一種榆黃蘑菌種鑒別的方法及專用dna條形碼片段的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了榆黃蘑菌種鑒別的方法及專用DNA條形碼片段。本發(fā)明提供了DNA條形碼片段或與所述DNA條形碼片段同源性大于99％的片段在鑒別或輔助鑒別榆黃蘑菌種中的應(yīng)用；所述DNA條形碼片段的核苷酸序列為序列3。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的榆黃蘑DNA條形碼片段，其可以用于鑒別榆黃蘑菌種，用該片段鑒別有利于縮短榆黃蘑菌種鑒定時(shí)間，提高鑒定準(zhǔn)確性。
【專利說(shuō)明】
一種榆黃蘑菌種鑒別的方法及專用DNA條形碼片段
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種榆黃蘑菌種鑒別的方法及專用DNA條形 碼片段。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界上最大的食用菌生產(chǎn)、消費(fèi)大國(guó)，年產(chǎn)量約占世界食用菌產(chǎn)量75%。榆 黃蘑味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中氨基酸含量尤 為豐富，且必需氨基酸含量高，屬高營(yíng)養(yǎng)、低熱量食品。長(zhǎng)期食用，有降低血壓、降低膽固醇 含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖癥患者的理想保健食品。榆黃蘑還具有滋補(bǔ) 強(qiáng)壯功效。不僅受國(guó)人喜愛(ài)，而且在國(guó)際市場(chǎng)較為搶手，生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)效益均顯著高于一般農(nóng) 產(chǎn)品。菌種在榆黃蘑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起著基礎(chǔ)性的、重要的、不可替代的作用。一些假冒偽劣 菌種充斥市場(chǎng)，嚴(yán)重?fù)p害產(chǎn)業(yè)發(fā)展。通過(guò)栽培試驗(yàn)檢測(cè)榆黃蘑菌種，耗時(shí)較多。
[0003] 因此，建立一種快速可靠的鑒定榆黃蘑菌種的方法迫在眉睫。DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列，對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，可實(shí)現(xiàn)對(duì)榆黃蘑菌種快速簡(jiǎn)便可靠的物種 鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA片段。
[0005] 本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1)或2)或3):
[0006] 1)、序列3所示的DNA片段；
[0007] 2)、序列3第21-381位核苷酸所示的DNA片段；
[0008] 3)、為與1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99%的片段。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述DNA片段的新用途。
[0010]本發(fā)明提供了所述DNA片段在鑒別或輔助鑒別榆黃蘑菌種中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明第3個(gè)目的是提供檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì) 的新用途。
[0012] 本發(fā)明提供了檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)在鑒別榆黃 蘑菌種中的應(yīng)用。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)為如下 1)或 2):
[0014] 1)用于擴(kuò)增所述DNA條形碼片段的引物對(duì)；
[0015] 2)含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。
[0016] 上述應(yīng)用中，所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子組成。
[0017]或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1。
[0018] 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。
[0019] 本發(fā)明第4個(gè)目的是提供一種鑒別或輔助鑒別榆黃蘑菌種的方法。
[0020] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有所述DNA片段;如果 含有，則待測(cè)樣品為或候選為榆黃蘑菌種;如果不含有，則待測(cè)樣品不為或候選不為榆黃蘑 菌種。
[0021] 上述方法中，
[0022] 所述檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有所述DNA片段的方法包括如下步驟：
[0023] 1)用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組 成的引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0024] 2)測(cè)序所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與所述DNA片段進(jìn)行比對(duì)，若 同源性大于99%，則待測(cè)樣品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，則待測(cè)樣品中 不含有所述DNA片段。
[0025]上述方法中，
[0026] 所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)樣品的基因組DNA。
[0027] 本發(fā)明第5個(gè)目的是提供檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)。
[0028] 本發(fā)明提供的檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)，其為如下 1)或 2):
[0029] 1)用于擴(kuò)增所述DNA條形碼片段的引物對(duì)；
[0030] 2)含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。
[0031] 上述物質(zhì)中，所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子組成。
[0032]或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1。
[0033] 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。
[0034] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，為克服栽培試驗(yàn)鑒定榆黃蘑菌種的缺陷，本發(fā)明提供了一種 榆黃蘑(Pleurotus 〇;11：1'；[110卩;[1631：118)菌種0嫩條形碼鑒定方法，可以快速準(zhǔn)確地鑒別榆黃 蘑菌種;采用榆黃蘑DNA條形碼片段，其可以用于鑒別榆黃蘑菌種，用該片段鑒別有利于縮 短榆黃蘑菌種鑒定時(shí)間，提高鑒定準(zhǔn)確性。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 實(shí)施例1、榆黃蘑菌種鑒別DNA條形碼片段的獲得及方法的建立
[0038] 1、榆黃蘑菌種的基因組DNA獲得
[0039]提取榆黃蘑菌種的基因組DNA。
[0040] 2、PCR 擴(kuò)增
[00411以上述1得到的基因組DNA為模板，用引物7 28F和引物1567R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0042] 728F: 5，-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3，（序列 1)
[0043] 1567R:5，-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3'（序列2)
[0044] 上述PCR擴(kuò)增體系為如下表1:
