鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物與方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物與方法。本發(fā)明公開的成套引物，由成套引物甲和能擴(kuò)增大鴇線粒體DNA片段的引物對(duì)組成；大鴇線粒體DNA片段的序列為如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列23的核苷酸序列；A2)與A1)限定的DNA序列具有90％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；A3)在嚴(yán)格條件下與A1)限定的DNA序列雜交的由A1)衍生的DNA序列；成套引物甲由序列表中序列3?序列22所示的20條單鏈DNA組成。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的成套引物與方法可以用來鑒定大鴇間的親緣關(guān)系，為大鴇人工繁育和重引入過程中種源的選定、配對(duì)方案的制定、系譜的構(gòu)建提供技術(shù)支撐。
【專利說明】
鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物與方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大鴇(Otis tarda)隸屬鶴形目鴇科，是國際上高度關(guān)注的鳥類，而且是中國草原 地帶的旗艦物種和草原生態(tài)系統(tǒng)的指示物種。大鴇有兩個(gè)地理亞種，即指名亞種 (0· t · tarda)和東方亞種(0· t · dybowskii) (Palacin&Alonso，2008)，目前全世界大灣指名 亞種數(shù)量約為45000-51000只，而東方亞種卻不足1000只，其中逾一半以上片段化分布于中 國東北部，并在中國境內(nèi)完成生活史的各階段。非法獵捕、棲息地干擾和過度放牧等因素， 導(dǎo)致中國大鴇東方亞種的分布區(qū)退縮和種群數(shù)量銳減。人工繁育是大鴇迀地保護(hù)的有效途 徑之一，但近親繁殖影響了大鴇的種群健康，甚至?xí)l(fā)近交衰退。繁育過程中如何對(duì)大鴇 個(gè)體擇優(yōu)配對(duì)以避免近親繁殖，以及最大限度保持其遺傳多樣性，是繁育部門最為關(guān)心也 亟待解決的問題。通過分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)大鴇個(gè)體進(jìn)行遺傳變異檢測，并做親緣關(guān)系分析 和親權(quán)鑒定能為大鴇的配對(duì)篩選和系譜建立提供技術(shù)支持，但相關(guān)研究尚未見報(bào)道。
[0003] 對(duì)于具有復(fù)雜交配系統(tǒng)的瀕危動(dòng)物，依靠外形特征或行為學(xué)觀察確定配種個(gè)體或 鑒定親子關(guān)系，存在較大誤差?；谶@樣的誤差登記的系譜記錄，將會(huì)使誤差隨著繁殖代數(shù) 的增加呈幾何級(jí)數(shù)增大。線粒體0嫩(111；[1:0011011(11^310嫩，1]1丨0嫩)是細(xì)胞核外、線粒體內(nèi)的 遺傳物質(zhì)，具有母系遺傳的特征，即子代的線粒體DNA序列與母代的相同，而父代則對(duì)線粒 體DNA的遺傳不作貢獻(xiàn)。微衛(wèi)星DNA為核基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，為共顯性遺傳，被廣泛 應(yīng)用于評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性、分析個(gè)體間親緣關(guān)系以及鑒定親子關(guān)系。子代的微衛(wèi)星等位 基因一半來自于父代，一半來自于母代。線粒體DNA適用于排除母子關(guān)系，經(jīng)濟(jì)簡便，而微衛(wèi) 星DNA能夠確定父源關(guān)系，有效可靠。將這2種分子標(biāo)記結(jié)合起來運(yùn)用于親子鑒定，有助于制 定科學(xué)的配種方案、確定不明確的偷配或亂配行為，對(duì)于保護(hù)瀕危動(dòng)物遺傳資源具有極大 的理論和實(shí)踐意義。
[0004] 大鴇性情機(jī)警，應(yīng)激性強(qiáng)。傳統(tǒng)采血對(duì)其損傷較大甚至致死，且對(duì)于野生大鴇，采 集血樣有困難。糞便和/或羽毛等非損傷性樣品在許多瀕危動(dòng)物中已被用于親緣關(guān)系分析， 但由于所用的分子標(biāo)記具有物種特異性，且傳統(tǒng)PCR方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不及多重PCR方法經(jīng)濟(jì) 高效，因此，目前急需一種利用非損傷性取樣對(duì)大鴇進(jìn)行親緣關(guān)系分析和親權(quán)鑒定的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何對(duì)大鴇進(jìn)行親緣關(guān)系分析和親權(quán)鑒定。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的成 套引物。
[0007] 本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的成套引物，其名稱為成套引 物甲，是成套引物1和/或成套引物2;
[0008] 所述成套引物1由序列表中序列3-序列12所示的10條單鏈DNA組成;所述成套引物 2由序列表中序列13-序列22所示的10條單鏈DNA組成。
[0009] 其中，序列3和序列4所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列5和序列6所示的單鏈 DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列7和序列8所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列9和序列10所示的 單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列11和序列12所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列13和序列 14所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列15和序列16所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列 17和序列18所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)，序列19和序列20所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物 對(duì)，序列21和序列22所示的單鏈DNA組成一個(gè)引物對(duì)。
[0010]上述成套引物甲中，各單鏈DNA均可獨(dú)立包裝。各單鏈DNA的摩爾比可依據(jù)待測樣 本確定。各單鏈DNA的摩爾比可相同。
