一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，包括以下步驟：S1，細(xì)菌培養(yǎng)：將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種到MRS固體培養(yǎng)基上，在36?38℃培養(yǎng)47?49h后，將菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，在36?38℃下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)23?25h，在對(duì)數(shù)末期獲得菌體；S2，誘變：在無(wú)菌條件下分別取培養(yǎng)后的菌液1.5mL于18個(gè)一次性小平板中，分別作標(biāo)簽1min，3min，5min，7min，9min，每個(gè)時(shí)間做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白對(duì)照，無(wú)菌條件下，置于等離子體發(fā)生室誘變，誘變完成后，將相同時(shí)間的3個(gè)平行混合，每個(gè)時(shí)間取100μL用于菌落計(jì)數(shù)，0.5mL用于菌種保存，取剩余1ml菌液進(jìn)行鉛吸附試驗(yàn)。本發(fā)明步驟清晰，操作簡(jiǎn)單，可以準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析，適合推廣。CGMCC No.1194420151228
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉 及一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于人為因素尤其是工業(yè)的發(fā)展及地球表面活動(dòng)，重金屬對(duì)環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán) 重，其對(duì)各類(lèi)生物和地球生命的危害影響已經(jīng)逐步成為全球關(guān)心的問(wèn)題。食品中鉛污染已 經(jīng)成為普遍的公共衛(wèi)生問(wèn)題，慢性鉛中毒在世界各國(guó)仍是一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。為了減輕 或清除鉛富集對(duì)機(jī)體的危害，我們除了預(yù)防鉛富集在機(jī)體內(nèi)，還必須采取有效的措施來(lái)清 除已富集在機(jī)體內(nèi)的重金屬鉛。目前，利用自然界篩選獲得天然耐鉛微生物作為一種重金 屬清除試劑成為研究人員關(guān)注的新領(lǐng)域。其中，益生菌是一類(lèi)能夠保持宿主腸內(nèi)微生物菌 群的生態(tài)平衡的細(xì)菌，被人類(lèi)稱(chēng)為微生態(tài)調(diào)制劑。它對(duì)宿主的生理健康可以產(chǎn)生有益作用， 又被稱(chēng)為活性微生物。因此，利用對(duì)動(dòng)物機(jī)體有益的耐鉛益生菌作為清除劑，既對(duì)機(jī)體有益 生作用，又可以在消化道內(nèi)清除機(jī)體攝入的鉛離子，并將鉛排出體外，從而防止鉛在機(jī)體內(nèi) 富集中毒，具有很高的研究?jī)r(jià)值。
[0003] -般來(lái)說(shuō)，從自然界分離篩選得到的菌株，不宜直接投入到工業(yè)生產(chǎn)中。常壓室溫 離子體作為一種新型誘變手段，具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、無(wú)毒性、正突變率高等優(yōu)點(diǎn)，日益 受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞。國(guó)內(nèi)外一些研究結(jié)果表明，ARTP技術(shù)可以快速有效地突變細(xì)菌、 微藻、真菌、酵母等微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌 的篩選及其分析方法。
[0005] 本發(fā)明提出的一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，包括以下 步驟：
[0006] Sl，細(xì)菌培養(yǎng):將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種到MRS固體培養(yǎng)基上，在36-38°C培養(yǎng)47-49h后，將菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，在36-38 °C下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)23-25h，在對(duì)數(shù) 末期獲得菌體；
[0007] S2,誘變:在無(wú)菌條件下分別取培養(yǎng)后的菌液1.5mL于18個(gè)一次性小平板中，分別 作標(biāo)簽Imin，3min，5min，7min，9min，每個(gè)時(shí)間做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白對(duì)照，無(wú)菌條件 下，置于等離子體發(fā)生室誘變，誘變完成后，將相同時(shí)間的3個(gè)平行混合，每個(gè)時(shí)間取IOOyL 用于菌落計(jì)數(shù)，0.5mL用于菌種保存，取剩余Iml菌液進(jìn)行鉛吸附試驗(yàn)；
[0008] S3，一次篩選：采用48孔板高通量篩選方法，用牙簽挑取誘變的單菌落于裝有 1.0 mL培養(yǎng)液的48孔深孔板中，并接種出發(fā)菌株JTl-YB作為對(duì)照，并置于36-38°C的搖床培 養(yǎng)23-25h，待培養(yǎng)完成后，通過(guò)與JTl-YB比較48孔深孔板中變渾濁的初步判斷為疑似突變 體菌株；