[0045] 表1為PCR反應(yīng)體系的組成(25yL)
[0047] 上述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，65°C退火55s，每個(gè)循環(huán)降低 1°C，72°C延伸9〇8，10個(gè)循環(huán);94°(：變性3〇8,55°(：退火558,72°(：延伸9〇8,36個(gè)循環(huán) ；最后72 °C7min〇
[0048] 得到大約850bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0049] 將大約850bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序，測(cè)序引物為728F和Ef jr;引物序列為： Efjr:5 '-TGYTCNCGRGTYTGNCCRTCYTT-3 '。
[0050]該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列3所示的核苷酸，其中序列3第1-20位為上游引物 728F，序列3第382-404位為下游引物Efjr的反向互補(bǔ)序列，該序列所示的片段或序列3第 21-381為榆黃蘑菌種鑒別DNA條形碼片段。
[0051 ]榆黃蘑菌種鑒別DNA條形碼片段可用于鑒別榆黃蘑菌種，具體方法如下：
[0052]檢測(cè)待測(cè)樣品的基因組中是否含有榆黃蘑標(biāo)準(zhǔn)鑒別DNA條形碼片段或含有與其同 源性在99%以上的片段，若含有，則待測(cè)樣品是榆黃蘑菌種，若不含有，則待測(cè)樣品不是榆 黃蘑菌種。
[0053]實(shí)施例2、鑒別榆黃蘑菌種 [0054] 1、本發(fā)明方法特異性檢測(cè)
[0055] 分別提取已知品種的榆黃蘑菌種、鮑魚(yú)^(Pleurotus abalonus)菌種的基因組 DNA〇
[0056] 以各品種的基因組DNA作為模板，用上述引物728F和1567R擴(kuò)增，得到各品種的PCR 產(chǎn)物。
[0057] 將各品種的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果如下：
[0058]已知品種的榆黃蘑菌種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列3(榆黃蘑菌種鑒別DNA條 形碼片段）。
[0059]已知品種的鮑魚(yú)菇菌種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列4(序列4第1-20位為上游 引物728F，序列4第385-407位為下游引物Efjr的反向互補(bǔ)序列）；
[0060]已知品種的榆黃蘑菌種用本發(fā)明方法也鑒別為榆黃蘑菌種；
[0061 ]已知品種的鮑魚(yú)菇菌種的PCR產(chǎn)物的序列4第21-384位核苷酸與榆黃蘑菌種鑒別 DNA條形碼片段序列3第21-381位核苷酸進(jìn)行比對(duì)，同源性為75.1%，已知品種的鮑魚(yú)菇菌 種用本發(fā)明方法鑒別不為榆黃蘑菌種。
[0062] 2、ITS鑒定與本發(fā)明方法比較
[0063] 分別提取已知品種的榆黃蘑菌種、鮑魚(yú)^(Pleurotus abalonus)菌種的基因組 DNA〇
[0064] 以各品種的基因組DNA作為模板，用上述引物ITS1和引物ITS4擴(kuò)增，得到各品種的 PCR產(chǎn)物。
[0065] ITS1:5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '
[0066] ITS4:5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
[0067] 上述PCR擴(kuò)增體系為表2:
[0068] 表2 PCR反應(yīng)體系的組成（25yL)
[0071] 上述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5min; 94 °C變性30s，53 °C退火30s，72 °C延伸30s， 30個(gè)循環(huán)；最后72°C10min。
[0072] 得到700bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0073]將700bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序，得到榆黃蘑菌種ITS序列（序列5,其中1-19 位為引物ITSl，655-674位為引物ITS4反向互補(bǔ)序列）與鮑魚(yú)菇菌種ITS序列（序列6,其中1-19位為引物ITSl，669-688位為引物ITS4反向互補(bǔ)序列）。
[0074] 序列5第20-654位與序列6第20-668位同源性為:80.2 %，異質(zhì)性為19.8 %，即榆黃 蘑菌種與鮑魚(yú)菇菌種ITS序列的異質(zhì)性為19.8%。而本方法得到的兩者同源性為75.1%，異 質(zhì)性為24.9%。靈敏度高于ITS序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DNA片段，為如下1)或2)或3): 1) 、序列3所示的DNA片段； 2) 、序列3第21-381位核苷酸所示的DNA片段； 3) 、為與1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99%的片段。2. 權(quán)利要求1所述的DNA片段在鑒別或輔助鑒別榆黃蘑菌種中的應(yīng)用。3. 檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有權(quán)利要求1所述DNA片段的物質(zhì)在鑒別榆黃蘑菌 種中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述物質(zhì)為如下1)或2): 1) 用于擴(kuò)增所述DNA片段的引物對(duì)； 2) 含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列2所不的單鏈DNA分子組成； 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1; 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。6. -種鑒別或輔助鑒別榆黃蘑菌種的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有 權(quán)利要求1所述DNA片段;如果含有，則待測(cè)樣品為或候選為榆黃蘑菌種；如果不含有，則待 測(cè)樣品不為或候選不為榆黃蘑菌種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于： 所述檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有權(quán)利要求1所述DNA片段的方法包括如下步驟： 1) 用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的 引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 2) 測(cè)序所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與所述DNA片段進(jìn)行比對(duì)，若同源 性大于99%，則待測(cè)樣品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，則待測(cè)樣品中不含 有所述DNA片段。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)樣品的基因組DNA。9. 檢測(cè)榆黃蘑菌種基因組中是否含有權(quán)利要求1所述DNA片段的物質(zhì)，其為如下1)或 2)： 1) 用于擴(kuò)增所述DNA片段的引物對(duì)； 2) 含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的物質(zhì)，其特征在于:所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列2所不的單鏈DNA分子組成； 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1; 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969893SQ201610555369
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】趙鵬, 周軍輝, 紀(jì)森鵬, 高興喜
【申請(qǐng)人】魯東大學(xué)