[0011] 上述成套引物甲中，各單鏈DNA的5'端均可被HEX、FAM或TET等熒光基團(tuán)標(biāo)記。在本 發(fā)明的實(shí)施例中，序列3、17和19所示的三條單鏈DNA的5 '端均由HEX標(biāo)記，序列5、9、11、13、 15和21所示的各單鏈DNA的5 '端均由FAM標(biāo)記，序列7所示的單鏈DNA的5 '端均由TET標(biāo)記。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的成套 引物。
[0013] 本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的成套引物，其名稱為成套引 物乙，由能擴(kuò)增下述al)、a2)或a3)的引物對(duì)與所述成套引物甲組成；
[0014] al)大鴇線粒體DNA片段；
[0015] a2)al)的任一片段；
[0016] a3)含有 al)的 DNA 片段；
[0017]所述大鴇線粒體DNA片段的序列為如下A1)、A2)或A3):
[0018] A1)序列表中序列23的核苷酸序列；
[0019] A2)與A1)限定的DNA序列具有90%或90%以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；
[0020] A3)在嚴(yán)格條件下與A1)限定的DNA序列雜交的由A1)衍生的DNA序列。
[0021] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的序列23的核苷酸序列具有90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可 以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件(如MEGA 5.0)，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的 同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0022]上述成套引物乙中，A2)所述序列具體可為序列表中序列24-序列28中任一序列。 [0023]上述成套引物乙中，所述嚴(yán)格條件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0024] 上述90%或90%以上同一性，可為90%或95%以上的同一性。
[0025] 上述成套引物乙中，所述引物對(duì)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組 成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，利用所述引物對(duì)對(duì)大鴇基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物序列 為序列24-序列28，該序列為線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列。
[0026]上述成套引物乙中，各單鏈DNA均可獨(dú)立包裝。所述成套引物甲與所述引物對(duì)的摩 爾比可依據(jù)待測樣本確定。所述成套引物甲與所述引物對(duì)中的各單鏈DNA的摩爾數(shù)均可相 同。
[0027]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇是否具有母源關(guān) 系的引物對(duì)。
[0028]本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇是否具有母源關(guān)系的引物對(duì)，為能擴(kuò)增 上述al)、a2)或a3)的引物對(duì)。
[0029]所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA可獨(dú)立包裝。所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA的摩爾比可為 1:1〇
[0030] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的系 統(tǒng)。
[0031] 本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的系統(tǒng)，包括XI;所述XI為所 述成套引物甲、所述成套引物乙或所述引物對(duì)。
[0032] 所述系統(tǒng)可由所述XI與X2組成;所述X2為進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器。進(jìn) 行PCR擴(kuò)增所需的試劑可為北京博邁德基因技術(shù)有限公司的Biomed 2XTaq PCR Mas terMix。進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的儀器可為PCR儀。
[0033] 所述系統(tǒng)還可由所述XI、所述X2與X3組成;所述X3為進(jìn)行數(shù)據(jù)分析所需要的儀器 和/或軟件和/或模塊。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析所需要的儀器具體可為測序儀(如ABI Prism377測序 儀)和/或DNA序列分析儀(如ABI-3730xl型DNA序列分析儀）。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析所需要的軟件具 體可為序列比對(duì)軟件和/或微衛(wèi)星等位基因分析軟件(如Genemarker軟件)和/或親緣關(guān)系 分析軟件(如MEGA系列軟件或ML-Relate軟件)和/或親權(quán)關(guān)系分析軟件(如CERVUS 2.0)。
[0034] 上述系統(tǒng)還可為鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的試劑或試劑盒。
[0035] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的方 法。
[0036] 本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的方法，將其命名為方法1，包 括:利用所述成套引物甲分別對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上待鑒定大鴇的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根 據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系。
