基于眼鏡蛇毒piii型金屬蛋白酶的溶栓藥及其應(yīng)用
【專利摘要】基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶，所述蛋白酶是從中華眼鏡蛇又稱舟山種眼鏡蛇，分類名：Naja atra的蛇毒中分離純化獲得；所述蛋白酶是單鏈糖蛋白，結(jié)構(gòu)解析表明具有3個結(jié)構(gòu)域：金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，屬于PIII型蛇毒金屬蛋白酶。其名稱分別為Atrase A和Atrase B，其序列為：AtraseA：SEQ ID No.1；AtraseB：SEQ ID No.2。目標(biāo)蛋白和其溶栓藥能誘導(dǎo)內(nèi)源性纖溶酶原激活劑tPA釋放從而具有溶栓作用，可用于血栓性疾病的溶栓治療。
【專利說明】
基于眼鏡蛇毒PM I型金屬蛋白酶的溶栓藥及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種基于眼鏡蛇毒 PIII型金屬蛋白酶的溶栓藥及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 心腦血管疾病是現(xiàn)代社會中的高發(fā)危重病，死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人類生命 健康。其中，血栓性疾病的危害最為嚴(yán)重，臨床上以急性心肌梗死、缺血性腦卒中、急性肺栓 塞為主要表現(xiàn)，其發(fā)病率、致殘率、致死率較高。近30年來，溶栓療法已廣泛用于各種血管栓 塞性疾病的治療，取得了顯著的效果，已成為治療血栓性疾病的有效手段。我國是人口大 國，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，心腦血管疾病發(fā)病率日趨增高，已成為威脅人民生命健康的主要疾 病。目前國內(nèi)臨床使用的溶栓藥物尤其是高端藥物均為國外研究開發(fā)，國內(nèi)多以跟蹤研究 和仿制為主。在歐美等西方發(fā)達國家，目前臨床使用的溶栓藥以第二代藥物重組組織性纖 溶酶原激活劑rt_PA(recombinant tissue type plasminogen activator,rt_PA)為主，其 價格昂貴，國內(nèi)難以普及，導(dǎo)致目前國內(nèi)臨床上使用的主力溶栓藥物仍以第一代溶栓藥尿 激酶(urokinase，UK)為主。國內(nèi)迫切需要研發(fā)自主創(chuàng)新的新型溶栓藥以打破國外壟斷?；?于溶栓藥物有較大的社會現(xiàn)實需求和廣闊的市場前景，以及目前已有的溶栓藥物總體上仍 存在特異性不高、半衰期短、出血危險等缺點，尋找、發(fā)現(xiàn)和研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的溶栓 效果好、副作用小的新型溶栓藥物符合國家在健康領(lǐng)域內(nèi)的戰(zhàn)略需求，具有重要的社會經(jīng) 濟意義和價值。
[0003] 溶栓藥物的研究開發(fā)一直是國際上藥物研究的熱點。目前一般將溶栓藥物分為三 代。第一代以鏈激酶(streptokinase, SK)和UK為代表。這一類藥的主要缺點在于對纖維蛋 白沒有選擇性或選擇性較低，可引起全身性纖溶激活和出血危險。UK目前仍是國內(nèi)的主力 溶栓藥。第二代以組織性纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator,t-ΡΑ)為 代表。采用基因工程技術(shù)可獲得重組的rt-PA。該藥對纖維蛋白的選擇性較好，但臨床上為 獲得較好的溶栓效果而大劑量使用時，會失去對纖維蛋白的選擇性，導(dǎo)致纖溶過強，引發(fā)出 血。該藥半衰期短，只有3-4分鐘。在歐美等發(fā)達國家，rt-PA已成為主流溶栓藥。其價格昂 貴，國內(nèi)目前尚無法普及。目前，國內(nèi)外均在發(fā)展第三代溶栓藥，包括?；w溶酶原-鏈激 酶活化復(fù)合物(APSAC)、重組單鏈尿激酶(rscu-PA)、葡萄球菌激酶(Sak)以及從南美吸血蝙 蝠中提取得到的纖溶酶原激活劑(Bat)，其中部分已進入臨床試驗。
[0004] 目前臨床上常用的溶栓藥均為纖溶酶原激活劑，且已上市和在研的溶栓藥物全部 為屬于絲氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)藥物。
