現(xiàn)實(shí)意義的。
[0003] 在精氨酸合成途徑中，谷氨酸是合成精氨酸的前體物質(zhì)，其經(jīng)歷了8種酶的催化后 才形成精氨酸，因此提高谷氨酸的供給會(huì)達(dá)到提高精氨酸的產(chǎn)量;但很多科研工作者發(fā)現(xiàn) 外添加谷氨酸并不能提高精氨酸的產(chǎn)量。而我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只要將微生物細(xì)胞膜上運(yùn)輸 谷氨酸至胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因敲除，可W達(dá)到提高精氨酸產(chǎn)量的目的，且在細(xì)胞體外 添加的谷氨酸可W進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，從而進(jìn)一步提高精氨酸產(chǎn)量;同時(shí)，為及時(shí)將合成的精氨 酸運(yùn)輸出細(xì)胞外，本發(fā)明過(guò)量表達(dá)了精氨酸運(yùn)輸?shù)鞍?，其過(guò)量表達(dá)進(jìn)一步提高了精氨酸產(chǎn) 量。即敲除谷氨酸運(yùn)輸?shù)鞍祝訌?qiáng)精氨酸運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)，在培養(yǎng)基中添加外源性谷氨酸， 則可W使微生物成為一個(gè)將谷氨酸轉(zhuǎn)換為精氨酸的載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法，將微生物細(xì)胞 膜上運(yùn)輸谷氨酸至胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因敲除，則可W使胞外的谷氨酸運(yùn)輸至胞內(nèi)，從 而達(dá)到提高精氨酸產(chǎn)量的目的；且通過(guò)過(guò)量表達(dá)精氨酸運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)量及時(shí)運(yùn)出由谷氨 酸合成的精氨酸進(jìn)一步提高精氨酸產(chǎn)量。
[0005] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)步驟為，1、谷氨酸運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基因 NCgll221同源臂的構(gòu)建及 其敲除質(zhì)粒的構(gòu)建:敲除純齒棒桿菌NCgll221基因的上下同源臂引物并分別在上下臂引物 的5 '端加上化ndllI和Xbal限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增NCgl 1221的上下同源 臂，采用DNA純化試劑盒純化其上下同源臂，等摩爾混合后進(jìn)行重疊 PCR獲得NCgll221基因 敲除同源臂;通過(guò)化ndin和Xbal雙酶切，將NCgll221基因敲除同源臂克隆至薦糖致死質(zhì)粒 pKlSmobsacB中，獲得敲除質(zhì)粒地ISmobsacB-A NCgll221，將其電轉(zhuǎn)至純齒棒桿菌并通過(guò)二 次同源重組獲得純齒棒桿菌ANCgll221缺失株；
[0006] 2、在敲除NCgll221的位置，插入lysE基因過(guò)表達(dá)精氨酸運(yùn)輸?shù)鞍祝涸O(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR擴(kuò)增NCg 11221缺失的上下同源臂，擴(kuò)增1 ysE基因的上游引物的5 '端修飾Ptac啟動(dòng)子及 核糖體結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)PCR獲得帶強(qiáng)啟動(dòng)子的lysE基因，通過(guò)重疊 PCR將lysE基因與 NCgll221缺失的上下同源臂連接后，克隆至薦糖致死質(zhì)粒地ISmobsacB中，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn) 至純齒棒桿菌并通過(guò)二次同源重組獲得純齒棒桿菌A NCgll221: : lysEtae;
[0007] 3、搖瓶發(fā)酵：在28~30°C種子培養(yǎng)基中活化純齒棒桿菌及純齒棒桿菌A NCgll221: :lysEtae，培養(yǎng)14~16h后W5%~10%v/v的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28~ 3(TC發(fā)酵生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期加入5%谷氨酸誘導(dǎo)高產(chǎn)精氨酸，其中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培 養(yǎng)基配方均如下：葡萄糖30g/L，玉米漿25g/L，硫酸錠45g/L，憐酸二氨鐘0.5g/L，MgS〇4 ? 7此0 0.5g/L，尿素1.5g/L，抑=7.2，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖120g/L，玉米漿25g/L，硫 酸錠45邑/1，憐酸二氨鐘0.05邑/1，1邑5〇4*7出0 0.5邑/1，30邑/1化0)3。
[0008] 所述純齒棒桿菌編碼谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NCgll221基因被敲除，編碼精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 lysE基因在基因組中的拷貝數(shù)增加了 1倍且其上游修飾了強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac。
[0009] 所述純齒棒桿菌培養(yǎng)至發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期添加谷氨酸。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明將純齒棒桿菌NCgll221基因敲除后，使細(xì)胞內(nèi)的谷 氨酸不能分泌到胞外，且通過(guò)細(xì)胞外添加谷氨酸，使其供應(yīng)給精氨酸合成途徑，同時(shí)，細(xì)胞 內(nèi)精氨酸濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)有影響，因此增加了精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LysE的表達(dá) 量，從而大幅度提高精氨酸產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為PCR方法擴(kuò)增敲除NCgll221上下同源臂及重疊 PCR圖。
