體外細胞疾病模型及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種體外細胞疾病模型及其制備方法和一種篩選藥物的方法，所述制備體外細胞疾病模型的方法包括采用激光顯微切割系統(tǒng)對細胞的預定部位進行線性切割，以便獲得所述體外細胞疾病模型。本發(fā)明實施例所提出的制備體外細胞疾病模型的方法可制備特定細胞結(jié)構(gòu)乃至單個細胞疾病模型，而對非造模區(qū)域無損傷，方法操作簡單，所得體外細胞疾病模型能夠真實全面的反應疾病的發(fā)病機制或過程。
【專利說明】
體外細胞疾病模型及其制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，具體的，本發(fā)明涉及體外細胞疾病模型、制備體外細胞疾病模型的方法以及篩選藥物的方法。
【背景技術】
[0002]體外細胞疾病模型對于疾病的發(fā)病機制研究和篩選藥物都具有極其重要的作用?，F(xiàn)有的制備體外細胞疾病模型的方法包括藥物誘導、基因修飾、誘導多能干細胞(iPSCs)技術等，然而這些技術不能全面或真實的反應疾病的發(fā)病機制或過程。
[0003]進而，制備體外細胞疾病模型的方法仍有待進一步開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出了一種具有制備特定區(qū)域細胞乃至單個細胞疾病模型的方法，該方法操作簡單，能夠真實全面的反應疾病的發(fā)病機制或過程。
[0005]在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種制備體外細胞疾病模型的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括:采用激光顯微切割系統(tǒng)對細胞的預定部位進行線性切割，以便獲得所述體外細胞疾病模型。本發(fā)明實施所提出制備體外細胞疾病模型的方法，既避免了細胞在微流體系統(tǒng)中生長受限的問題，又避免了微流體培養(yǎng)板造價昂貴的問題，既避免了將高功率的激光器整合到共聚焦顯微鏡的光路系統(tǒng)而造成的技術要求高和儀器不穩(wěn)定的問題，又避免了藥物誘導不能實現(xiàn)局部區(qū)域誘導的問題，既避免了基因修飾存在的非真實性反應疾病發(fā)病機制的問題，又避免了 iPSCs技術存在的不能全面反應疾病發(fā)病機制的問題。本發(fā)明實施例所提出的方法可制備特定區(qū)域細胞乃至單個細胞疾病模型，而對非造模區(qū)域無損傷，方法操作簡單，所得體外細胞疾病模型能夠真實全面的反應疾病的發(fā)病機制或過程。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述制備體外細胞疾病模型的方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:
[0007]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞預先在玻璃底皿或鋪有多聚賴氨酸的蓋玻片上培養(yǎng)預定時間。玻璃材質(zhì)的底皿對激光的通透性好，多聚賴氨酸處理適于細胞的貼壁生長，進而利用激光顯微切割系統(tǒng)對細胞進行切割時，更有利于周圍細胞不被沖起，不會影響周圍細胞。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述體外細胞疾病模型是細胞損傷疾病模型。本發(fā)明實施例所提出的方法適用于細胞損傷疾病模型構(gòu)建，根據(jù)本發(fā)明的實施例，應用本發(fā)明實施例所提出的方法制備的細胞損傷疾病模型的細胞損傷指標顯著。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞損傷疾病模型是神經(jīng)元細胞退化疾病模型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用本發(fā)明實施例所提出的方法制備的神經(jīng)元細胞退化疾病模型，神經(jīng)元細胞退化指標顯著，本發(fā)明實施例所提出的方法更加適于制備神經(jīng)元細胞退化疾病模型。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述對細胞的預定部位進行線性切割是通過如下操作實現(xiàn)的:(I)通過調(diào)整Focus參數(shù)來調(diào)整激光切割平面，直至在所述玻璃底皿或所述蓋玻片的無細胞區(qū)域的底面劃出清晰印跡，所述Focus參數(shù)為50?60; (2)通過調(diào)整Power參數(shù)來調(diào)整激光切割能量，直至在非實驗細胞區(qū)實現(xiàn)第一預定部位的線性切割而不影響周邊細胞，所述Power參數(shù)為40?50; (3)在步驟(2-1)和(2-2)中獲得的Focus和Power的激光參數(shù)下，在實驗細胞區(qū)的第二預定部位實現(xiàn)線性切割。本發(fā)明實施例所提出的方法在上述操作下，實現(xiàn)了對實驗細胞區(qū)預定部位精準的切割，切割能量恰當，不影響周邊細胞。