[0009] S4,二次篩選：將疑似突變體菌株分別均勻涂布于含有600mg/mL、800mg/mL、 1000mg/mL乙酸鉛的MRS瓊脂平板，同時(shí)接種出發(fā)菌株JTl-YB，培養(yǎng)23-25h后，挑去生長(zhǎng)菌落 做鉛吸附試驗(yàn)并保存菌種；
[0010] 35，生長(zhǎng)狀況分析:把菌株按1%接種量接種于?田直2.5、3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、 8.8的液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h測(cè)定0D600nm，以pH為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)圖 進(jìn)行分析；
[0011] S6，耐受膽鹽分析:取0.1 ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%膽鹽的液 體培養(yǎng)基中，36-38 °C培養(yǎng)23-25h，稀釋后，對(duì)適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，記錄生長(zhǎng)情況；
[0012] S7，耐受消化酶分析:取菌液接種于含1 %胃蛋白酶的液體培養(yǎng)基中，以不添加蛋 白酶的液體培養(yǎng)基作對(duì)照，在36-38 °C條件下培養(yǎng)Oh、8h并且取樣一次，對(duì)適當(dāng)倍數(shù)的進(jìn)行 平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。
[0013]優(yōu)選地，所述Sl中，將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種至固體培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)48h 后，將菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，在37 °C下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)24h，在對(duì)數(shù)末期獲得菌 體。
[0014] 優(yōu)選地，所述S3中，I .OmL培養(yǎng)液內(nèi)含400mg/mL乙酸鉛。
[0015] 優(yōu)選地，所述S6中，取0.1 ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%膽鹽的液 體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)24h，稀釋后，對(duì)適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，記錄生長(zhǎng)情況。
[0016] 本發(fā)明中，將JTl-YB培養(yǎng)后用等離子設(shè)備進(jìn)行誘變處理，控制變量以氬氣為載氣， 保持電壓不變。由于它的工作氣流量，電源功率，等離子體發(fā)射源與樣品之間的距離等參數(shù) 是一定的，所以主要通過(guò)改變時(shí)間參數(shù)來(lái)進(jìn)行誘變操作。把誘變后的菌液用鉛溶液吸附后 用原子吸收分光光度計(jì)處理，通過(guò)與誘變前菌液的鉛吸附能力對(duì)比可以直截了當(dāng)?shù)目闯?最佳誘變時(shí)間。由于原子吸收分光光度計(jì)測(cè)得的是菌液吸附鉛之后鉛離子的濃度，所以鉛 濃度越低表示鉛吸附性越好，吸附能力越高。
[0017] 高通量篩選是獲得目標(biāo)突變株的主要步驟，它大大加快了篩選的進(jìn)程。使用高通 量篩選方法可以簡(jiǎn)便、快速地進(jìn)行幾百個(gè)誘變株的篩選，增大了獲得目標(biāo)菌株的幾率，并且 篩選結(jié)果的重復(fù)性高。根據(jù)出發(fā)菌株JTl-YB能在含有400g/mL的醋酸鉛的MRS上生長(zhǎng)，將誘 變菌落分別接種至含有400mg/mL醋酸鉛的MRS肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，在誘變菌株 中，有168株誘變菌株均能生長(zhǎng)。然后將生長(zhǎng)的菌株在分別接種到含有600mg/mL、800mg/mL、 1000mg/mL乙酸鉛平板，最后有30株突變體菌株能夠耐受在含有1000mg/mL醋酸鉛的MRS瓊 脂平板上生長(zhǎng)，比出發(fā)菌株JTl-YB(能在800mg/mL醋酸鉛的MRS瓊脂上生長(zhǎng))對(duì)鉛的耐受力 提高了 1.25倍。
[0018] 本發(fā)明步驟清晰，操作簡(jiǎn)單，可以準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選 及其分析，適合推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明提出的一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法的菌 株生長(zhǎng)狀況曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說(shuō)。
[0021] 本發(fā)明提出的一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，包括以 下步驟：