[0037] 上述方法1中，在利用所述成套引物甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)可采用單重PCR進(jìn)行擴(kuò)增，也 可采用多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增。在采用多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)可采用兩個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行，其 中一個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系含有序列3-12所示的10條單鏈DNA(即所述成套引物1)，另一個(gè)多 重PCR擴(kuò)增體系中可含有序列13-22所示10條單鏈DNA(即所述成套引物2)。無論進(jìn)行單重 PCR擴(kuò)增還是多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中各單鏈DNA在擴(kuò)增體系中的濃度均可為如下濃度： 0·16μΜ〇
[0038] 在采用兩個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其中的一個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系可為： Biomed Taq DNA Master Mix 12.5μ1，所述成套引物1(所述成套引物1的各引物在該反應(yīng) 體系中的濃度均可為〇. 16μΜ)，待測大鴇基因組DNA 2μ1，BSA水溶液(BSA的濃度為20mg/ml) Ο.?μL，補(bǔ)充去離子水至25μ1。另一個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系可為：Biomed Taq DNA Master Mix 12.5μ1，所述成套引物2(所述成套引物2的各引物在該反應(yīng)體系中的濃度均可為0.16μΜ)， 大鴇基因組DNA 2μ1，BSA水溶液(BSA的濃度為20mg/ml)0. ΙμL，補(bǔ)充去離子水至25μ1。
[0039] 其中，Biomed 2XTaq PCR MasterMix為北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0040] 在采用兩個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度均可為50°C。在采用兩個(gè) 多重PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)的條件均可為94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94°C 變性 45s，50°C 退火 45s，72°C 延伸 lmin)，之后 72°C 延伸 10min。
[0041] 上述方法1中，所述根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系具體可根 據(jù)不同的引物對(duì)擴(kuò)增的等位基因確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系。具體可采用親緣關(guān)系 分析軟件進(jìn)行，如ML-Relate軟件。
[0042] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇是否具有母源關(guān) 系的方法。
[0043]本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇是否具有母源關(guān)系的方法，將其命名為 方法2,包括:利用所述引物對(duì)對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上待鑒定大鴇的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根 據(jù)PCR產(chǎn)物的序列確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系:如所述待鑒定的大鴇間的所述PCR產(chǎn) 物序列相同，所述待鑒定的大鴇間存在或候選存在母源關(guān)系；如所述待鑒定的大鴇間的所 述PCR產(chǎn)物序列不同，所述待鑒定的大鴇間不存在或候選不存在母源關(guān)系。
[0044] 上述方法2中，在利用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA的 濃度均可為〇.2μΜ。具體可采用如下擴(kuò)增體系進(jìn)行:Biomed 2XTaq PCR MasterMix25yl，所 述引物對(duì)，待測大鴇基因組DNA 2μ1，去離子水補(bǔ)充至50μ1。
[0045] 其中，Biomed 2XTaq PCR MasterMix為北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0046] 在利用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度可為50.6°C，具體PCR反應(yīng)條件可 為:95°C預(yù)變性6min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95°C變性lmin，50.6°C退火lmin，72°C延伸lmin)， 之后72°C延伸lOmin。
[0047] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的方 法。
[0048] 本發(fā)明所提供的鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系的方法，將其命名為方法3,包 括下述1)和2):
[0049] 1)利用所述引物對(duì)對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上待鑒定大鴇的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù) PCR產(chǎn)物的序列確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系:如所述待鑒定的大鴇間的所述PCR產(chǎn)物 序列相同，所述待鑒定的大鴇間存在或候選存在母源關(guān)系；如所述待鑒定的大鴇間的所述 PCR產(chǎn)物序列不同，所述待鑒定的大鴇間不存在或候選不存在母源關(guān)系；
[0050] 2)利用所述成套引物甲分別對(duì)所述待鑒定大鴇得基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系。
[0051] 上述方法3中，所述待鑒定大鴇如根據(jù)步驟1)確定其具有母源關(guān)系，根據(jù)步驟2)確 定其具有親緣關(guān)系，則所述待鑒定大鴇具有母源關(guān)系；如根據(jù)步驟1)確定其不具有母源關(guān) 系，根據(jù)步驟2)確定其具有親緣關(guān)系，則所述待鑒定大鴇具有父源關(guān)系;如根據(jù)步驟1)確定 其不具有母源關(guān)系，根據(jù)步驟2)確定其也不具有親緣關(guān)系，則所述待鑒定大鴇不具有親源 關(guān)系。