[0012] 圖2為敲除NCgll221的單交換及雙交換子篩選的PCR圖。
[OOK]圖3為構(gòu)建過(guò)表達(dá)lysE的PCR圖。
[0014] 圖4為過(guò)表達(dá)lysE的單交換及雙交換子篩選的PCR圖。
[0015] 在圖1中，1為上臂片斷；2-3為下臂片斷;4-5為上下臂的重疊片斷;M為化2000標(biāo)準(zhǔn) 分子量。
[0016] 在圖2中，M為化2000標(biāo)準(zhǔn)分子量;1-2為單交換菌株;3-4為雙交換菌株;5為陰性對(duì) 照。
[0017]在圖3中，M為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，4,8化1為陰性對(duì)照;2-3為上臂;4-5為下臂；7 為lysE; 9-10為重疊 PCR產(chǎn)物:上臂-lysE-下臂。
[0018] 在圖4中，M為化2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，8為陰性對(duì)照；2-3為單交換子;4為陰性單交換 子;5為在載體的片段PCR結(jié)果;6-7為雙交換子。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合附圖1-4和實(shí)施例1-3詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明所具有的有益效果，旨在幫助閱 讀者更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，但不能對(duì)本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限定。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 重組菌純齒棒桿菌A NCgll221的構(gòu)建過(guò)程及在搖瓶規(guī)模下精氨酸生產(chǎn)的方法，包 括W下步驟：
[0022] (1)無(wú)痕敲除NCgll221質(zhì)粒的構(gòu)建及其重組菌的構(gòu)建:純齒棒桿菌（登錄號(hào):NZ_ AQPS01000045.1)中的NCgll221上下同源序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1，W純齒棒桿菌的 單菌落為PCR反應(yīng)模板，PCR反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性lOmin，95 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C 延伸40s，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸lOmin，擴(kuò)增出二條與預(yù)期大小相符的DM片段，參照 圖1所示，上下同源臂純化回收、等摩爾數(shù)混合后，再通過(guò)重疊 PCR反應(yīng)獲得敲除NCgll221重 疊片段，其PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性10min，95°C變性10s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，共 30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸lOmin，圖1泳道4-53為重疊 PCR結(jié)果，
[0023] 重組菌的構(gòu)建:將獲得的敲除NCgll221同源片段，通過(guò)化ndlll和Xbal雙酶切，克 隆至經(jīng)同樣雙酶切的薦糖致死質(zhì)粒pKlSmobsacB中，獲得敲除質(zhì)粒pKlSmobsacB- A NCgll221，并將電轉(zhuǎn)至宿主中，經(jīng)過(guò)了兩次交換過(guò)程(圖2為篩選雙單交換子電泳圖譜)獲得 重組菌純齒棒桿菌A NCgll221。
[0024] 表1本實(shí)驗(yàn)所用引物及序列
[0025] Tablel The primers and sequences used in this work
[0027]注:黑體表示酶切位點(diǎn)，下劃線表示重疊 PC則寸的互補(bǔ)序列。
[002引（2)純齒棒桿菌ANCgll221搖瓶發(fā)酵工藝:接種上述新鮮的重組菌單菌落于20mL 種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm活化16h，將活化的種子接種于30mL(250mL的錐形瓶)發(fā)酵培養(yǎng) 基中發(fā)酵生長(zhǎng)12化，收集菌液，采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析精氨酸產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)精氨酸產(chǎn)量提 局了 10.6 %。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 重組菌純齒棒桿菌A NCgll221: : lysEtae的構(gòu)建過(guò)程及在搖瓶規(guī)模下精氨酸生產(chǎn) 的方法，包括W下步驟：
[0031] (1)在敲除NCgll221基因的位置添加一個(gè)lysE基因拷貝數(shù):設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn) 表1，其中1 ysE-F引物的5 '修飾了強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac，W純齒棒桿菌的單菌落獲得1 ysE基因的 PCR條件為:95°C預(yù)變性10min，95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，最后 在72°C延伸lOmin，擴(kuò)增出一條符合預(yù)期長(zhǎng)度的DNA片段(參照?qǐng)D3泳道7)，純化之，W純齒棒 桿菌的單菌落獲得與lysE基因連接的上下臂的PCR條件:95°C預(yù)變性10min，95°C變性30s， 55°C退火30s，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸lOmin，擴(kuò)增出二條符合預(yù)期長(zhǎng)度 的DNA片段(參照?qǐng)D3泳道2和4)，分別純化。最后通過(guò)重疊 PC時(shí)尋lysE基因與上下臂連接，其 PCR條件為:95°C預(yù)變性10min，95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，共30個(gè)循環(huán)，最后 在72°C延伸lOmin，獲得預(yù)期DNA片段(參照?qǐng)D3泳道9)，