[0022] Sl，細(xì)菌培養(yǎng):將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種到MRS固體培養(yǎng)基上，在36°C培養(yǎng)47h后， 將菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，在36 °C下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)23h，在對(duì)數(shù)末期獲得菌體； [0023] S2,誘變:在無(wú)菌條件下分別取培養(yǎng)后的菌液1.5mL于18個(gè)一次性小平板中，分別 作標(biāo)簽Imin，3min，5min，7min，9min，每個(gè)時(shí)間做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白對(duì)照，無(wú)菌條件 下，置于等離子體發(fā)生室誘變，誘變完成后，將相同時(shí)間的3個(gè)平行混合，每個(gè)時(shí)間取IOOyL 用于菌落計(jì)數(shù)，0.5mL用于菌種保存，取剩余Iml菌液進(jìn)行鉛吸附試驗(yàn)；
[0024] S3，一次篩選：采用48孔板高通量篩選方法，用牙簽挑取誘變的單菌落于裝有 1.0 mL培養(yǎng)液的48孔深孔板中，并接種出發(fā)菌株JTl-YB作為對(duì)照，并置于36°C的搖床培養(yǎng) 23h，待培養(yǎng)完成后，通過(guò)與JTl-YB比較48孔深孔板中變渾濁的初步判斷為疑似突變體菌 株；
[0025] S4,二次篩選：將疑似突變體菌株分別均勻涂布于含有600mg/mL、800mg/mL、 lOOOmg/mL乙酸鉛的MRS瓊脂平板，同時(shí)接種出發(fā)菌株JTl-YB，培養(yǎng)23h后，挑去生長(zhǎng)菌落做 鉛吸附試驗(yàn)并保存菌種；
[0026] S5，生長(zhǎng)狀況分析:把菌株按1 %接種量接種于pH值2.5、3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、 8.8的液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h測(cè)定0D600nm，以pH為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)圖 進(jìn)行分析；
[0027] S6，耐受膽鹽分析:取0.1 ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%膽鹽的液 體培養(yǎng)基中，36 °C培養(yǎng)23h，稀釋后，對(duì)適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，記錄生長(zhǎng)情況；
[0028] S7，耐受消化酶分析:取菌液接種于含1 %胃蛋白酶的液體培養(yǎng)基中，以不添加蛋 白酶的液體培養(yǎng)基作對(duì)照，在36°C條件下培養(yǎng)0h、8h并且取樣一次，對(duì)適當(dāng)倍數(shù)的進(jìn)行平板 計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。
[0029]本發(fā)明中，菌株和試劑包括:耐鉛乳酸菌JT1-YB，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品風(fēng)險(xiǎn)分析與 防控實(shí)驗(yàn)室提供。MRS液體培養(yǎng)基;MRS固體培養(yǎng)基;LB肉湯;營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有 限責(zé)任公司。乙酸鉛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0030] 主要試驗(yàn)設(shè)備與儀器包括：等離子發(fā)生器購(gòu)自美國(guó)Dressier公司；Optima 8x00電 感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES)，美國(guó)PE公司；精密pH計(jì)，德國(guó)賽多利斯股份公司； PNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-20bR型高速冷凍離心機(jī)，上海 安亭科學(xué)儀器廠;摩爾超純水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。
[0031] 研究具體方法包括：
[0032] (1)細(xì)菌的培養(yǎng):將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)48h后， 將菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，37 °C下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)24h，在對(duì)數(shù)末期獲得菌體(相 應(yīng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)為6.0 X IO8CFlVmL);
[0033] (2)最佳誘變時(shí)間的確定:在無(wú)菌條件下分別取培養(yǎng)后的菌液1.5mL于18個(gè)一次性 小平板中，分別作標(biāo)簽Imin，3min，5min，7min，9min，每個(gè)時(shí)間做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白對(duì) 照。無(wú)菌條件下，置于等離子體發(fā)生室誘變。誘變完成后，將相同時(shí)間的3個(gè)平行混合，每個(gè) 時(shí)間取IOOyL用于菌落計(jì)數(shù)，0.5mL用于菌種保存，取剩余Iml菌液進(jìn)行鉛吸附試驗(yàn)；
[0034] (3)高通量篩選突變體菌株:為了實(shí)現(xiàn)快速篩選出吸附能力高的突變菌體，利用48 孔板高通量篩選方法。用牙簽挑取誘變的單菌落于裝有I.OmL培養(yǎng)液(含400mg/mL乙酸鉛） 的48孔深孔板中，并接種出發(fā)菌株JTl-YB作為對(duì)照，并置于37°C的搖床培養(yǎng)24h。待培養(yǎng)完 成后，通過(guò)與JTl-YB比較48孔深孔板中變渾濁的初步判斷為疑似突變體菌株；