[0052]上述方法3中，在利用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)各單鏈DNA的濃度、體系和反應(yīng)條 件具體可同上述方法2。
[0053] 上述方法3中，在利用所述成套引物甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)各單鏈DNA的濃度、體系和反 應(yīng)條件具體可同上述方法1。
[0054] 上述方法3中，步驟2)具體可根據(jù)不同的引物對(duì)擴(kuò)增的等位基因確定所述待鑒定 大鴇間的親緣關(guān)系。具體可采用親緣關(guān)系分析軟件進(jìn)行，如ML-Relate軟件。
[0055] 上述方法1-上述方法3中，所述待鑒定大灣的基因組DNA均可為提取所述待鑒定大 鴇的離體的羽毛或糞便的基因組DNA得到的基因組DNA。
[0056] 在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)所述方法結(jié)合其他的大鴇的相關(guān)信息，如年齡、繁殖時(shí)間、 輩分關(guān)系、繁殖地等，進(jìn)一步確定待鑒定大鴇間的具體親緣關(guān)系。
[0057] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0058] P1、所述成套引物甲或所述成套引物乙在鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系中的 應(yīng)用；
[0059] P2、所述成套引物甲或所述成套引物乙在大鴇育種中的應(yīng)用；
[0060] P3、所述引物對(duì)在鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系中的應(yīng)用；
[0061] P4、所述引物對(duì)在大鴇育種中的應(yīng)用；
[0062] P5、所述系統(tǒng)在鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系中的應(yīng)用；
[0063] P6、所述系統(tǒng)在大鴇育種中的應(yīng)用；
[0064] P7、所述大鴇線粒體DNA片段在鑒定兩個(gè)或兩個(gè)以上大鴇親緣關(guān)系中的應(yīng)用；
[0065] P8、所述大鴇線粒體DNA片段在大鴇育種中的應(yīng)用；
[0066] P9、所述方法1、所述方法2或所述方法3在大鴇育種中的應(yīng)用。
[0067] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了大鴇育種方法。
[0068] 本發(fā)明所提供的大鴇育種方法，包括按照所述方法1、所述方法2或所述方法3鑒定 大鴇間的親緣關(guān)系，將無親緣關(guān)系的大鴇作為親本進(jìn)行育種。
[0069]本發(fā)明通過分析大鴇個(gè)體的微衛(wèi)星基因型，發(fā)現(xiàn)在成套引物甲的10對(duì)引物對(duì)應(yīng)的 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上，平均等位基因數(shù)為3.9,平均期望雜合度為0.707,各位點(diǎn)平均多態(tài)信息 含量為0.628，表明所選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的變異。采用CERVUS 2.0進(jìn)一步分析發(fā) 現(xiàn)，在雙親未知的情況下累計(jì)親權(quán)排除概率為95.96%，在已知父親或母親信息的情況下， 累計(jì)親權(quán)排除概率為99.67%，表明選擇的微衛(wèi)星多重PCR體系可用于大鴇親權(quán)鑒定，準(zhǔn)確 率已達(dá)到法醫(yī)學(xué)鑒定水平。
[0070] 本發(fā)明還通過分析本發(fā)明的大鴇線粒體DNA片段，來確定大鴇間的母源關(guān)系，在本 發(fā)明的實(shí)施例中通過F6和M7、Fel和Nel、Fe4和Ne2得到了驗(yàn)證，并且準(zhǔn)確率達(dá)100%。
[0071] 通過非損傷性取樣如糞便或羽毛已經(jīng)解決了很多因傳統(tǒng)采樣限制而解決不了的 問題，包括物種鑒定、性別確定、個(gè)體識(shí)別、數(shù)量調(diào)查、遺傳多樣性、基因流等。本發(fā)明擬通過 采集大鴇的糞便或羽毛，利用提取的糞便DNA或羽毛DNA，基于線粒體DNA和微衛(wèi)星DNA雙重 分子標(biāo)記，分析大鴇的母源關(guān)系，計(jì)算大鴇個(gè)體間的親緣關(guān)系，為大鴇人工繁育和重引入過 程中種源的選定、配對(duì)方案的制定、系譜的構(gòu)建提供技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0072]圖1為大鴇6種線粒體DNA控制區(qū)dloop片段單倍型的鄰接樹法聚類圖。
【具體實(shí)施方式】
[0073]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0074] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0075] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0076] 實(shí)施例1、基于線粒體DNA和微衛(wèi)星DNA雙重分子標(biāo)記鑒定大鴇親緣關(guān)系
[0077] 隨機(jī)選擇內(nèi)蒙古圖牧吉自然保護(hù)區(qū)的9只雄性大鴇和9只雌性大鴇，采集每只大鴇 的自然脫落的羽毛或者糞便。通過分析線粒體DNA和微衛(wèi)星雙重分子標(biāo)記，判斷個(gè)體間親緣 關(guān)系。9只雄性大鴇編號(hào)為組，12，13，14，15，16，17，18，19;9只雌性大鴇編號(hào)為？1^2，卩3， F4，F(xiàn)5，F(xiàn)6，F(xiàn)7，F(xiàn)8，F(xiàn)9。
[0078] 一、糞便或羽毛DNA的提取
[0079] 1、采集的大鴇糞便采用冷凍保存，使用糞便DNA提取試劑盒(QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit(ID:51504))提取大鴇基因組DNA;采集的大鴇的離體的羽毛保存于無水乙 醇，使用組織DNA提取試劑盒(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，ID:DL110-01)提取大鴇 基因組DNA。
[0080] 2、對(duì)提取的大鴇基因組DNA使用紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度，對(duì)于0D260/ 0D280值介于1.8-2.0的DNA保存于-20°C冰箱備用，對(duì)于DNA質(zhì)量欠佳的樣品，重新進(jìn)行提 取，直至DNA質(zhì)量合格。用于進(jìn)一步檢測的大鴇基因組DNA的濃度為29.57 ± 1.52ngAU。