[0005] 蛇毒是天然的最復(fù)雜的毒蛋白混合物。蛇毒中含有結(jié)構(gòu)功能多樣的以心血管系統(tǒng) 為靶標(biāo)的活性蛋白，已成為現(xiàn)代新藥及臨床診斷試劑研究開發(fā)的重要資源庫。國外于20世 紀(jì)60年代以來陸續(xù)研究開發(fā)了作用于血液系統(tǒng)的蛋白酶制劑，如從馬來西亞紅口蝮蛇毒分 離的蛋白酶安克洛酶(Ancrod)、從巴西矛頭複蛇毒中分離制備的巴曲酶(batroxobin)以及 日本東菱克栓酶(batroxobin)。國內(nèi)從上世紀(jì)70年代末開始，積極開展了這方面的研究工 作。先后從蝮蛇毒和尖吻蝮蛇毒中分離純化出相關(guān)的纖溶酶。目前，國內(nèi)批準(zhǔn)了2種蛇毒制 劑進入臨床使用：一是降纖酶，是從我國東北長白山產(chǎn)白眉蝮蛇蛇毒和江浙產(chǎn)蝮蛇毒中分 離純化獲得的凝血酶樣酶；另一種是蘄蛇酶，是從尖吻蝮蛇毒(五步蛇）中分離純化獲得的 凝血酶樣酶。這類酶制劑用于血栓性疾病防治的機制在于它們可以降解纖維蛋白原、改善 血液流變學(xué)的作用以及纖溶作用。另外，這類降纖酶在體內(nèi)降解纖維蛋白原的產(chǎn)物能激發(fā) 血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放t-PA，將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，從而促進纖溶作用。上述國內(nèi)外開發(fā)的 蛇毒降纖酶均屬于蛇毒絲氨酸蛋白酶。
[0006] 本發(fā)明涉及基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶的溶栓藥及其應(yīng)用。蛇毒金屬蛋白酶 (snake venom metalloproteinase，SVMP)屬于金屬蛋白酶M12家族Reprolysin成員，主要 存在于蝰科和響尾蛇科蛇毒中，其結(jié)構(gòu)中共有的顯著特點是在酶的活性中心含有一段 "HEXGHXXGXXHD"的保守序列，鋅離子與該保守區(qū)結(jié)合。SVMP的顯著毒性特征是具有出血毒 性，多具有水解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)、抗凝、促凝、抗血小板聚集等活性，在血循毒類蛇 毒的毒性作用中扮演了重要角色。根據(jù)分子量大小和所含結(jié)構(gòu)域數(shù)目可以將蛇毒金屬蛋白 酶分為4類:PI型蛇毒金屬蛋白酶僅含有一個金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域;PII型含有一個金屬蛋白 酶結(jié)構(gòu)域和一個去整合素或類去整合素結(jié)構(gòu)域;ΡΠΙ型比PII型多一個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu) 域，而PIV型在C端還存在第四個結(jié)構(gòu)域-C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。
[0007] 迄今為止，從不同種的眼鏡蛇毒中分離純化出不多的SVMP，如atrahagin、 mocarhagin、kaouthiagin、NN_PF3等?？傮w上，由于眼鏡蛇毒沒有表現(xiàn)出明顯的蛋白水解酶 的活性，因此，針對眼鏡蛇毒中的SVMP開展的研究不多。這些從眼鏡蛇毒中獲得的纖溶酶或 SVMP多數(shù)都能水解纖維蛋白原的α鏈，并都表現(xiàn)出抗血小板聚集的活性研究，其抗血小板聚 集的主要機制為酶切血小板膜糖蛋白GPIb或vWF，這些蛋白質(zhì)分子有可能成為抗血小板聚 集或降纖維蛋白原的潛在藥物分子，而在針對溶栓方面都沒有進行研究和報道。從蝰科和 響尾蛇科蛇毒中分離制備獲得的SVMP由于其固有的出血毒性，使其無法用于相關(guān)藥物的制 備。
[0008] 本案中的眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶Atrase A和Atrase B是目前從舟山種眼鏡 蛇(Naja atra，中華眼鏡蛇)蛇毒中經(jīng)分離純化獲得的僅有的2個經(jīng)過結(jié)構(gòu)解析鑒定的PIII 型金屬蛋白酶，對其序列結(jié)構(gòu)的測定和分析表明，A t r a s e A和A t r a s e B由 metalloproteinase domain、Disintegrin_like domain和Cysteine-rich domain三個結(jié) 構(gòu)域組成。Atrase A和Atrase B除具有顯著的抗血小板聚集和抗凝活性外，具有顯著的溶 栓特性是其它眼鏡蛇毒金屬蛋白酶或蛇毒纖溶酶所不具備的。