[0035] (4)突變體菌株的復(fù)選:利用高通量篩選方法可以初步篩選出鉛吸附能力提高的 突變體。要獲得吸附性提高的菌株，要進(jìn)行重發(fā)篩選。將上述生長(zhǎng)的細(xì)菌分別均勻涂布于含 有600mg/mL、800mg/mL、lOOOmg/mL乙酸鉛的MRS瓊脂平板，同時(shí)接種出發(fā)菌株JTl-YB，培養(yǎng) 24h后，挑去生長(zhǎng)菌落做鉛吸附試驗(yàn)并保存菌種；
[0036] (5)突變體菌株不同pH條件下的生長(zhǎng)狀況：把菌株按1 %接種量接種于pH值2.5、 3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、8.8的液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h測(cè)定0D600nm，以pH為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)并分析；
[0037] (6)突變體菌株耐受膽鹽實(shí)驗(yàn)：取0.1ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%， 0.8 %膽鹽的液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)24h，稀釋后，對(duì)適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，記錄生長(zhǎng)情況。
[0038] (7)突變體菌株耐受消化酶實(shí)驗(yàn):取菌液接種于含1%胃蛋白酶的液體培養(yǎng)基中， 以不添加蛋白酶的液體培養(yǎng)基作對(duì)照，在37 °C條件下培養(yǎng)Oh、8h并且取樣一次，對(duì)適當(dāng)倍數(shù) 的進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。
[0039]將JTl-YB培養(yǎng)后用等離子設(shè)備進(jìn)行誘變處理，控制變量以氬氣為載氣，保持電壓 不變。由于它的工作氣流量，電源功率，等離子體發(fā)射源與樣品之間的距離等參數(shù)是一定 的，所以主要通過(guò)改變時(shí)間參數(shù)來(lái)進(jìn)行誘變操作。把誘變后的菌液用鉛溶液吸附后用原子 吸收分光光度計(jì)處理，通過(guò)與誘變前菌液的鉛吸附能力對(duì)比可以直截了當(dāng)?shù)目闯鲎罴颜T變 時(shí)間。由于原子吸收分光光度計(jì)測(cè)得的是菌液吸附鉛之后鉛離子的濃度，所以鉛濃度越低 表示鉛吸附性越好，吸附能力越高，吸附鉛后鉛離子的濃度結(jié)果見(jiàn)下表： LUU41 j 上表中，Pbl為測(cè)得酷酸鉗浴淞濃度，
的鉗吸附濃度，Pb3和Pb473處埋時(shí)丨日J(rèn) Imin的菌液，Pb5和Pb6為處理時(shí)間3min的菌液，Pb7和Pb8為處理時(shí)間5min的菌液，Pb9和 PblO為處理時(shí)間7min的菌液，Pbll和Pbl2為處理時(shí)間9min的菌液。由于醋酸鉛為弱電解 質(zhì)，所以測(cè)得醋酸鉛溶液Pbl僅為68.12mg/ml，上述實(shí)驗(yàn)證明，誘變時(shí)間為7min時(shí)，鉛吸附能 力最強(qiáng)，為最佳誘變時(shí)間。
[0042]高通量篩選是獲得目標(biāo)突變株的主要步驟，它大大加快了篩選的進(jìn)程。使用高通 量篩選方法可以簡(jiǎn)便、快速地進(jìn)行幾百個(gè)誘變株的篩選，增大了獲得目標(biāo)菌株的幾率，并且 篩選結(jié)果的重復(fù)性高。根據(jù)出發(fā)菌株JTl-YB能在含有400g/mL的醋酸鉛的MRS上生長(zhǎng)，將誘 變菌落分別接種至含有400mg/mL醋酸鉛的MRS肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，在誘變菌株 中，有168株誘變菌株均能生長(zhǎng)。然后將生長(zhǎng)的菌株在分別接種到含有600mg/mL、800mg/mL、 1000mg/mL乙酸鉛平板，最后有30株突變體菌株能夠耐受在含有1000mg/mL醋酸鉛的MRS瓊 脂平板上生長(zhǎng)，比出發(fā)菌株JTl-YB(能在800mg/mL醋酸鉛的MRS瓊脂上生長(zhǎng))對(duì)鉛的耐受力 提高了 1.25倍。進(jìn)一步做鉛吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，30株突變體菌株有一株的鉛吸附能力提高明顯， 命名為Rl，30個(gè)單菌落吸附鉛離子后鉛的濃度結(jié)果見(jiàn)下表：

[0045] 其中PbO為醋酸鉛溶液，Pbl為JTl-YB吸附鉛的濃度，Pb2-Pb32為30個(gè)單菌落經(jīng)培 養(yǎng)后吸附鉛的濃度。
[0046]菌株的耐酸特性:pH不同條件下，隨著pH增大，細(xì)菌生長(zhǎng)變快，當(dāng)pH> 6.5時(shí)，速度 減緩，逐漸下降，其耐酸性數(shù)據(jù)如圖1，據(jù)此判定菌株的最適PH為6.5。
[0047] 膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)：菌株在0.3%、0.5%、0.7%、0.9%膽鹽的液體培養(yǎng)基中24h，經(jīng)過(guò) 適當(dāng)倍數(shù)記錄細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明該菌株可以耐受0.8%膽鹽，能夠順利到達(dá)腸道發(fā)揮 作用。
[0048] 消化酶耐受實(shí)驗(yàn):與不含胰蛋白酶的對(duì)照組相比，突變體Rl菌株在含0.1 %胰蛋白 酶的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，說(shuō)明菌株可以在一定濃度的胰蛋白酶環(huán)境下正常生長(zhǎng)。