[0081 ]二、基于線粒體DNA和微衛(wèi)星DNA雙重分子標(biāo)記鑒定大鴇親緣關(guān)系 [0082] 1、線粒體DNA控制區(qū)dloop片段引物
[0083]線粒體DNA控制區(qū)dloop片段引物用來鑒定大鴇母源關(guān)系，設(shè)計(jì)正反向引物： 0tdloop-F : CCCCATAGACATATTATGCATTC-3 '（序列表中序列 1 )和0tdloop-R: GGAAAGAATGGGCCTGAAGCTAGT-3 '（序列表中序列2)，將這兩條引物組成的引物對(duì)命名為鑒定 兩個(gè)或兩個(gè)以上大灣是否具有母源關(guān)系的引物對(duì)，〇tdloop-F與0tdloop-R的摩爾比為1:1， 兩條引物獨(dú)立包裝。
[0084] 2、微衛(wèi)星多重PCR引物
[0085] 微衛(wèi)星多重PCR引物，其名稱為成套引物甲，由成套引物1和成套引物2組成，均由5 對(duì)微衛(wèi)星引物組成，成套引物1與成套引物2中的各單鏈DNA均獨(dú)立包裝，成套引物1與成套 引物2中的各單鏈DNA的摩爾數(shù)均相等。成套引物1和成套引物2中各單鏈DNA的序列見表1， 其中，序列3、17和19所示的三條單鏈DNA的5'端均由HEX標(biāo)記，序列5、9、11、13、15和21所示 的各單鏈DNA的5 '端均由FAM標(biāo)記，序列7所示的單鏈DNA的5 '端均由TET標(biāo)記。
[0086]表1、大鴇微衛(wèi)星多重PCR體系所采用的引物信息 [0087]

[0089] 3、利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0090] (1)線粒體DNA控制區(qū)dloop片段擴(kuò)增采用如下50μ1體系：Biomed 2XTaq PCR MasterMix(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品）25μ1，引物0tdloop-F和0tdloop-R各ΙμL (引物0tdloop-F和0tdloop-R在該反應(yīng)體系中的濃度均為0 · 2μΜ)，大鴇基因組DNA 2μ1，去 離子水補(bǔ)充至δΟμΚΡΟ?反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性6min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95°C變性lmin， 50.6°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin)，之后 72°C 延伸 10min。
[0091] (2)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)
[0092] 成套引物1采用如下25μ1多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系：Biomed Taq DNA Master Mixl2.5yl，成套引物1(成套引物1的各引物在該反應(yīng)體系中的濃度均為0.16μΜ)，大鴇基 因組DNA 2μ1，BSA水溶液(BSA的濃度為20mg/ml)0. ΙμL，補(bǔ)充去離子水至25μ1。
[0093] 成套引物2采用如下25μ1多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系：Biomed Taq DNA Master Mixl2.5yl，成套引物2(成套引物2的各引物在該反應(yīng)體系中的濃度均為0.16μΜ)，大鴇基因 組DNA 2μ1，BSA水溶液(BSA的濃度為20mg/ml)0. ΙμL，補(bǔ)充去離子水至25μ1。
[0094] 成套引物1與成套引物2的多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)條件均為:94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn) 行30個(gè)循環(huán)(94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin)，之后72°C延伸lOmin。
[0095] 4、測序和基因掃描
[0096] (1)對(duì)線粒體DNA控制區(qū)dloop的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI Prism377測序儀進(jìn)行雙向 測序。
[0097] (2)對(duì)多重微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物，進(jìn)行基因掃描，用ABI-3730xl型DNA序列分析儀電泳分 離和焚光掃描，以R0X焚光標(biāo)記作為內(nèi)參，使用Genemarker軟件分析各個(gè)大灣個(gè)體的微衛(wèi)星 等位基因。
[0098] 5、親緣關(guān)系分析
[0099] (1)通過軟件MEGA5.0對(duì)線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在18只大鴇 中，線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列有六種，即存在6種單倍型(表2)，即大鴇在系統(tǒng)進(jìn)化過 程中至少有6個(gè)母系起源。其中，11、17、18、？1、？6和?8的線粒體0~六控制區(qū)(11〇〇?片段序列均 為序列表中序列23,單倍型為0tHapl;M4、M5和F4的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列均為序 列表中序列24,單倍型為0tHap2;F5和F7的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列均為序列表中 序列25,單倍型為0tHap3;M2、M3和M9的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列均為序列表中序列 26,單倍型為0tHap4;M6、F3和F9的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列均為序列表中序列27， 單倍型為0tHap5;F2的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列均為序列表中序列28,單倍型為 0tHap6。表明，Ml、M7、M8、F1、F6和F8具有共同的母系來源，M4、M5和F4具有共同的母系來源， F5和F7具有共同的母系來源，M2、M3和M9具有共同的母系來源，M6、F3和F9具有共同的母系 來源，F(xiàn)2與其余大鴇均不具有共同的母系來源。
[0100] 根據(jù)這6種單倍型采用MEGA 5.0作鄰接樹（Neighbor-joining)，參數(shù)設(shè)置為 Bootstrap法，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000,核苷酸置換模型為Kimura 2-parameter model， 發(fā)現(xiàn)這6種單倍型聚成兩個(gè)支系（圖1)。
