中依 次加入2. 5mg焚光微球，16 μ L現(xiàn)配的濃度為10mg/mL的EDC溶液，再加入濃度為lmg/mL PPRV單克隆抗體250 μ L，室溫下緩慢攪拌2h，用終濃度為2 %的BSA封閉30min后，80000r/ min、4°C離心10min，移出上清液，加入500 μ LPBS重懸沉淀物，充分混勻，將熒光微球標記 抗體復合物于4°C保存?zhèn)溆?，用ΧΥ?050點樣平臺將熒光微球標記的單克隆抗體復合物溶 液噴于300mmX 5mm玻璃纖維棉上，速度為50 μ L/cm，并于4°C真空抽干。
[0019] 所述焚光微球粒徑為175nm，激發(fā)波長為470nm，發(fā)射波長為525nm。
[0020] 所述步驟三羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體的制備：用純化的小反芻獸疫病毒免 疫3月齡健康綿羊，免疫劑量為3mg/只，間隔2周免疫1次，共免疫4次，最后一次免疫后 15天，經(jīng)耳靜脈采血并分離血清，檢測抗體效價后，通過頸動脈放血，分離血清，于56°C滅 活30min，用A/G抗體純化柱對多克隆抗體進行純化，用DU-800核酸/分析蛋白分析儀測定 IgG 蛋白含量為 I. 985mg/mL，用濃度為 0· 02mol/L、pH7. 2 的 PBS 稀釋至 I. 5mg/mL。
[0021] -種小反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條的用途，所述的小反芻獸疫病毒熒 光免疫層析檢測試紙條可用于檢測小反芻獸疫病毒。
[0022] 本發(fā)明的有益效果包括：本發(fā)明所制備的PPRV N蛋白特異性單克隆抗體，具有與 PPRV特異性結合的活性，并與其他相關病毒無交叉反應，表明該單克隆抗體可以用于PPRV 免疫學檢測方法?；跓晒馕⑶驑擞浀膯慰寺】贵w和SPA作為主要材料，建立PPRV免疫 層析檢測試紙條具有良好的特異性和敏感性，與RT-PCR檢測方法相比，兩種方法檢測結果 符合率為98. 91%。該試紙條具有檢測快速、操作簡便、不需要專門的儀器設備和專業(yè)技術 人員。另外，該試紙條易于保存和運輸，使用檢測樣品量小，檢測成本較低，操作安全，不造 成環(huán)境污染。因此該方法特別適用于PPRV的快速檢測、基層獸醫(yī)診斷部門臨床檢測和養(yǎng)殖 企業(yè)自行檢測等。該試紙條的研制，為PPRV的檢測、PPR檢疫和流行病學調查提供良好的 工具。
【附圖說明】
[0023] 圖1所示為本發(fā)明一種小反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條結構示意圖。
[0024] 1-背襯、2-樣品墊、3-熒光微球標記的小反芻獸疫病毒單克隆抗體復合物墊、 4_硝酸纖維膜、41-檢測線、42-對照線、5-吸水墊。
【具體實施方式】
[0025] 下文將結合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應當注意的是，下述實施例中 描述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達 到更好的技術效果。
[0026] 實施例1
[0027] -種小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體，所述的小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗 體，由小反芻獸疫病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株117-6H6產(chǎn)生，小反芻獸疫病毒單克隆抗 體雜交瘤細胞株117-6H6保藏編號為CCTCC NO. C2014233。于2014年12月3日保藏在中 國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0028] -種小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：用純化的 小反芻獸疫病毒免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，分別用 純化的小反芻獸疫病毒抗原、基因工程表達的小反芻獸疫病毒N蛋白和BHK細胞建立間 接ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清，3種ELISA方法分別命名為：PPRV-ELISA、PPRV N-ELISA和 BHK-ELISA，篩選PPRV-ELISA和PPRV N-ELISA檢測為陽性，且BHK-ELISA檢測為陰性的 細胞孔，確定為可以分泌小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的陽性克隆，建立可穩(wěn)定分 泌小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為：117-6H6,并將該細胞株 送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，保藏時間為2014年12月3日，編號為：CCTCC NO.C2014233。
[0029] 如圖1所示一種小反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條結構示意圖，包括背襯 1、樣品墊2、熒光微球標記的小反芻獸疫病毒單克隆抗體復合物墊3、已點樣檢測線41和對 照線42的硝酸纖維膜4、吸水墊5,所述檢測線41包被有羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體， 所述對照線42包被有葡萄球菌A蛋白，所述的小反芻獸疫病毒單克隆抗體為小反芻獸疫病 毒N蛋白單克隆抗體，由小反芻獸疫病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株117-6H6產(chǎn)生，小反芻獸 疫病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株117-6H6保藏編號為CCTCC NO. C2014233,于2014年12月 3日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0030] 所述的羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體濃度為I. 5mg/mL，所述的葡萄球菌A蛋白 濃度為lmg/mL。所述的羊抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體包被量為0. 3375 μ g/條，所述的葡 萄球菌A蛋白包被量為0. 225 μ g/條。
[0031] -種小反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條的用途，所述的小反芻獸疫病毒熒 光免疫層析檢測試紙條可用于檢測小反芻獸疫病毒。
[0032] -種小反芻獸疫病毒熒光免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0033] 步驟一：小反芻獸疫病毒單克隆抗體的制備：
[0034] (1)免疫原的制備：BHK-21細胞長成單層后接種PPRV，37°C反應lh。加入無血清 的基礎培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，4~5d后細胞病變（CPE)達75%以上時，收獲病毒。將收獲的病 毒液反復凍融3次，以8000r/min離心30min，取上清液。以28000r/min 4°C超速離心3h。 沉淀用1/100原體積的PBS溶解，然后采用35%、50% (w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度26000r/ min 4°C超速離心3h，收獲提純的病毒條帶作為免疫抗原，經(jīng)DU800核酸蛋白分析儀測定， 純化的PPRV蛋白濃度為2. 793mg/mL，用0. 02mol/L PBS(pH7. 2)將純化的PPRV抗原稀釋至 2mg/mL，-70°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0035] (2)動物免疫：用提純的PPRV免疫8周齡BALB/c小鼠。首免時加等體積弗氏完 全佐劑乳化，二免和三免時加等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免后第15d，斷尾采血分離血 清，用純化的PPRV抗原建立的間接ELISA檢測抗PPRV血清抗體效價。于融合前3d，通過尾 靜脈注射BTV強化免疫一次，劑量為100 μ g。
[0036] (3)細胞融合：于超凈工作臺內取免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按I : 10 在50% PEG-1500作用下進行融合，用含有HAT和10%胎牛血清的頂DM選擇性培養(yǎng)基重懸 細胞后分裝到含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞板中，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0037] (4)間接ELISA篩選及陽性雜交瘤細胞株的建立：融合后的細胞培養(yǎng)約7d后，分 別用純化的PPRV抗原、基因工程表達的小反芻獸疫病毒N蛋白和BHK細胞建立間接ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清。3種ELISA方法分別命名為：PPRV-ELISA、PPRV N-ELISA和BHK-ELISA， 篩選PPRV-ELISA和PPRV N-ELISA檢測為陽性，且BHK-ELISA檢測為陰性的細胞孔，確定為 可以分泌小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的陽性克隆。經(jīng)三種ELISA方法篩選，獲得1 株陽性雜交瘤細胞，原始編號6H6。
[0038] (5)單克隆抗體的特異性和ELISA效價：采用間接ELISA對單克隆抗體特異性進 行檢測。用藍舌病病毒（BTV)、0型口蹄疫病毒（FMDV-O)、鹿流行性