[0049] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0050] 生物樣品保藏信息：
[0051 ]保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0052]保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) [0053] 保藏日期：2015年12月28日
[0054] 保藏編號(hào)：CGMCC NO.11944
[0055] 分類(lèi)命名：屎腸球菌Enterococcus faecium。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，其特征在于，包括以下步 驟： S1，細(xì)菌培養(yǎng):將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種到MRS固體培養(yǎng)基上，在36-38°C培養(yǎng)47-49h 后，將菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，在36-38 °C下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)23-25h，在對(duì)數(shù)末期 獲得菌體； S2,誘變:在無(wú)菌條件下分別取培養(yǎng)后的菌液1.5mL于18個(gè)一次性小平板中，分別作標(biāo) 簽lmin，3min，5min，7min，9min，每個(gè)時(shí)間做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白對(duì)照，無(wú)菌條件下，置 于等離子體發(fā)生室誘變，誘變完成后，將相同時(shí)間的3個(gè)平行混合，每個(gè)時(shí)間取lOOyL用于菌 落計(jì)數(shù)，0.5mL用于菌種保存，取剩余l(xiāng)ml菌液進(jìn)行鉛吸附試驗(yàn)； S3，一次篩選:采用48孔板高通量篩選方法，用牙簽挑取誘變的單菌落于裝有1. OmL培 養(yǎng)液的48孔深孔板中，并接種出發(fā)菌株JT1-YB作為對(duì)照，并置于36-38°C的搖床培養(yǎng)23-25h，待培養(yǎng)完成后，通過(guò)與JT1-YB比較48孔深孔板中變渾濁的初步判斷為疑似突變體菌 株； 34，二次篩選:將疑似突變體菌株分別均勾涂布于含有60〇11^/1111^、80〇11^/111]^、100〇11^/1111^ 乙酸鉛的MRS瓊脂平板，同時(shí)接種出發(fā)菌株JT1-YB，培養(yǎng)23-25h后，挑去生長(zhǎng)菌落做鉛吸附 試驗(yàn)并保存菌種； S5，生長(zhǎng)狀況分析:把菌株按1 %接種量接種于pH值2.5、3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、8.8的 液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h測(cè)定0D600nm，以pH為橫坐標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)圖進(jìn)行 分析圖進(jìn)行分析； S6，耐受膽鹽分析:取0. lml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%膽鹽的液體培 養(yǎng)基中，36-38 °C培養(yǎng)23-25h，稀釋后，對(duì)適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，記錄生長(zhǎng)情況； S7,耐受消化酶分析:取菌液接種于含1%胃蛋白酶的液體培養(yǎng)基中，以不添加蛋白酶 的液體培養(yǎng)基作對(duì)照，在36-38°C條件下培養(yǎng)0h、8h并且取樣一次，對(duì)適當(dāng)倍數(shù)的進(jìn)行平板 計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，其 特征在于，所述S1中，將甘油管中菌種劃線(xiàn)接種到MRS固體培養(yǎng)基上，在37 °C培養(yǎng)48h后，將 菌種轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，在37 °C下180r/min震蕩需氧培養(yǎng)24h，在對(duì)數(shù)末期獲得菌體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，其 特征在于，所述S3中，1 .OmL培養(yǎng)液內(nèi)含400mg/mL乙酸鉛。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種等離子體正向誘變耐鉛乳酸菌的篩選及其分析方法，其 特征在于，所述S6中，取0. lml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%膽鹽的液體培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)24h，稀釋后，對(duì)適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，記錄生長(zhǎng)情況。
【文檔編號(hào)】C12N13/00GK105861481SQ201610051673
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日
【發(fā)明人】都啟晶
【申請(qǐng)人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)