[0101]基于此，利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的線粒體DNA的dloop片段，可應(yīng)用于：（1)在確定母源關(guān) 系時(shí)，如果2個(gè)待檢個(gè)體的線粒體DNA dloop序列不同，則可排除二者存在母源關(guān)系，表明 二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，如果作為參與繁殖的候選個(gè)體，可有效避免近親繁殖；（2)在人工調(diào)配 大鴇種源過程中，應(yīng)該將來自于不同母系來源且分屬不同支系的雌性個(gè)體挑選出來，優(yōu)先 與雄性大鴇參與繁殖，并確保該單倍型隨著世代數(shù)的變化不丟失，有助于保持物種的遺傳 多樣性。
[0102]表2、大鴇線粒體DNA控制區(qū)dloop片段的變異位點(diǎn)及單倍型分布
[0104] 表2中，"·"表示0tHap2、0tHap3、0tHap4、0tHap5、0tHap6在相對(duì)應(yīng)的堿基上，與 OtHapl的堿基相同。
[0105] (2)根據(jù)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)的基因掃描結(jié)果，分析18只大鴇個(gè)體的微衛(wèi)星基因 型，發(fā)現(xiàn)在這10對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)應(yīng)的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上，平均等位基因數(shù)為3.9,平均期望 雜合度為0.707,各位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量為0.628,表明所選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的 變異。采用軟件CERVUS 2.0進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在雙親未知的情況下累計(jì)親權(quán)排除概率為 95.96%，在已知父親或母親信息的情況下，累計(jì)親權(quán)排除概率為99.67%，表明選擇的微衛(wèi) 星多重PCR體系可用于大鴇親權(quán)鑒定，準(zhǔn)確率已達(dá)到法醫(yī)學(xué)鑒定水平。
[0106] 為了進(jìn)一步分析待檢測個(gè)體間的親緣關(guān)系，將18只大鴇個(gè)體的微衛(wèi)星等位基因數(shù) 據(jù)，輸入ML-Relate軟件，設(shè)置置信水平（confidence level)為0.95，最大似然隨機(jī)重復(fù)次 數(shù)(maximum likelihood randmizations)設(shè)置為 1000eML-Relate軟件首先通過假定大灣 個(gè)體兩兩間存在4種親緣關(guān)系，分別為U、HS、FS和P0,其中U表示無親緣關(guān)系(Unrelated)，HS 表示半同胞（Half Sibs)，F(xiàn)S表示全同胞（Full Sibs)，P0表示親子關(guān)系（Parent/ Offspring)。然后根據(jù)大灣個(gè)體在10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因型分布情況，軟件自動(dòng)計(jì)算大 鴇個(gè)體兩兩間每種親緣關(guān)系條件下的最大似然概率。當(dāng)四種假定親緣關(guān)系中，哪一個(gè)親緣 關(guān)系通過微衛(wèi)星基因型計(jì)算得到的似然概率最大，則判斷為存在該種親緣關(guān)系。得到的親 緣關(guān)系矩陣（Relationship Matrix)，見表3〇
[0107] 表3、基于微衛(wèi)星基因型計(jì)算的個(gè)體兩兩間親緣關(guān)系判斷矩陣
[0109] 其中，U表示無親緣關(guān)系(Unrelated)，HS表示半同胞(Half Sibs)，F(xiàn)S表示全同胞 (Full Sibs)，P0表示親子關(guān)系（Parent/Offspring)。
[0110] 根據(jù)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ml與M2存在親子關(guān)系，因?yàn)镸l和M2均為雄性， 可判斷Ml和M2存在父子關(guān)系，這與繁殖記錄一致。
[0111] 根據(jù)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)F6和M7為全同胞關(guān)系，而F6和M7的線粒體DNA 控制區(qū)dloop片段序列相同，也說明F6和M7具有共同的母系來源。F6和M7是從野外救護(hù)而 來，來自于同一個(gè)野外巢，為全同胞關(guān)系，與上述鑒定結(jié)果一致。
[0112] 根據(jù)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5與M6、M1與M8、M7與M9、F1與M1、M5與F2、F4 與M4、F3與M9、M4與F5、M5與F5、F5與F4、F6與Ml、F6與F4、F7與F5、F8與Ml、F8與M6、F9與M5、F9 與M6、F9與F3均為半同胞關(guān)系；根據(jù)大鴇的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段結(jié)果得知，Ml與M8、 F1與Ml、F4與M4、F6與Ml、F7與F5、F8與Ml、F9與M6、F9與F3均具有相同的母系來源，這與多重 微衛(wèi)星PCR反應(yīng)的結(jié)果一致；而大鴇的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段結(jié)果顯示M5與M6、M7與 M9、M5與F2、F3與M9、M4與F5、M5與F5、F5與F4、F6與F4、F8與M6、F9與M6均不存在母源關(guān)系， 表明這幾對(duì)大鴇間存在父源關(guān)系。
[0113] 根據(jù)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)剩余的大鴇間無親緣關(guān)系，并且根據(jù)各對(duì)大 鴇的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段得到的剩余的大鴇間也不存在相同的母系來源。在篩選繁 殖個(gè)體時(shí)，則需要參考這些無親緣關(guān)系個(gè)體的線粒體單倍型和支系，盡量選擇具有不同線 粒體單倍型且屬于不同母系分支的個(gè)體參與繁殖。
[0114] 實(shí)施例2、基于線粒體DNA和微衛(wèi)星DNA雙重分子標(biāo)記進(jìn)行大鴇親權(quán)鑒定的驗(yàn)證