其在低劑量時即能有效溶 栓，效果優(yōu)于陽性對照藥UK和rt-PA。其機制在于通過作用補體而誘導(dǎo)了內(nèi)源性t-PA的釋 放，從而激活纖溶酶原，高效溶栓。并且在其Cysteine-rich domain和Disintegrin_like domain中分別含有能與血栓部位活化血小板GPIIb/IIIa受體特異識別的R⑶和類R⑶序列， 具有靶向溶栓的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目標(biāo)蛋白具有機制新穎的溶栓活性和有效抑制血小板聚集和顯 著抗凝的多重功效以及靶向溶栓的結(jié)構(gòu)，這些特點與新一代溶栓藥物研發(fā)的方向與趨勢相 吻合，使其作為溶栓藥物具備了獨特的結(jié)構(gòu)與功效優(yōu)勢，以目標(biāo)蛋白制備溶栓藥，具有其它 蛇毒金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶所不具備的獨特優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供基于眼鏡蛇毒PIII型金 屬蛋白酶的溶栓藥及其應(yīng)用。
[0010] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0011] 基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶，所述蛋白酶是從中華眼鏡蛇又稱舟山種眼鏡 蛇，分類名:Naja atra的蛇毒中分離純化獲得;所述蛋白酶是單鏈糖蛋白，結(jié)構(gòu)解析表明具 有3個結(jié)構(gòu)域:金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，屬于PIII型蛇 毒金屬蛋白酶。
[0012] 進一步的，所述基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶，其名稱分別為Atrase A和 Atrase B，其中Atrase A推導(dǎo)分子量為46717.14,等電點為7.281;Atrase B推導(dǎo)分子量為 44749.39，等電點為7.238;兩序列的核苷酸相似度為85.9 %，氨基酸相似度為65.4 %，其序 列為：AtraseA:SEQIDNo. I ;AtraseB:SEQIDNo.2;
[0013] 進一步的，所述基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶具有水解纖維蛋白原α鏈的活性， 該活性能被金屬螯合劑EDTA、EGTA、1，ΙΟ-phenanthroline和還原劑DTT完全抑制；目標(biāo)蛋白 Atrase A和Atrase B的精確分子質(zhì)量分別為49.3kDa和49.4kDa，但其表觀分子量依據(jù)不同 的測定方法有所不同，范圍在45kDa_65kDa之間:Atrase A在還原性和非還原性SDS-PAGE中 分別為64.6和57. IkDa，凝膠過濾方法測定為56.5kDa; Atrase B在還原性和非還原性SDS-PAGE中分別為62.2和55.8kDa，凝膠過濾方法測定為54.3kDa。等點聚焦的測定結(jié)果表明，變 性條件下目標(biāo)蛋白Atrase A和Atrase B的等電點分別為9.6和9.7,目標(biāo)蛋白沒有水解酪蛋 白活性，也沒有精氨酸酯酶活性和纖維蛋白水解活性；目標(biāo)蛋白含有糖基，其中性糖含量為 5%〇
[0014] 基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶的溶栓藥，其由上述基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋 白酶添加其他助劑制成的凍干粉針劑。
[0015] 進一步的，所述溶栓藥由下述組分組成：眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶、磷酸鈉、精 氨酸、吐溫80。
[0016] 進一步的，所述溶栓藥凍干粉針劑復(fù)溶后由下述組分組成:pH為7.4的0.0 lM磷酸 鈉緩沖液〇.5ml中含有基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶純化樣品0.5mg、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15% 的精氨酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 01 %的吐溫80。