[0011 ]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第二預定部分是所述細胞的特化結(jié)構(gòu)，任選地，所述特化結(jié)構(gòu)是偽足。根據(jù)本發(fā)明的實施例，當所述細胞具有偽足結(jié)構(gòu)時，本發(fā)明實施例所提出的制備體外細胞疾病模型的方法可實現(xiàn)在細胞的胞體和偽足的連接區(qū)進行精準線性切割，進而獲得細胞損傷疾病模型，所獲得的細胞的損傷指標顯著。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第二預定部分是所述神經(jīng)元細胞的軸突(突出)。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，當所述細胞為神經(jīng)元細胞時，本發(fā)明實施例所提出的方法可實現(xiàn)神經(jīng)元軸突(突出)的精準切割。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所述神經(jīng)元既可指從神經(jīng)球得到的多個神經(jīng)細胞又可指單個神經(jīng)元細胞，當神經(jīng)球的周邊爬出大量軸突時，激光可對整個細胞球和周邊軸突進行精準切割，當神經(jīng)元細胞單個生長時，激光可對單個神經(jīng)元的軸突進行精準切割。本發(fā)明實施例所提出的方法制備的神經(jīng)元退化疾病模型的神經(jīng)元細胞退化指標顯著，具體表現(xiàn)在具有退化小泡的神經(jīng)軸突的比例顯著升高，斷裂軸突的比例顯著升尚O
[0013]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種體外細胞疾病模型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述體外細胞疾病模型是通過前面所述的方法制備的。本發(fā)明實施例所提出的體外細胞疾病模型，疾病指標顯著，可全面真實地反應疾病機制或過程，可用于相關藥物的篩選。
[0014]在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述篩選藥物的方法包括:將候選藥物與前面所述的體外細胞疾病模型接觸;通過監(jiān)控所述接觸前后，所述細胞表型或功能的變化，判斷所述候選藥物是否能夠用于治療或預防細胞損傷疾病。本發(fā)明實施例所提出的篩選藥物的方法可用于篩選具有治療或預防細胞損傷疾病的藥物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，前面所述的體外細胞疾病模型具有疾病的典型指標，如細胞表型或功能變化指標，如果將候選藥物作用于前面所述的體外細胞疾病模型，細胞表型或功能指標變好，則候選藥物具有治療或預防細胞損傷疾病的用途。本發(fā)明實施例所提出的篩選藥物方法的可行性和可信度高。
[0015]在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括:將候選藥物與前面所述的體外細胞疾病模型接觸，所述體外細胞疾病模型是神經(jīng)元細胞退化疾病模型；以及監(jiān)控在所述接觸前后，具有退化小泡的軸突的比例或斷裂軸突的比例，其中，所述退化小泡的軸突的比例降低或斷裂軸突的比例降低是藥物具有治療或預防神經(jīng)元退化用途的指示。本發(fā)明實施例所提出的篩選藥物的方法可用于篩選具有治療或預防神經(jīng)元退化疾病的藥物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，前面所述的神經(jīng)元退化疾病模型具有神經(jīng)元退化疾病的典型指標，如退化小泡的軸突的比例升高或斷裂軸突的比例升高，如果將候選藥物作用于前面所述的體外細胞疾病模型，如退化小泡的軸突的比例降低或斷裂軸突的比例降低，則候選藥物具有治療或預防神經(jīng)元退化疾病的用途。本發(fā)明實施例所提出的篩選藥物方法的可行性和可信度高。
【附圖說明】
[0016]圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)元經(jīng)過激光切斷前后的效果圖；
[0017]圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)元經(jīng)過激光切斷后不同時間點的突出相差圖；
[0018]圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)元經(jīng)過激光切斷后，不同時間點具有退化小泡的神經(jīng)突出的比例；
[0019]圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例的神經(jīng)元經(jīng)過激光切斷后，不同時間點斷裂突出的比例；以及
[0020]圖5是根據(jù)本發(fā)明實施例的以制備神經(jīng)元細胞退化疾病模型為例，制備體外細胞疾病模型的方法流程圖。
【具體實施方式】
[0021]下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0022]在以下實施例中，以制備神經(jīng)元細胞退化疾病模型為例詳細描述制備體外細胞疾病模型的方法
[0023]實施例1制備方法
[0024]本發(fā)明將神經(jīng)元培養(yǎng)在玻璃底皿的細胞培養(yǎng)皿中，這種培養(yǎng)皿可以是普通的激光共聚焦觀察的培養(yǎng)皿，如Nunc?Glass Bottom Dishes(Thermo Scientific);或者直接將多聚賴氨酸處理的60 X 60mm的蓋玻片鋪到6孔板中培養(yǎng)細胞，再將蓋玻片轉(zhuǎn)移到鋁制的chamber中，加入合適的培養(yǎng)基用于激光切割。將神經(jīng)前體細胞球(神經(jīng)球)接種到培養(yǎng)皿中誘導分化，在經(jīng)過4-5天的分化后，神經(jīng)球的周圍爬出很多軸突，進而對整個神經(jīng)球的軸突進行激光切割，從而得到與胞體分離的神經(jīng)元軸突(或突出)；也可以將神經(jīng)前體細胞消化成單細胞，接種到培養(yǎng)皿中，分化出胞體較為均勻的神經(jīng)元細胞，進而對單個神經(jīng)元或多個神經(jīng)元的軸突(或突出)進行切割。