[0115] 采集內(nèi)蒙古圖牧吉國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)一個(gè)散養(yǎng)繁殖場(400mX 300m)的2只成年雄 性大鴇、4只成年雌性大鴇和2只雛鳥的糞便樣品或羽毛樣品，鑒定雛鳥的生物學(xué)父親和生 物學(xué)母親。2只成年雄性大鴇的編號(hào)為Malel(簡寫為Mal，以下同）和Male2(Ma2);4只成年雌 性大灣的編號(hào)為Femalel (Fel)、Female2(Fe2)、Female3(Fe3)和Female4(Fe4); 2只維鳥的 編號(hào)為如81:1;[]^1(如1)和如81:1;[]^2(如2)。
[0116] 一、糞便或羽毛DNA的提取
[0117] 1、采集的大鴇糞便采用冷凍保存，使用糞便DNA提取試劑盒(QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit(ID:51504))提取大鴇基因組DNA;采集的大鴇的離體的羽毛保存于無水乙 醇，使用組織DNA提取試劑盒(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，ID:DL110-01)提取大鴇 基因組DNA。
[0118] 2、對(duì)提取的大鴇基因組DNA使用紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度，對(duì)于0D260/ 0D280值介于1.8-2.0的DNA保存于-20°C冰箱備用，對(duì)于DNA質(zhì)量欠佳的樣品，重新進(jìn)行提 取，直至DNA質(zhì)量合格。用于進(jìn)一步檢測的大鴇基因組DNA的濃度為26.16 ± 1.87ngAU。
[0119] 二、基于線粒體DNA和微衛(wèi)星DNA雙重分子標(biāo)記進(jìn)行大鴇親權(quán)鑒定 [0120] 1、線粒體DNA控制區(qū)dloop片段引物
[0121] 線粒體DNA控制區(qū)dloop片段引物用來鑒定大鴇母源關(guān)系，設(shè)計(jì)正反向引物： 0tdloop-F : CCCCATAGACATATTATGCATTC-3 '（序列表中序列 1 )和0tdloop-R: GGAAAGAATGGGCCTGAAGCTAGT-3 '（序列表中序列2)，將這兩條引物組成的引物對(duì)命名為鑒定 兩個(gè)或兩個(gè)以上大灣是否具有母源關(guān)系的引物對(duì)，〇tdloop-F與0tdloop-R的摩爾比為1:1， 兩條引物獨(dú)立包裝。
[0122] 2、微衛(wèi)星多重PCR引物
[0123] 微衛(wèi)星多重PCR引物，其名稱為成套引物甲，由成套引物1和成套引物2組成，均由5 對(duì)微衛(wèi)星引物組成，成套引物1與成套引物2中的各單鏈DNA均獨(dú)立包裝，成套引物1與成套 引物2中的各單鏈DNA的摩爾數(shù)均相等。成套引物1和成套引物2中各單鏈DNA的序列見表1， 其中，序列3、17和19所示的三條單鏈DNA的5 '端均由HEX標(biāo)記，序列5、9、11、13、15和21所示 的各單鏈DNA的5 '端均由FAM標(biāo)記，序列7所示的單鏈DNA的5 '端均由TET標(biāo)記。
[0124] 3、利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0125] (1)線粒體DNA控制區(qū)dloop片段擴(kuò)增采用如下50μ1體系：Biomed 2XTaq PCR MasterMix(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品）25μ1，引物0tdloop-F和0tdloop-R各ΙμL (引物0tdloop-F和0tdloop-R在該反應(yīng)體系中的濃度均為0 · 2μΜ)，大鴇基因組DNA 2μ1，去 離子水補(bǔ)充至δΟμΚΡΟ?反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性6min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(95°C變性lmin， 50.6°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin)，之后 72°C 延伸 10min。
[0126] (2)多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)
[0127] 成套引物1采用如下25μ1多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系：Biomed Taq DNA Master Mixl2.5yl，成套引物1(成套引物1的各引物在該反應(yīng)體系中的濃度均為0.16μΜ)，大鴇基因 組DNA 2μ1，BSA水溶液(BSA的濃度為20mg/ml)0. ΙμL，補(bǔ)充去離子水至25μ1。
[0128] 成套引物2采用如下25μ1多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系：Biomed Taq DNA Master Mixl2.5yl，成套引物2(成套引物2的各引物在該反應(yīng)體系中的濃度均為0.16μΜ)，大鴇基因 組DNA 2μ1，BSA水溶液(BSA的濃度為20mg/ml)0. ΙμL，補(bǔ)充去離子水至25μ1。
[0129] 成套引物1與成套引物2的多重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)條件均為:94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn) 行30個(gè)循環(huán)(94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin)，之后72°C延伸10min。
[0130] 4、測序和基因掃描
[0131] (1)對(duì)線粒體DNA控制區(qū)dloop的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI Prism377測序儀進(jìn)行雙向 測序。
[0132] (2)對(duì)多重微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物，進(jìn)行基因掃描，用ABI-3730xl型DNA序列分析儀電泳分 離和焚光掃描，以R0X焚光標(biāo)記作為內(nèi)參，使用Genemarker軟件分析各個(gè)大灣個(gè)體的微衛(wèi)星 等位基因。
[0133] 5、親權(quán)鑒定
[0134] 通過軟件MEGA5.0對(duì)線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大鴇雛鳥Nel、 成年雌鴇Fel和成年雌鴇Fe3的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列相同，一致性為100%，對(duì)應(yīng) 的單倍型為表2的0tHap2;大鴇雛鳥Ne2的線粒體DNA控制區(qū)dloop片段序列與Fe4的一致性 為100%，對(duì)應(yīng)的單倍型為表2的OtHapl。基于此，可判斷，Nel、Fel和Fe3存在母源關(guān)系;Ne2 與Fe4存在母源關(guān)系。
