一種檢測牛冠狀病毒的引物、探針、試劑盒及方法
【技術(shù)領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領域，更具體地，本發(fā)明設及一種檢測牛冠狀病毒的 引物、探針、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛冠狀病毒(bovine coronaviruSiBCV)是引起成年牛冬頻和新生轄牛腹瀉(腹瀉 糞便中常帶有血液和粘液）的最主要的病原之一，BCV的感染在全世界各國廣泛分布。美國 科學家Mebus等人（Mebus C A,Stair E L,Rhodes Μ B,et al.Pathology of neonatal calf diarrhea induced by a coronavirus-like agent[J].Vet Pathol,1973,10:45- 64.)在發(fā)病的轄牛和成年牛的糞便病料中檢出了 BCV病毒，隨后世界其他國家也報道了該 病的發(fā)生。我國學者宋廣林等人(宋廣林，董惠蘭，滕慶，等.轄牛流行性腹瀉病原研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，1985，16:121-122.)于1985年首次報道了BCV在中國的存在，隨后我國各地 均有報道(傅彩霞，斬興軍，鄭瑞峰，等.北京地區(qū)規(guī)模化奶牛場Ξ種病毒性腹瀉病的血清學 調(diào)查[J].動物醫(yī)學進展，2012.33(5) :85-88)。
[0003] BCV在我國已有多次暴發(fā)，對新生轄牛造成較高的死亡率?？焖僭\斷此病是有效降 低損失的重要手段。
[0004] 目前，常用的牛冠狀病毒檢測方法有：（〇Elisa抗體檢測方法:它的原理是牛感染 牛冠狀病毒后產(chǎn)生抗體，通過抗體的檢測確定是否感染牛冠狀病毒；（2)病毒的分離純化方 法:通過對病毒的細胞培養(yǎng)純化，確定是否感染牛冠狀病毒。
[0005] 現(xiàn)有方法存在W下缺點：（〇Elisa抗體檢測方法:該法的前提是牛感染牛冠狀病 毒并產(chǎn)生抗體，由于從感染病毒到產(chǎn)生抗體需要一定的時間，運對病毒的檢測在時間上有 一定的局限性，不能及時準確的檢測到牛冠狀病毒；另外，免疫過牛冠狀病毒疫苗，或者之 前感染過牛冠狀病毒的牛，后續(xù)抗體會在一定時間內(nèi)持續(xù)存在，即使當牛體內(nèi)沒有病毒時 也會檢測到抗體，抗體檢測結(jié)果陽性也無法說明牛體內(nèi)是否存在牛冠狀病毒。（2)病毒的分 離純化方法:該法為經(jīng)典的病原學診斷方法，但操作起來費時費力，牛冠狀病毒的分離培養(yǎng) 一般較為困難，尤其是初次的分離培養(yǎng)。因此，病毒分離純化法也不能很好的滿足現(xiàn)代化養(yǎng) 殖快速有效的病原學檢測需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明在牛冠狀病毒N基因處設計定量 PCR引物，并采用探針法建立巧光定量PCR方法，提供了一種檢測牛冠狀病毒的引物、探針、 試劑盒及方法。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了 W下技術(shù)方案：
[000引一種檢測牛冠狀病毒的引物，所述引物如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。
[0009] 上述檢測牛冠狀病毒的引物在制備檢測牛冠狀病毒的試劑盒中的應用。
[0010] 一種檢測牛冠狀病毒的探針，所述探針如SEQ ID N0:3所示。
[0011] 在其中一些實施例中，所述探針的3'端結(jié)合有巧光澤滅基團TAMRA，5'端結(jié)合有巧 光報告基團FAM。
[0012] -種檢測牛冠狀病毒的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物和探針。
[0013] -種檢測牛冠狀病毒的方法，采用上述的引物和探針，包括W下步驟：
[0014] W待測樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進行巧光定量PCR擴增，比較擴增 曲線CT值；
[0015] 其中，所述巧光定量PCR的擴增體系為:q-pcr Mix酶10化，引物SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2各0.化L，沈Q ID N0:3探針0.化L，分子生物學用水7.46化，3〇義參比染料0.04化， cDNA模板化1^;