[0017] 進一步的，所述眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶在制備溶栓藥中的應(yīng)用。
[0018] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0019] 本發(fā)明目標(biāo)蛋白和其溶栓藥具有明顯的溶栓作用:通過誘導(dǎo)內(nèi)源性纖溶酶原激活 劑tPA釋放從而產(chǎn)生明顯的溶栓作用。目標(biāo)蛋白通過誘導(dǎo)內(nèi)源性纖溶酶原激活劑tPA釋放從 而產(chǎn)生溶栓作用的機制，并且基于其結(jié)構(gòu)特征具有血栓靶向性?？捎糜谘ㄋㄈ约膊』?相關(guān)病理情況下血栓生成的治療，沒有出血風(fēng)險，溶栓作用顯著。
【附圖說明】
[0020] 圖1目標(biāo)蛋白（AtraseA與AtraseB)的一級結(jié)構(gòu)；
[0021] 圖2目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE電泳；
[0022] 其中：泳道1和4分別為非還原和還原條件下的Atrase B，泳道2和5分別為非還原 和還原條件下的Atrase A，泳道3為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；
[0023] 圖3變性條件下的目標(biāo)蛋白等電聚焦;其中：泳道1為Atrase A，泳道2為Atrase B;
[0024] 圖4目標(biāo)蛋白Atrase A的純化制備；其中：A.SP Sephadex C-25層析;B·Sephacryl S-200層析；C.HiTrap Heparin HP層析；
[0025] 圖5目標(biāo)蛋白Atrase B的純化制備；其中，A· SP Sephadex C-25層析；B ·HiTrap !feparin HP層析；C.HiTrap Q HP層析;D.HiTrap SP HP層析；
[0026] 圖6溶栓藥對內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能分子釋放的影響圖；其中，A: V〇.〇5，、〈〇.01，與 Blank相比；#p〈0 · 05，##p〈0 · 01，與Ih組相比；B:*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，與Blank相比；#p〈0 · 05，##p 〈0.01，與Ih組相比；*p〈0.05 廣p〈0.01，與Blank相比；#p〈0.05，##p〈0.01，與Ih組相比；
[0027]圖7溶栓藥對內(nèi)皮細(xì)胞纖溶活性的影響；其中:A:*p〈〇.〇5廣p〈〇.〇1，與(Atrase A+ INHS)組相比；#p〈0 · 05，##p〈0 · 01，與Blank相比；B:*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，與（Atrase A+INHS)組 相比；(：:*?〈0.05，、〈0.01，與81&吐相比；
[0028] 圖8低劑量溶栓藥對大鼠體內(nèi)纖溶活性的影響圖，其中乍〈0.05，#P〈0.01，與 control 相比；
[0029] 圖9高劑量溶栓藥對大鼠體內(nèi)纖溶活性的影響圖，其中乍〈0.05，#P〈0.01，與 control 相比；
[0030] 圖10溶栓藥對大鼠頸總動脈血栓的溶栓作用圖，其中，P〈0.001，模型組與假手術(shù) 組相比;P〈〇. 001，低劑量組與模型組相比；P〈〇. 05,高劑量組與低劑量組相比;P〈0.01，低劑 量組與阿替普酶組相比；P〈〇. 001，高劑量組與阿替普酶組相比；P〈〇. 001，阿替普酶組與尿 激酶組相比。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步詳細(xì)描述：
[0032] 實施例1:
[0033] 目標(biāo)蛋白是從中華眼鏡蛇(舟山種眼鏡蛇）（分類名：Naja atra)蛇毒中分離純化 獲得。目標(biāo)蛋白是單鏈糖蛋白，結(jié)構(gòu)解析表明具有3個結(jié)構(gòu)域:金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素 樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，屬于PIII型蛇毒金屬蛋白酶(圖1)。
