小反芻獸疫病毒n蛋白單克隆抗體、含有該抗體的試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗 體、含有該抗體的試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小反會獸疫（Peste des petits ruminants，PPR)又名小反會獸假性牛痕、肺腸 炎、口炎肺腸炎復(fù)合癥，是由小反會獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV) 引起的急性、烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE)將PPR列為必須上報的動物疫病，我國 農(nóng)業(yè)部將PPR列為一類動物疫病。PPR嚴(yán)重影響反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展及相關(guān)動物和 動物產(chǎn)品的國際貿(mào)易，對疫區(qū)造成巨大的經(jīng)濟損失。PPR具有患病率、死亡率高的特點，易 感動物主要是山羊和綿羊，野生的小反芻動物亦可感染發(fā)病致死亡。該病在臨床上的主要 特征是發(fā)熱、壞死性口炎、流涎、腹瀉和肺炎。自PPR首次于1942年在科特迪瓦爆發(fā)以來， 在撒哈拉以南和赤道以北的多數(shù)非洲國家、中東到土耳其的幾乎全部國家都有傳播。2007， 該病首次在我國西藏阿里地區(qū)爆發(fā)，隨后幾年內(nèi)，該病在西藏部分地區(qū)仍有發(fā)病，對西藏動 物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。2013年12月，小反芻獸疫在國內(nèi)新疆、西藏、內(nèi)蒙古、寧夏 等20多個省、自治區(qū)爆發(fā)，造成大量的反芻動物發(fā)病、死亡，并且對該病的控制帶了巨大的 挑戰(zhàn)。
[0003] 目前，檢測PPRV的方法主要為病毒分離、RT-PCR和熒光RT-PCR，這些方法操作繁 瑣、費時。RT-PCR和熒光RT-PCR方法雖然特異性和敏感性都很高，但需要專門的儀器設(shè)備 和技術(shù)人員，只能用于實驗室檢測。這些方法均不適用于現(xiàn)場檢測、快速檢測和基層獸醫(yī)部 門臨床檢測?，F(xiàn)有的針對動物病毒檢測方法包括熒光免疫層析檢測的方法，熒光免疫層析 技術(shù)，是免疫焚光技術(shù)（Immunofluorescence technique)和傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合發(fā)展 創(chuàng)新的一種定量新型檢測技術(shù)。免疫層析技術(shù)以固定有檢測線和控制線的條狀纖維層析材 料為固定相，測試液為流動相，通過毛細(xì)作用使待測物在層析條上移動，待測物在T線處發(fā) 生特異性免疫反應(yīng)。游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。該技術(shù)在保留膠體金免疫層析技術(shù)操 作簡便、檢測快速、便攜性強的優(yōu)點外，還通過熒光示蹤增強技術(shù)實現(xiàn)了檢測結(jié)果的精確定 量。
[0004] 由此可見，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員能否針對小反芻獸疫病毒建立PPRV熒光免疫層 析檢測試紙，可用于PPRV的快速檢測和現(xiàn)場檢測，有利于對感染PPRV流行病學(xué)的調(diào)查，從 而為PPR的預(yù)防和控制提供科學(xué)的依據(jù)，有利于動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，成為本領(lǐng)域技術(shù) 人員亟待解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供一種小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體、小 反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條及其制備方法。用熒光微球標(biāo)記的小反芻獸疫病毒 特異性單克隆抗體、多克隆抗體、硝酸纖維素膜等為主要材料，建立小反芻獸疫病毒熒光免 疫層析試紙檢測試紙條，可以用于PPRV的快速檢測和現(xiàn)場檢測，解決目前國內(nèi)缺乏PPRV快 速檢測和現(xiàn)場檢測方法和檢測工具的現(xiàn)狀。
[0006] 為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明的技術(shù)方案包括：
[0007] -種小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體，所述的小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗 體，由小反芻獸疫病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株117-6H6產(chǎn)生，小反芻獸疫病毒單克隆抗 體雜交瘤細(xì)胞株117-6H6保藏編號為CCTCC NO. C2014233,于2014年12月3日保藏在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，其存活性于2014年12月10檢測完畢，結(jié)果為存活。