[0032] 重組菌的構(gòu)建:將獲得的"上臂-lysE-下臂"同源片段與PMD18-T載體連接，陽(yáng)性克 隆子用化ndin和Xbal進(jìn)行雙酶切，酶切片段與經(jīng)同樣雙酶切的薦糖致死質(zhì)粒地ISmobsacB 連接后電轉(zhuǎn)至宿主中，經(jīng)過(guò)了兩次交換過(guò)程（圖4為篩選雙單交換子電泳圖譜)獲得重組菌 純齒棒桿菌 ANCgll221: :lysEtac;
[0033] (2)純齒棒桿菌ANCgll221::lysEtaK搖瓶發(fā)酵工藝:接種上述新鮮的重組菌單菌 落于20mL種子培養(yǎng)基中，30°C，20化pm活化16h，將活化的種子接種于30血(250mL的錐形瓶） 發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生長(zhǎng)12化，收集菌液，采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析精氨酸產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)精氨 酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高了 9.7%。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 添加不同濃度的谷氨酸對(duì)純齒棒桿菌A NCgll221: : lysEta。產(chǎn)精氨酸的影響：
[0036] 重組菌純齒棒桿菌A NCgll221: : lysEtae的構(gòu)建見(jiàn)實(shí)施例1和2。將純齒棒桿菌A NCgll221: :lysEta。的單菌落接種于20mL種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm活化16h后按2%接種 量接種于30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生長(zhǎng)36h后，分別加入3 %、5%、7.5%、10%和12.5%的谷 氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)72h后離屯、收集菌液，采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析發(fā)酵培養(yǎng)基中不同的 谷氨酸濃度對(duì)純齒棒桿菌A NCgll221: : lysEtae產(chǎn)精氨酸的影響，結(jié)果顯示，添加5%谷氨酸 于發(fā)酵培養(yǎng)基中最有利于精氨酸的積累。
[0037] 目前在國(guó)內(nèi)外，還未有關(guān)于敲除NCgll221、增加 lysE表達(dá)并在發(fā)酵培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)初期添加谷氨酸來(lái)提高精氨酸產(chǎn)量的報(bào)道。本發(fā)明在前期工作的基礎(chǔ)上，將上述方法用 于改造的純齒棒桿菌，成功地使之產(chǎn)精氨酸的能力提高了約60%。
[0038] W上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范 圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，（1)谷氨酸運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基 因 NCgll221同源臂的構(gòu)建及其敲除質(zhì)粒的構(gòu)建:敲除鈍齒棒桿菌NCgll221基因的上下同源 臂引物并分別在上下臂引物的5 '端加上HindllI和Xbal限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別通過(guò)PCR技 術(shù)擴(kuò)增NCgll221的上下同源臂，采用DNA純化試劑盒純化其上下同源臂，等摩爾混合后進(jìn)行 重疊 PCR獲得NCgll221基因敲除同源臂;通過(guò)Hindlll和Xbal雙酶切，將NCgll221基因敲除 同源臂克隆至鹿糖致死質(zhì)粒pK18mobsacB中，獲得敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-A NCgll221，將其 電轉(zhuǎn)至鈍齒棒桿菌并通過(guò)二次同源重組獲得鈍齒棒桿菌A NCgll221缺失株；（2)在敲除 NCgl 1221的位置，插入lysE基因過(guò)表達(dá)精氨酸運(yùn)輸?shù)鞍祝涸O(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增NCgl 1221 缺失的上下同源臂，擴(kuò)增lysE基因的上游引物的5 '端修飾Ptac啟動(dòng)子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)， 通過(guò)PCR獲得帶強(qiáng)啟動(dòng)子的lysE基因，通過(guò)重疊 PCR將lysE基因與NCgll221缺失的上下同源 臂連接后，克隆至蔗糖致死質(zhì)粒pKISmobsacB中，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至鈍齒棒桿菌并通過(guò)二次 同源重組獲得鈍齒棒桿菌Δ NCgl 1221: : lysEtae; (3)搖瓶發(fā)酵:在28~30 °C種子培養(yǎng)基中活 化鈍齒棒桿菌及鈍齒棒桿菌Δ NCgll221: : lysEtae，培養(yǎng)14~16h后以5%~10%v/v的接種 量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28~30°C發(fā)酵生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期加入5%谷氨酸誘導(dǎo)高產(chǎn)精 氨酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述 鈍齒棒桿菌編碼谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NCgll221基因被敲除，編碼精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lysE基因在基 因組中的拷貝數(shù)增加了 1倍且其上游修飾了強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種外添加谷氨酸提高精氨酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述 鈍齒棒桿菌培養(yǎng)至發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期添加谷氨酸。
【文檔編號(hào)】C12R1/15GK106047958SQ201610574061
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】陳雪嵐, 朱薔云, 賴木蘭, 熊勇華
【申請(qǐng)人】江西師范大學(xué)