[0025]將培養(yǎng)皿置于激光顯微切割系統(tǒng)(PALM MicroBeam system，Zeiss)的載物臺上，調(diào)整焦距并找到合適的視野。調(diào)整切割激光:(I)調(diào)整激光切割平面:在培養(yǎng)皿的無細胞區(qū)域畫出切割線，沿著畫好的切割線開始激光切割并在軟件上調(diào)整focus的參數(shù)，直至能在玻璃底劃出淡淡的印記，focus—般在50-60之間；(2)調(diào)整激光能量強度:待調(diào)整好切割平面后，將視野移動到非實驗的細胞區(qū)，橫跨細胞畫出切割線，沿著畫好的切割線開始激光切割并不斷調(diào)節(jié)軟件上的power值，直至能切斷被畫線的細胞而不沖起周圍細胞為宜，Power參數(shù)一般為40?50之間較好。(3)待激光調(diào)試完畢，將視野移動到實驗區(qū)，畫出切割線，在(I)和(2)所得到的focus和power值下，沿著畫出的切割線進行激光切割，即可將神經(jīng)軸突(或突出)與胞體進行分離，遠離胞體的軸突很快會發(fā)生退化。
[0026]本實施例中使用的激光顯微切割系統(tǒng)，不需要對共聚焦顯微鏡的光路系統(tǒng)進行改裝，保證了切割的穩(wěn)定性并且不對共聚焦顯微鏡產(chǎn)生影響，而切割的位置只要在適當?shù)奈恢米龊脴擞?，可以很方便的在共聚焦顯微鏡中找到切割區(qū)域并進行觀察。激光切割誘導的退化不同于藥物或轉(zhuǎn)入有害基因誘導的退化，本實施例中的方法可以在軟件中選擇適合的畫線工具，畫出各種形狀，激光即可沿著畫好的形狀軌跡進行切割，也就是說，本實施例的方法可以對局部區(qū)域的神經(jīng)細胞誘導退化，而這個區(qū)域的大小可以根據(jù)發(fā)明人的意愿進行控制。
[0027]實施例2
[0028]實施例1的方法的檢測兼容性好，經(jīng)過激光切割的神經(jīng)元(玻璃底培養(yǎng)皿中)可以繼續(xù)進行培養(yǎng)，進而觀察神經(jīng)退化的進程;也可以置于共聚焦顯微鏡下進行實時觀察。
[0029]其中，神經(jīng)元經(jīng)過激光切斷后，效果圖如圖1所示，其中標尺為20微米，不同時間點的突出相差圖如圖2所示，其中標尺為20微米，不同時間點具有退化小泡的神經(jīng)突出的比例如圖3所示，不同時間點斷裂突出的比例如圖4所示。綜合圖1?圖4結(jié)果可以看出，本發(fā)明實施例的方法獲得的神經(jīng)元退化指標顯著。
[0030]另外，為了方便理解，以制備神經(jīng)元細胞退化疾病模型為例，發(fā)明人將制備體外細胞疾病模型的方法流程圖表示在圖5中。
[0031]在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。
[0032]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1.一種制備體外細胞疾病模型的方法，其特征在于，包括: 采用激光顯微切割系統(tǒng)對細胞的預定部位進行線性切割，以便獲得所述體外細胞疾病模型。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞預先在玻璃底皿或鋪有多聚賴氨酸的蓋玻片上培養(yǎng)預定時間。3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述體外細胞疾病模型是細胞損傷疾病模型。4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述細胞損傷疾病模型是神經(jīng)元細胞退化疾病模型。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述對細胞的預定部位進行線性切割是通過如下操作實現(xiàn)的: (1)通過調(diào)整Focus參數(shù)來調(diào)整激光切割平面，直至在所述玻璃底皿或所述蓋玻片的無細胞區(qū)域的底面劃出清晰印跡，所述Focus參數(shù)為50?60; (2)通過調(diào)整Power參數(shù)來調(diào)整激光切割能量，直至在非實驗細胞區(qū)實現(xiàn)第一預定部位的線性切割而不影響周邊細胞，所述Power參數(shù)為40?50;以及 (3)在步驟(2-1)和(2-2)中獲得的Focus和Power的激光參數(shù)下，在實驗細胞區(qū)的第二預定部位實現(xiàn)線性切割。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二預定部分是所述細胞的特化結(jié)構(gòu)， 任選地，所述特化結(jié)構(gòu)為偽足。7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二預定部分是所述神經(jīng)元細胞的軸關O8.—種體外細胞疾病模型，其特征在于，是通過權利要求1?7任一項所述的方法制備的。9.一種篩選藥物的方法，其特征在于，包括: 將候選藥物與權利要求8所述的體外細胞疾病模型接觸； 通過監(jiān)控所述接觸前后，所述細胞表型或功能的變化，判斷所述候選藥物是否能夠用于治療或預防細胞損傷疾病。10.一種篩選藥物的方法，其特征在于，包括: 將候選藥物與權利要求8所述的體外細胞疾病模型接觸，所述體外細胞疾病模型是神經(jīng)元細胞退化疾病模型；以及 監(jiān)控在所述接觸前后，具有退化小泡的軸突的比例或斷裂軸突的比例， 其中，所述退化小泡的軸突的比例降低或斷裂軸突的比例降低是藥物具有治療或預防神經(jīng)元退化用途的指示。
【文檔編號】C12Q1/02GK105861482SQ201610209539
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】劉興國, 包飛翔, 石紅巖, 龍祺
【申請人】中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院