[0034] 表1根據(jù)一級結(jié)構(gòu)推導(dǎo)的目標(biāo)蛋白相關(guān)理化指標(biāo)
[0036]如表1所示：目標(biāo)蛋白具有水解纖維蛋白原α鏈的活性，該活性能被金屬螯合劑 EDTA、EGTA、l，l〇-phenanthroline和還原劑DTT完全抑制。目標(biāo)蛋白Atrase A和Atrase B的 實際分子量分別約為49.3kDa和49.4kDa，其序列為：AtraseA : SEQIDNo . I; AtraseB : SEQIDNo. 2;但依據(jù)不同的測定方法其表觀分子量有所不同，范圍在45kDa-65kDa之間 (Atrase A在還原性和非還原性SDS-PAGE中分別為64.6和57. IkDa(圖2)，凝膠過濾方法測 定為56.5kDa;Atrase B在還原性和非還原性SDS-PAGE中分別為62.2和55.8kDa(圖2)，凝膠 過濾方法測定為54.3kDa)。等點聚焦的測定結(jié)果表明，變性條件下目標(biāo)蛋白Atrase A和 Atrase B的等電點分別為9.6和9.7(圖3)。目標(biāo)蛋白沒有水解酪蛋白活性，也沒有精氨酸酯 酶活性和纖維蛋白水解活性。目標(biāo)蛋白含有糖基，其中性糖含量約為5 %。
[0037]目標(biāo)蛋白Atrase A的分離純化
[0038]眼鏡蛇(Naja atra)粗毒溶解于pH 5.8、20mmol/L的乙酸鈉緩沖液，將此溶液上樣 于已用同樣緩沖液平衡好的SP Sephadex C-25coIumn(2.6 X 40cm)層析柱，用同樣的緩沖 液以30ml/h的流速進行洗脫，將未吸附在柱上的蛋白完全洗脫后，進行同樣緩沖液的NaCl 線性梯度洗脫(Ο-lmol/L)(圖4A)。
[0039]收集上述穿過峰中具有纖維蛋白原水解活性的部分 200column(2 ·6 X IlOcm)進行分子篩凝膠層析，以pH 7 · 4、含0 · lmol/L NaCl的 10mmol/L磷 酸鹽緩沖液在20ml/h的流速下進行層析柱的平衡和洗脫（圖4B)。
[0040] 收集分子篩層析中具有纖維蛋白原水解活性的部分，合并，超濾，將緩沖液更換為 pH 7.0、lOmmol/L的磷酸鹽緩沖液，然后上樣到已用同樣緩沖液平衡好的HiTrap Heparin HP C〇lumn(5ml)肝素親和層析柱，將未吸附在柱上的蛋白完全洗脫后，進行同樣緩沖液的 NaCl線性梯度洗脫(0-0.5mol/L)，收集最后一個洗脫峰，即為目標(biāo)蛋白Atrase A(圖4C)。制 備的目標(biāo)蛋白在還原和非還原SDS-PAGE以及等電聚焦中均為一條帶。
[0041] 收集上述肝素親和層析中具有纖維蛋白原水解活性的部分，合并，超濾，將緩沖液 更換為pH 7.4、10mmol/L的磷酸鹽緩沖生理鹽水，測定蛋白含量，低溫凍存?zhèn)溆谩?br>[0042] 目標(biāo)蛋白Atrase B的分離純化
[0043]眼鏡蛇(Naja atra)粗毒溶解于pH 5.8、20mmol/L的乙酸鈉緩沖液，將此溶液上樣 于已用同樣緩沖液平衡好的SP Sephadex C-25coIumn(2.6 X 40cm)層析柱，用同樣的緩沖 液以30ml/h的流速進行洗脫，將未吸附在柱上的蛋白完全洗脫后，進行同樣緩沖液的NaCl 線性梯度洗脫(Ο-lmol/L)(圖5A)。
[0044]收集SP Sephadex C-25層析梯度洗脫部分中具有纖維蛋白原水解活性的組分，合 并，超濾，將緩沖液更換為pH 7.0、10mmol/L的磷酸鹽緩沖液，然后上樣到已用同樣緩沖液 平衡好的HiTrap Heparin HP column(5ml)肝素親和層析柱，將未吸附在柱上的蛋白完全 洗脫后，進行同樣緩沖液的NaCl線性梯度洗脫(0-0.6mol/L)，收集最后一個洗脫峰（圖5B)。 [0045]將上述肝素親和層析中收集的的洗脫峰合并液的緩沖液更換為pH8.9的25mM Tris-HCl緩沖液，然后上樣到已用同樣緩沖液平衡好的HiTrap Q HP層析柱（Iml)，將未吸 附在柱上的蛋白完全洗脫后，進行同樣緩沖液的NaCl線性梯度洗脫(0-0.5mol/L)，收集梯 度洗脫的第一個大峰(圖5C)。
[0046]將上述HiTrap Q HP層析中收集的洗脫峰合并液的緩沖液更換為pH 7.0的IOmM磷 酸鹽緩沖液，然后上樣到已用同樣緩沖液平衡好的HiTrap SP HP層析柱（lml)，將未吸附在 柱上的蛋白完全洗脫后，進行同樣緩沖液的NaCl梯度洗脫（0-0.5mol/L):依次進行0-0.2mol/L的梯度洗脫、0.2mol/L的水平洗脫和0.3mol/L的水平洗脫，收集最后一個洗脫峰， 即為目標(biāo)蛋白Atrase B(圖f5D)。制備的目標(biāo)蛋白在還原和非還原SDS-PAGE以及等電聚焦中 均為一條帶。