[0016] 所述巧光定量PCR的擴增反應程序為:50 °C 2min; 95 °C 2min，95 °C 3s，60 °C 30s，40個 循環(huán)。
[0017] 在其中一些實施例中，所述反轉(zhuǎn)錄包括如下步驟：
[001引 （1)、將RNA加入到預混液1中，混合均勻后，65°C保溫5min后迅速冰上急冷3min，所 述預混液 1 的配方為：50μΜ的Random Primer ljiL，10mM each的dNTP Mix1:ure 化L [0019] (2)、將上述反應液加入到RT預混液2中反應如下：30°C10min、42°C60min、7(rC 15min，即得cDNA，所述預混液2的配方為：5 X PrimeScript Buffer 4yL，40U/化的RNase Inhibitor 0.5μΙ，20〇υ/μΙ的PrimeScript Reverse Transcriptase lyL，RNase free 出0 4.?5μΙ。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下顯著效果：
[0021] 本發(fā)明的檢測牛冠狀病毒的引物和探針具有很高的特異性和靈敏度，巧光定量 PCR法相對于現(xiàn)有的牛冠狀病毒病原檢測方法，操作簡單實用，特異性強、敏感度高，重復性 好，適應現(xiàn)代化養(yǎng)殖場快速準確的檢測需要。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明試驗例1中巧光定量PCR的引物特異性實驗擴增結(jié)果；
[002；3]圖2為本發(fā)明試驗例帥普通PCR的擴增圖，Μ為Maker, 1為陽性樣品，2為陰性對照， 目的片段730bp;
[0024] 圖3為本發(fā)明試驗例3中巧光定量PCR的敏感性實驗擴增結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025] W下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0026] W下實施例中設及的實驗材料如無特殊說明，均來源于市售，W下實施例中所采 用的操作均為本領域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)操作。
[0027] 實施例1檢測牛冠狀病毒的引物、探針和方法
[002引 1、引物和探針設計
[0029] 目的片段擴增：根據(jù)GenBank所公布的牛冠狀病毒N基因序列（GBI抓401981.11)， 設計出定量PCR擴增引物，并于所設計的擴增引物中間設計探針引物，定量PCR引物和探針 由上海基康生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：
[0030] 上游引物：TCCTTAAGTGGGCCGATCAG(SEQ ID N0:1)
[0031] 下游引物:GAGCTCTTCTACCCCTGGTTTG(SEQ ID N0:2)
[0032] 探針：5'FAM-CCGACCAATCTAGAAAT-3'TAMRA(SEQ ID N0:3)
[0033] 所述探針P的3'端結(jié)合的是巧光澤滅基團TAMRA，探針P的5'端結(jié)合的是巧光報告 基團FAM。
[0034] 2、檢測方法
[0035] 包括W下步驟：
[0036] (1)、樣品RNA的提取
[0037] 陽性對照組(牛冠狀病毒陽性糞便）：取Ig牛冠狀病毒陽性糞便(經(jīng)普通PCR檢測并 測序確定為牛冠狀病毒），添加50化L生理鹽水，縱滿震蕩20s，1000化/min離屯、3min，取20化 L上清液作為陽性對照液。
[0038] 待檢樣品組(疑似感染冠狀病毒糞便）：取Ig疑似感染冠狀病毒糞便，加入50化L生 理鹽水，置于旋滿震蕩儀震蕩20s，然后100(K)r/min離屯、3min，取20化L上清液作為待檢液。
[0039] 陰性對照組(稀釋糞便用生理鹽水）：取20化L的生理鹽水作為陰性對照液。
[0040] 采用RNA試劑盒(AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒），按照說明步驟提取W上各組 樣品的RNA。
[0041] (2)、反轉(zhuǎn)錄
[0042] 采用化KaRa反轉(zhuǎn)錄酶體系（寶生物工程有限公司），按照說明步驟分