[0135] 為了進(jìn)一步分析待檢測個(gè)體間的親緣關(guān)系，將這8只大鴇個(gè)體的微衛(wèi)星等位基因 數(shù)據(jù)，輸入ML-Relate軟件進(jìn)行進(jìn)一步的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1 )Mal和Nel存在親子關(guān)系，F(xiàn)el和 Nel存在親子關(guān)系，由于Mai和Fel均為成年大鴇，Nel為大鴇雛鳥，表明，Mai和Fel分別為Nel 的生物學(xué)母親和父親；（2)Ma2和Ne2存在親子關(guān)系，F(xiàn)e4和Ne2存在親子關(guān)系，由于Ma2和Fe4 均為成年大鴇，Ne2為大鴇雛鳥，表明，Ma2和Fe4分別為Ne2的生物學(xué)母親和父親。存在親緣 關(guān)系的7只大鴇的微衛(wèi)星等位基因如表4所示，10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因型也表明符合孟德 爾遺傳。根據(jù)繁育部門的基于紅外攝像監(jiān)控和行為學(xué)觀察，雄鴇Mai和雌鴇Fel發(fā)生了交配 行為，雌鴇Fe 1孵育出的幼雛正是Ne 1;雄鴇Ma2和雌鴇Fe4發(fā)生了交配行為，雌鴇Fe4孵育出 的幼雛正是Ne2;表明本發(fā)明的方法在鑒定大鴇親緣關(guān)系時(shí)準(zhǔn)確可靠。
[0136] 表4、7只大鴇的微衛(wèi)星等位基因在10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物，為成套引物1和/或成套引物2; 所述成套引物1由序列表中序列3-序列12所示的10條單鏈DNA組成;所述成套引物2由 序列表中序列13-序列22所示的10條單鏈DNA組成。2. 鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物，由能擴(kuò)增下述al)、a2)或a3)的引物對(duì)與權(quán)利要求1 中所述成套引物1和/或所述成套引物2組成； al)大鴇線粒體DNA片段； a2)al)的任一片段； a3)含有al)的DNA片段； 所述大鴇線粒體DNA片段的序列為如下A1)、A2)或A3): A1)序列表中序列23的核苷酸序列； A2)與A1)限定的DNA序列具有75%或75%以上同一性的由A1)衍生的DNA序列； A3)在嚴(yán)格條件下與A1)限定的DNA序列雜交的由A1)衍生的DNA序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的成套引物，其特征在于:所述引物對(duì)由序列表中序列1和序列2 所示的兩條單鏈DNA組成。4. 鑒定大鴇是否具有母源關(guān)系的引物對(duì)，為權(quán)利要求2或3中所述引物對(duì)。5. 鑒定大鴇親緣關(guān)系的系統(tǒng)，包括XI;所述XI為權(quán)利要求1-3中任一所述鑒定大鴇親緣 關(guān)系的成套引物或權(quán)利要求2或3中所述引物對(duì)。6. 鑒定大鴇親緣關(guān)系的方法，包括:利用權(quán)利要求1所述鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物 分別對(duì)待鑒定大鴇的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定所述待鑒定大鴇間的 未緣關(guān)系。7. 鑒定大鴇是否具有母源關(guān)系的方法，包括:利用權(quán)利要求2或3中所述引物對(duì)對(duì)待鑒 定大鴇的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物的序列確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系： 如所述待鑒定的大灣間的所述PCR產(chǎn)物序列相同，所述待鑒定的大灣間存在或候選存在母 源關(guān)系;如所述待鑒定的大鴇間的所述PCR產(chǎn)物序列不同，所述待鑒定的大鴇間不存在或候 選不存在母源關(guān)系。8. 鑒定大鴇親緣關(guān)系的方法，包括下述1)和2): 1) 利用權(quán)利要求2或3中所述引物對(duì)對(duì)待鑒定大鴇的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的序列確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系：如所述待鑒定的大鴇間的所述PCR產(chǎn)物序 列相同，所述待鑒定的大鴇間存在或候選存在母源關(guān)系；如所述待鑒定的大鴇間的所述PCR 產(chǎn)物序列不同，所述待鑒定的大鴇間不存在或候選不存在母源關(guān)系； 2) 利用權(quán)利要求1所述鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物分別對(duì)所述待鑒定大鴇得基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確定所述待鑒定大鴇間的親緣關(guān)系。9. 下述任一應(yīng)用： P1、權(quán)利要求1-3中任一所述鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物在鑒定大鴇親緣關(guān)系中的 應(yīng)用； P2、權(quán)利要求1-3中任一所述鑒定大鴇親緣關(guān)系的成套引物在大鴇育種中的應(yīng)用； P3、權(quán)利要求2或3中所述引物對(duì)在鑒定大鴇親緣關(guān)系中的應(yīng)用； P4、權(quán)利要求2或3中所述引物對(duì)在大鴇育種中的應(yīng)用； P5、權(quán)利要求5所述系統(tǒng)在鑒定大鴇親緣關(guān)系中的應(yīng)用； P6、權(quán)利要求5所述系統(tǒng)在大鴇育種中的應(yīng)用； P7、權(quán)利要求2中所述大鴇線粒體DNA片段在鑒定大鴇親緣關(guān)系中的應(yīng)用； P8、權(quán)利要求2中所述大鴇線粒體DNA片段在大鴇育種中的應(yīng)用； P9、權(quán)利要求6-8中任一所述方法在大鴇育種中的應(yīng)用。10.大鴇育種方法，包括按照權(quán)利要求4或5所述的方法鑒定大鴇間的親緣關(guān)系，將無親 緣關(guān)系的大鴇作為親本進(jìn)行育種。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105969894SQ201610556982
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】劉剛, 龔明昊, 崔麗娟, 胡德夫, 李林海, 韓莫日根, 孟德榮, 李惠鑫, 寧宇, 夏曉飛
【申請(qǐng)人】中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所