[0047]將目標(biāo)蛋白合并液進行超濾濃縮，并將緩沖液更換為pH 7.4的PBS后，測定蛋白含 量，低溫凍存?zhèn)溆谩?br>[0048] 制劑
[0049] 將純化的樣品按注射用粉針劑的生產(chǎn)技術(shù)要求制備成溶栓藥凍干粉針劑。所述溶 栓藥規(guī)格為〇. 5mg/支，由下述組分組成:所述溶栓藥凍干粉針劑復(fù)溶后由下述組分組成:pH 為7.4的0.0謂磷酸鈉緩沖液0.51111中含有基于眼鏡蛇毒？111型金屬蛋白酶純化樣品0.511^、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 15 %的精氨酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 %的吐溫80。
[0050] 本發(fā)明目標(biāo)蛋白和其溶栓藥具有明顯的溶栓作用:通過誘導(dǎo)內(nèi)源性纖溶酶原激活 劑tPA釋放從而產(chǎn)生明顯的溶栓作用。目標(biāo)蛋白通過誘導(dǎo)內(nèi)源性纖溶酶原激活劑tPA釋放從 而產(chǎn)生溶栓作用的機制，并且基于其結(jié)構(gòu)特征具有血栓靶向性?？捎糜谘ㄋㄈ约膊』?相關(guān)病理情況下血栓生成的治療，沒有出血風(fēng)險，溶栓作用顯著。
[0051 ] 實施例2:
[0052] 1.眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能上調(diào)的作用（以Atrase A為 例）
[0053] 1.1材料與試劑
[0054] 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular endothelial cells，HMEC);RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco;胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為天津灝洋生物制品科技有 限公司產(chǎn)品；t-PA(tissue plasminogen activator)、PAI-1 (plasminogen activator inhibitor)含量檢測ELISA試劑盒和活性測定試劑盒購自美國Assaypro公司；正常人血清 (normal human serum，NHS)由多名健康志愿者獻血制備而成，分裝后凍存于_80°C，經(jīng)補體 活性檢測正常，備用；滅活人血清（inactivated normal human serum，INHS)由NHS于56°C 孵育30min而得;Atrase A的分離純化制備同前;其余試劑均為符合實驗要求的分析純。
[0055] 1.2方法
[0056] 將NHS、Atrase A和無血清1640以3: 2:10的比例混合，37°C孵育1.5h，制備孵育混 合物，備用。將HMEC以I X IO4個/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24h后棄上清，用無 FBS的1640洗 一遍，加入150ul孵育混合物，再加入50ul含血清1640培養(yǎng)液。實驗同時設(shè)置有INHS+Atrase A孵育對照組、NHS對照組、INHS對照組、Atrase A對照組以及空白對照組。各組于加樣后Ih、 6h、12h取細(xì)胞上清，3000r/min離心10min，取上清，-80 °C凍存。細(xì)胞培養(yǎng)上清中t-PA、PAI-l 的含量和活性按試劑盒說明書操作。
[0057] 1.3統(tǒng)計學(xué)分析
[0058] 實驗數(shù)據(jù)以^土丨表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，組間多重比較采 用LSD法。
[0059] 1.4結(jié)果
[0060] Atrase A與NHS的孵育物能明顯上調(diào)HMEC釋放t-PA和PAI-I，衡量纖溶活性的t-PA/PAI-1明顯上調(diào)（圖6)。發(fā)色底物法測定的結(jié)果也表明Atrase A與NHS的孵育物能使纖溶 活性明顯上調(diào)（圖7)。實驗結(jié)果表明，HMEC纖溶功能的上調(diào)與目標(biāo)蛋白對補體的作用有關(guān)。 [0061 ] 實施例2:
[0062] 1.眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶對大鼠體內(nèi)纖溶功能的影響（以Atrase A為例）
