小反芻獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒分子鑒別診斷方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明專利屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種同時鑒別小反當(dāng) 獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒的多重RT-PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，農(nóng)業(yè)部及各省市農(nóng)業(yè)部口出臺了一系列促進(jìn)草食畜牧業(yè)發(fā)展的文件和措 施，牛羊產(chǎn)業(yè)得到前所未有的發(fā)展良機(jī)。然而，一些牛羊外來病、新發(fā)傳染病(如小反當(dāng)獸疫 病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒)常引起牛羊大量發(fā)病、死亡，養(yǎng)殖場損失嚴(yán)重。
[0003] 小反當(dāng)獸疫（Peste des petits ruminants，PPR)，又名小反當(dāng)獸假性牛攝 (pseudorinderpest)、月市腸炎（pneumoenteritis)、口炎肺腸炎復(fù)合癥（stomatitis- pneumoenteritis complex)，是由小反當(dāng)獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus， PPRV)引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染小反當(dāng)動物，包括綿羊、山羊、水牛、巖羊、盤 羊等，W發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征，病死率高。非洲、亞洲、歐洲等國家流行廣泛，影響嚴(yán) 重。
[0004] 施馬倫貝格?。⊿chmallenberg disease，SBD)，由施馬倫貝格病毒 (Schmallenberg virus，SBV)感染引起，臨床癥狀為發(fā)熱、腹瀉、乏力等，W及奶牛產(chǎn)奶量降 低，新生幼畜出現(xiàn)缺陷等。目前，該病席卷整個歐洲，部分非洲和亞洲國家也被波及。
[0005] 庫布病毒化obuvirus，KBV)是小核糖核酸病毒科庫布病毒屬成員，為無囊膜RNA病 毒，庫布病毒屬至少分為4個種:人庫布病毒(也稱AicM病毒）、牛庫布病毒、羊庫布病毒及 豬庫布病毒。目前，庫布病毒引起的臨床癥狀主要為腹瀉。呈世界流行。
[0006] 當(dāng)前，牛羊等養(yǎng)殖場中病原混合感染嚴(yán)重。且現(xiàn)有的檢測方法檢測病原單一，存在 著費時費力、不能同時鑒別小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒等Ξ種病毒的缺 點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本專利的目的在于運用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法進(jìn)行引物設(shè)計、序列比對 及反應(yīng)體系優(yōu)化，構(gòu)建小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒分子鑒別診斷方法，實 現(xiàn)小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒"一樣Ξ檢"的快速檢測效果。該方法為小 反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒診斷提供一種快速檢測方法，填補(bǔ)Ξ種病毒不 能同時診斷的空白，為牛羊疫病的診斷、調(diào)查、防控及凈化提供一定的技術(shù)支持與幫助。
[000引本發(fā)明專利要解決的技術(shù)問題通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明設(shè)及的檢測引物有3對，分別是PPRV引物對、SBV引物對及KBV引物對，其中 用于PPRV檢測的PPRV引物對包括PPRV-F和PPRV-R兩條引物，用于SBV檢測的SBV引物對包括 SBV-F和SBV-R兩條引物W及用于邸V檢測的邸V引物對包括邸V-F和邸V-R兩條引物。
[0010] 本發(fā)明的特征還設(shè)及到W下步驟。
[0011] 配置50化 PCR反應(yīng)體系：2XBuffer 2化L，Mix 1^，ΡΡΚν-Ρ、ΡΡΚν-Κ、5Βν-Ρ、5Βν- 1?、邸￥斗和?。?1?各〇.化1^，口口1?￥、58￥及?。つ０宸謩e化1，1?臟36-化60出〇1^^;
[0012] PCR 反應(yīng)程序：50 °C 反轉(zhuǎn)錄 30min; 95 °C 預(yù)變性 5min; 95 °C 變性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C延伸30s，共計35個循環(huán);72°C再延伸lOmin;
[0013] 結(jié)果觀察:取10化PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀 察結(jié)果。