[0008] -種上述小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：用純化 的小反芻獸疫病毒免疫小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，分別 用純化的小反芻獸疫病毒抗原、基因工程表達(dá)的小反芻獸疫病毒N蛋白和BHK細(xì)胞建立 間接ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，3種ELISA方法分別命名為：PPRV-ELISA、PPRV N-ELISA 和BHK-ELISA，篩選PPRV-ELISA和PPRV N-ELISA檢測為陽性，且BHK-ELISA檢測為陰性 的細(xì)胞孔，確定為可以分泌小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的陽性克隆，建立可穩(wěn)定分 泌小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為：117-6H6,并將該細(xì)胞株 送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏時間為2014年12月3日，編號為：CCTCC NO.C2014233。
[0009] -種小反會獸疫病毒焚光免疫層析檢測試紙條，包括背襯、樣品墊、焚光微球標(biāo)記 的小反芻獸疫病毒單克隆抗體復(fù)合物墊、已點樣檢測線和對照線的硝酸纖維膜、吸水墊， 所述檢測線包被有羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體，所述對照線包被有葡萄球菌A蛋白， 所述的小反芻獸疫病毒單克隆抗體為小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體，由小反芻獸疫 病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株117-6H6產(chǎn)生，所述小反芻獸疫病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì) 胞株117-6H6于2014年12月3日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.C2014233。
[0010] 所述的羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體濃度為I. 5mg/mL，所述的葡萄球菌A蛋白 濃度為lmg/mL。
[0011] 所述的羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體包被量為〇. 3375 μ g/條，所述的葡萄球 菌A蛋白包被量為0. 225 μ g/條。
[0012] -種小反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 步驟一：小反會獸疫N蛋白單克隆抗體的制備：用純化的小反會獸疫病毒免疫8 周齡BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，分別用純化的小 反芻獸疫病毒抗原、基因工程表達(dá)的小反芻獸疫病毒N蛋白和BHK細(xì)胞建立間接ELISA檢 測細(xì)胞培養(yǎng)上清，3種ELISA方法分別命名為：PPRV-ELISA、PPRV N-ELISA和BHK-ELISA，篩 選PPRV-ELISA和PPRV N-ELISA檢測為陽性，且BHK-ELISA檢測為陰性的細(xì)胞孔，確定為可 以分泌小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的陽性克隆，建立可穩(wěn)定分泌小反芻獸疫病毒N 蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為：117-6H6,并將該細(xì)胞株送至中國典型培養(yǎng)物保 藏中心進(jìn)行保藏，保藏時間為2014年12月3日，編號為：CCTCC NO. C2014233 ;
[0014] 步驟二：熒光微球標(biāo)記小反芻獸疫病毒單克隆抗體的制備：采用EDC介導(dǎo)法將步 驟一所制備的小反芻獸疫病毒單克隆抗體和熒光微球進(jìn)行偶聯(lián)；
[0015] 步驟三：羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體的制備：用純化的小反芻獸疫病毒免疫 綿羊，經(jīng)耳靜脈采血并分離血清，用PPRV-ELISA檢測抗體效價，若效價達(dá)到1 : 5000以上， 通過頸動脈放血，分離血清，滅活后用A/G抗體純化柱對多克隆抗體進(jìn)行純化，用PBS稀釋 至 L 5mg/mL ;
[0016] 步驟四：檢測線和對照線的制備：首先將硝酸纖維素膜粘貼于背襯表面，再將步 驟三制備的濃度為I. 5mg/mL的羊抗小反會獸疫病毒多克隆抗體和濃度為lmg/mL的葡萄球 菌A蛋白分別點在硝酸纖維膜上，作為檢測線和對照線試劑；
[0017] 步驟五：試紙條的組裝和切割：將背襯和已點樣檢測線和對照線的硝酸纖維膜、 熒光微球標(biāo)記的小反芻獸疫病毒單克隆抗體復(fù)合物墊、樣品墊、吸水墊粘在一起，并于 CM4000切條機中，將其切成3mm寬的試紙條，干燥保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 所述步驟二的偶聯(lián)方式，具體操作為：向5mL pH 5. 0的0. 02mol/L PBS溶液