[0063] 1.1實驗材料
[0064]溶栓藥Atrase A的制備同前；t-PA、PAI-I、PAP檢測試劑盒；其它試劑均為符合實 驗要求的試劑或藥品。
[0065] SPF級雄性SD大鼠購自重慶騰鑫實驗動物有限公司，體重250-280g，合格證號 SCXK(渝)2007-0005。動物實驗和動物福利符合相關(guān)動物實驗管理條例。實驗動物飼養(yǎng)于清 潔、恒溫、恒濕的環(huán)境中，實驗前均自由進食和進水。
[0066] 1.2實驗分組
[0067] 動物隨機分組。低劑量組分為對照組、2h、6h、12h和24h組，中劑量組分為對照組、 2h、6h、12h、24h、48h、72h、96h組，高劑量組分為對照組、2h、6h、12h、24h、48h、120h、196h組。 低劑量組和中劑量組中的每組均為10只大鼠，高劑量組中每組為6只大鼠。
[0068] 1.3血樣采集
[0069] 按照設(shè)計的劑量將樣品通過尾部靜脈注射給大鼠。根據(jù)不同組別的采集標(biāo)本時間 要求，提前20min用1 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，打開腹腔，通過腹主動脈采集血樣，用 0.109mol/L枸橡酸鈉按1:9比例進行抗凝。
[0070] 1.4纖溶功能的測定
[0071 ] 將取得的抗凝血以3000r/min離心15min，取上清，得到血衆(zhòng)，分裝凍存于-80°C，備 用。按照t-PA、PAI-l、PAP檢測試劑盒說明書測定各血漿標(biāo)本的t-PA、PAI-l、PAP。
[0072] 1.5統(tǒng)計學(xué)分析
[0073] 實驗數(shù)據(jù)以^±1表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，組間多重比較采 用LSD法。
[0074] 1.6結(jié)果
[0075] 低劑量溶栓藥(0.3mg/kg)能明顯上調(diào)大鼠體內(nèi)t-PA的釋放，對PAI-I沒有影響（圖 8);高劑量溶栓藥(3. Omg/kg)能明顯上調(diào)大鼠體內(nèi)t-PA和PAI-1 (圖9)。PAP的上調(diào)表明了大 鼠體內(nèi)纖溶活性的激活和上調(diào)。
[0076] 實施例3:
[0077] 1.眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶體內(nèi)溶栓的藥效作用（以Atrase A為例）
[0078] 1.1實驗材料
[0079]溶栓藥Atrase A的制備同前，SDS-PAGE檢測純度為電泳單一條帶，純化的樣品分 裝凍存于-80°C ;阿司匹林購自美國Sigma公司；尿激酶(urokinase，UK)為麗珠集團麗珠制 藥廠產(chǎn)品；重組人組織型纖溶酶原激活劑阿替普酶(rt-PA)為德國Boehringer Ingelheim 公司產(chǎn)品；其它試劑均為符合實驗要求的試劑或藥品。
[0080] SPF級雄性SD大鼠購自重慶騰鑫實驗動物有限公司，重量210-240g，合格證號SCXK (渝)2007-0005。動物實驗和動物福利符合相關(guān)動物實驗管理條例。實驗動物飼養(yǎng)于清潔、 恒溫、恒濕的環(huán)境中，實驗前均自由進食和進水。
[0081 ] 1.2實驗分組和方法
[0082] 大鼠隨機分為假手術(shù)組（sham)、模型組(model)、尿激酶組和rt-PA組以及Atrase A高、低劑量組，各組8只。采用大鼠頸總動脈血栓模型，以尿激酶和rt-PA為陽性對照藥，評 價目標(biāo)蛋白的溶栓作用。尿激酶組（10萬U/kg)和rt-PA組（10mg/kg)以及Atrase A高低劑量 組(3.0mg/kg、0.3mg/kg)在造模后30min，通過尾靜脈一次性注射給藥。給藥后1.5h，通過右 側(cè)頸總動脈采血，枸橡酸鈉抗凝，抗凝血以3 000r/min離心15min，制備抗凝血衆(zhòng)，用于測定 t-PA、PAP等指標(biāo)。取血完畢，迅速剪下左側(cè)頸總動脈血栓部位血管，放于濾紙上吸干殘血， 以電子分析天平測定其重量。
[0083] 1.3統(tǒng)計學(xué)分析
[0084] 實驗數(shù)據(jù)以表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，組間多重比較采 用LSD法。
[0085] 1.4結(jié)果
[0086] 低劑量溶栓藥即能有效溶栓，高劑量能進一步增強溶栓的效果，效果均優(yōu)于陽性 對照藥UK和rt-PA(圖10)。