[0014] 進(jìn)一步的，本發(fā)明建立的方法，其特征在于包括了本發(fā)明所述的引物。
[0015] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的引物用于檢測小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫 布病毒。
[0016] 所述的步驟用于檢測小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒的單一感染或 混合感染。
[0017] 本發(fā)明所述的應(yīng)用或者檢測方法不僅僅用于牛羊養(yǎng)殖場的臨床樣品檢測，還可W 應(yīng)用于城市動物園、野生動物園中的反當(dāng)動物樣品檢測。
[0018] 本發(fā)明公開了同時鑒別檢測小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒的分子 方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時省力等優(yōu)點。該方法為小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病 毒和庫布病毒的診斷提供一種快速檢測方法，填補(bǔ)Ξ種病毒不能同時診斷的空白，為牛羊 疫病的診斷、調(diào)查、防控及凈化提供一定的技術(shù)支持與幫助。
【附圖說明】
[0019] 圖1是多重PCR擴(kuò)增及特異性試驗結(jié)果結(jié)果;M:DNA Marker 2000;1:PPRV陽性質(zhì) 粒;2: SBV陽性質(zhì)粒；3: KBV陽性質(zhì)粒;4: PPRV+SBV陽性質(zhì)粒;5: PPRV+KBV陽性質(zhì)粒;6: KBV+ SBV陽性質(zhì)粒;7: PPRV+KBV+SBV陽性質(zhì)粒;8:犬?dāng)z熱病毒;9:新城疫病毒；10:羊痘病毒；11: 羊口瘡病毒;12: 口蹄疫病毒;13:牛副流感病毒;14:陰性對照
[0020] 圖2多重PCR敏感性結(jié)果;M:DNA Marker 2000;1-12:1〇-1-1〇-12質(zhì)粒倍比稀釋。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，其操作步驟會進(jìn)一步明確。
[0022] 優(yōu)化實施例：
[0023] 1材料和方法
[0024] 1.1PPRV、SBV和邸V陽性重組質(zhì)粒，犬?dāng)z熱病毒、新城疫病毒、羊痘病毒、羊口瘡病 毒、口蹄疫病毒、牛副流感病毒毒株由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所制備保存。
[00巧]1.2主要試劑
[00%] DNA/RNA提取試劑盒購自Axygen，一步法RT-PCR試劑及DNA Marker 2000購自 T曰k曰r曰公司。
[0027] 1.3引物設(shè)計
[002引分別根據(jù)最新文獻(xiàn)及GenBank中PPRV、SBV、邸V的序列，設(shè)計S對引物。引物由蘇州 金唯智生物科技有限公司合成。引物序列見表1。
[0029] 表1多重PCR引物序列
[0030]
[0031] 備注：S=G/C;R=A/G
[0032] 1.4RNA 的提取
[0033] 按照DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒DNA/RNA提取。
[0034] 1.5多重PCR擴(kuò)增及特異性試驗
[0035] W小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和(或)庫布病毒陽性重組質(zhì)粒混合物為多重 PCR的模板，建立多重PCR方法。采用50化PCR反應(yīng)體系：2XBuffer 2化L，PCR Mix化L， PPRV-F、PPRV-R、SBV-F、SBV-R、KBV-F和KBV-R各0.化L，PPRV、SBV及KBV 陽性模板分別：3yL， RNAse-free 出0 laA;
[0036] PCR 反應(yīng)程序:50°C 反轉(zhuǎn)錄 30min;95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 3〇3,55。(：退火3〇3,72 °C延伸30s，共計35個循環(huán);72°C再延伸lOmin;
[0037] 結(jié)果觀察:取10化PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀 察結(jié)果。
[003引 1.6多重PCR的敏感性試驗
[0039] 分別測定小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和(或)庫布病毒陽性重組質(zhì)粒的模板 濃度，然后進(jìn)行倍比稀釋，來測定該方法的敏感性。
[0040] 蛹果
[0041 ] 2.1多重PCR擴(kuò)增及特異性試驗
[0042] 采用優(yōu)化好的多重PCR對小反當(dāng)獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和(或)庫布病毒陽性 重組質(zhì)粒及混合液進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果獲得大小約為750bp，500bp及2(K)bp的片段，與測序結(jié)果 766bp、474bp及20化P的片段相吻合，結(jié)果如圖1所示。而犬?dāng)z熱病毒、新城疫病毒、羊痘病 毒、羊口瘡病毒、口蹄疫病毒、牛副流感病毒毒株等未呈現(xiàn)條帶，表明該方法具有較好的特 異性(如圖1所示）。