[0087] 以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何 不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的 保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 基于眼鏡蛇毒Pin型金屬蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶是從中華眼鏡蛇又稱舟 山種眼鏡蛇，分類名:Naja atra的蛇毒中分離純化獲得;所述蛋白酶是單鏈糖蛋白，結(jié)構(gòu)解 析表明具有3個結(jié)構(gòu)域:金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，屬于 PIII型蛇毒金屬蛋白酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶，其特征在于，所述基于眼鏡 蛇毒PIII型金屬蛋白酶，其名稱分別為Atrase A和Atrase B，其中Atrase A推導(dǎo)分子量為 46717.14,等電點為7.281 ;Atrase B推導(dǎo)分子量為44749.39,等電點為7.238;兩序列的核 苷酸相似度為85 · 9 %，氨基酸相似度為65 · 4 %，其序列為:AtraseA: SEQ ID No · 1; AtraseB: SEQ ID Νο·2〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶，其特征在于，基于眼鏡蛇毒 PIII型金屬蛋白酶，其特征在于，所述基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶具有水解纖維蛋白 原α鏈的活性，該活性能被金屬螯合劑EDTA、EGTA、1，ΙΟ-phenanthroline和還原劑DTT完全 抑制；目標(biāo)蛋白Atrase A和Atrase B的精確分子質(zhì)量分別為49.3kDa和49.4kDa，但依據(jù)不 同的測定方法其表觀分子量有所不同，范圍在45kDa-65kDa之間:Atrase A在還原性和非還 原性SDS-PAGE中分別為64.6和57. lkDa，凝膠過濾方法測定為56.5kDa; Atrase B在還原性 和非還原性SDS-PAGE中分別為62.2和55.81^)&，凝膠過濾方法測定為54.31^) &。等點聚焦的 測定結(jié)果表明，變性條件下目標(biāo)蛋白Atrase A和Atrase B的等電點分別為9.6和9.7,目標(biāo) 蛋白沒有水解酪蛋白活性，也沒有精氨酸酯酶活性和纖維蛋白水解活性；目標(biāo)蛋白含有糖 基，其中性糖含量為5 %。4. 權(quán)利要求1-3任一所述基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶的溶栓藥，其特征在于，其由 上述基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶添加其他助劑制成的凍干粉針劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶的溶栓藥，其特征在于，所述 溶栓藥由下述組分組成:基于眼鏡蛇毒PII I型金屬蛋白酶，磷酸鈉、精氨酸、吐溫80。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶的溶栓藥，其特征在于，所述 溶栓藥凍干粉針劑復(fù)溶后由下述組分組成:pH為7.4的0.01M磷酸鈉緩沖液0.5ml中含有基 于眼鏡蛇毒ΡΠΙ型金屬蛋白酶純化樣品0.5mg、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的精氨酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.01 %的吐溫80。7. 基于眼鏡蛇毒PIII型金屬蛋白酶在制備溶栓藥中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/48GK105861476SQ201610305798
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】孫黔云, 王彩娥, 李紅玲, 李亞男
【申請人】貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室