[0043] 2.3多重PCR的敏感性試驗
[0044] 經(jīng)檢測，優(yōu)化后的多重PCR的敏感性分別為9.268pg/ml (PPRV)、12.45pg/ml (SBV) 和 16.21pg/mKKBV)(如圖 2 所示）。
[0045] 2.4臨床樣品的檢測
[0046] 對采集的52份牛羊腹瀉糞便進(jìn)行檢測，其中PPRV核酸陽性2份、KBV核酸陽性10份， 未檢出SBV。此外，有1份PPRV和邸V混合感染。
【主權(quán)項】
1. 一種小反會獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒分子鑒別診斷方法，所述方法是 小反芻獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒一步法RT-PCR，其特征在于:所使用的引物組 合物包括PPRV引物對、SBV引物對及KBV引物對，其中PPRV引物對包括PPRV-F和PPRV-R兩條 弓丨物，SBV引物對包括SBV-F和SBV-R兩條引物以及KBV引物對包括KBV-F和KBV-R兩條引物。2. 如權(quán)利要求1所述的一種小反會獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒分子鑒別診 斷方法，所述的引物組合物具體為： PPRV-F：GGTACCATAGCATCACCGACTC SEQ ID N0.1 PPRV-R：CCCTTGCTCCTAAGTTTTTTGTAAT SEQ ID NO.2 SBV-F：GGCTTACACTCCCATTGATTTCT SEQ ID NO.3 SBV-R：ATTGACCGTCCATAACCTTTGAT SEQ ID NO.4 KBV-F：GGATTACAAGTGTTTTGATGCCA SEQ ID NO.5 KBV-R：TGATGGTGTTGATGATSGARGTR SEQ ID NO.6。3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種小反會獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒分子鑒別 診斷方法，所述RT-PCR包括以下步驟:配置50yL PCR反應(yīng)體系：2XBuffer 25yL，Mix lyL， PPRV-F、PPRV-R、SBV-F、SBV-R、KBV-F和KBV-R各0 · 5yL，PPRV、SBV及KBV 陽性模板分別 3yL， RNAse-free H2O 12uL； 其中，PPRV-F和PPRV-R用于小反芻獸疫的檢測，SBV-F和SBV-R用于施馬倫貝格病毒的 檢測，KBV-F和KBV-R用于庫布病毒的檢測； PCR反應(yīng)程序：50°C反轉(zhuǎn)錄30min;95°C預(yù)變性5min;95°C變性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延 伸30s，共計35個循環(huán);72 °C再延伸1 Omin; 結(jié)果觀察:取l〇yL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié) 果。4. 一種小反會獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒分子鑒別診斷方法中所使用的引 物組合物，其特征在于所述引物組合物包括：PPRV引物對、SBV引物對及KBV引物對，其中 PPRV引物對包括PPRV-F和PPRV-R兩條引物，SBV引物對包括SBV-F和SBV-R兩條引物以及KBV 弓丨物對包括KBV-F和KBV-R兩條引物。5. 如權(quán)利要求5所述的引物組合物，所述引物組合物具體為： PPRV-F：GGTACCATAGCATCACCGACTC SEQ ID NO.1 PPRV-R：CCCTTGCTCCTAAGTTTTTTGTAAT SEQ ID NO.2 SBV-F：GGCTTACACTCCCATTGATTTCT SEQ ID NO.3 SBV-R：ATTGACCGTCCATAACCTTTGAT SEQ ID NO.4 KBV-F：GGATTACAAGTGTTTTGATGCCA SEQ ID NO.5 KBV-R：TGATGGTGTTGATGATSGARGTR SEQ ID NO.6。
【專利摘要】本發(fā)明公開了同時鑒別檢測小反芻獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒的多重PCR方法。多重PCR方法引物包括PPRV引物對、SBV引物對及KBV引物對。該方法利用不同引物對擴(kuò)增出不同大小的病毒核酸片段來達(dá)到鑒別診斷的目的。本發(fā)明可同時檢測并區(qū)分小反芻獸疫病毒、施馬倫貝格病毒和庫布病毒，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時省力等優(yōu)點，可用于牛羊臨床樣品的檢測。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/93
【公開號】CN105671211
【申請?zhí)枴緾N201610212457
【發(fā)明人】翟少倫, 魏文康, 呂殿紅, 溫肖會, 賈春玲, 周秀蓉
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年4月7日