一種用于非水相環(huán)境催化的磷酯酶印跡激活方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工催化劑活化領域，特別設及一種用于非水相環(huán)境催化的憐醋 酶印跡激活方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 憐脂酶(Phospholipase,EC 3.1.1.4;EC 3.1.1.3;EC 3.1.4.4;EC 3.1.1.5)是一 大類具有重要價值的水解酶，具有催化憐脂類化合物的合成、水解、轉(zhuǎn)醋、醋交換等多種反 應的能力，是化工生產(chǎn)，醫(yī)藥合成及食品加工中最重要的酶之一。常見憐脂酶主要包括憐脂 酶A1，憐脂酶A2,憐脂酶C，憐脂酶D等幾類。例如憐脂酶A1和憐脂酶A2,能在油水界面上催化 憐脂及甘油Ξ醋α位和β位的醋水解、醇解、醋合成、醋交換等反應，在食品、化工，特別是油 脂精煉等多個領域被廣泛應用。憐脂酶C催化甘油與憐酸基團之間憐酸醋鍵等合成與斷裂， 主要用于油脂精煉行業(yè)。憐脂酶D催化憐脂中憐酸基團與堿基之間等水解、合成、轉(zhuǎn)醋等，在 醫(yī)藥化工行業(yè)中具有重要地位。
[0003] 對絕大部分常規(guī)酶來說，催化反應是在水溶液環(huán)境中進行的，有機溶劑能明顯降 低酶的催化能力，甚至使酶失活，但不少具有重要價值的產(chǎn)品的合成和一些重要的反應需 要在非水相環(huán)境中尤其是有機溶劑中進行，如毛油及混合油的酶法精煉。因此，提高酶在非 水相催化過程中的性能就成為了研究的熱點。非水相酶催化概念由Zaks和Κ1化anov在1984 年提出，他們發(fā)現(xiàn)某些脂肪酶在有機溶劑環(huán)境下仍具有一定的催化活力，并W此為基礎合 成了一系列有機化合物。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，非水相酶催化技術(shù)得到一定的發(fā)展，溶劑系統(tǒng) 不再局限在單一有機溶劑，所使用酶的種類也得到了進一步拓展。相較于非生物催化化工 及水相生物催化，非水相酶催化具有一定優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在增加底物有效濃度;反應平衡向 合成方向移動;微生物污染少;酶熱穩(wěn)定性提高;酶重復使用性提高;下游過程能耗降低;減 少副反應;提高酶特異性和選擇性等方面。然而，非水相中酶活性不高始終是制約該技術(shù)發(fā) 展進入工業(yè)應用的最大因素。隨著相關(guān)研究的不斷推進，深入探討酶在有機相中活力降低 的原因，發(fā)現(xiàn)運些原因是可W解決的，通過合理的、系統(tǒng)的策略設計，及酶激活改性，可多數(shù) 量級的提高酶在有機相中的活力，并最終達到酶在水相中的活力水平。
[0004] 憐脂是毛油中的主要雜質(zhì)之一，W溶質(zhì)狀態(tài)均勻分散在毛油或混合油中。憐脂在 高溫條件下，容易發(fā)生化學反應生成深色色素及異味化合物，更高溫度下脫水焦化，嚴重影 響食用油品質(zhì)。憐脂含量較高的食用油在后期儲藏過程中，極易氧化酸敗，品質(zhì)劣變。因此， 去除毛油中的憐脂是油脂精煉過程中重要的一環(huán)，該過程也叫毛油脫膠。工業(yè)上常用的水 化脫膠，利用憐脂分子的兩親性質(zhì)，往毛油中加入一定量的水，卵憐脂等親水性較強的憐脂 吸水膨脹，聚團形成膠狀沉淀從毛油中分離出來。但非水化憐脂，特別是憐脂酸巧儀鹽，不 能W運種形式從毛油中分離。酶法脫膠可W利用憐脂酶的催化活力，將非水化憐脂轉(zhuǎn)化為 親水性更強的溶血憐脂進而水化分離，或者切除憐酸基團，將其轉(zhuǎn)化為二酷甘油，W達到脫 除憐脂的目的。由于毛油脫膠體系與常規(guī)水相反應體系差異較大，特別是在混合油體系中， 正己燒或輕質(zhì)溶劑油對酶活力有強烈抑制作用，很多憐脂酶不能像在水溶液中一樣表現(xiàn)較 高的活力，提高憐醋酶在非水相條件下的活力意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提出一種適用于非水相環(huán)境催化的憐醋酶印跡激活方法。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種用于非水相環(huán)境催化的憐醋酶印跡激活 方法，包括W下步驟：
[0007] (1)憐脂酶印跡激活:將憐脂酶溶解于含印跡因子的緩沖液中進行激活，印跡因子 為憐脂或其衍生物；
[0008] (2)印跡憐脂酶固定化:加入娃藻±，充分震蕩混勻、靜置，完成固定化吸附；
[0009] (3)凍干:將完成固定化及抗凍保護的印跡憐脂酶進行預凍，再進行真空冷凍干燥 呈粉末，即為固定化印跡憐脂酶粉；
[0010] (4)洗涂：固定化印跡憐脂酶粉中加入洗涂液，充分滿旋振蕩分散，靜置后濾去溶 劑，重復洗涂，洗去印跡因子；
[0011] (5)脫溶:將洗涂好的酶粉進行真空干燥，除去殘留的有機溶劑，得成品酶粉。
[001^ 優(yōu)選地，步驟(1)中緩沖液濃度為10~500mM0l/L，激活條件為4~4(TC、2~30min。 [OOU]優(yōu)選地，步驟(1)中所述的印跡因子與緩沖液的體積比化：10~250。
[0014]優(yōu)選地，步驟(1)中所述的緩沖液為巧樣酸或憐酸或Tris-HCl;所述憐脂酶為憐脂 酶A1、憐脂酶A2、憐脂酶C、憐脂酶D中的一種;所述憐脂或其衍生物為憐脂酸、憐脂巧鹽、憐 脂儀鹽的一種。其中巧樣酸及憐酸是現(xiàn)有油脂精煉工業(yè)中最常用的酸化劑，Tris-HCl是生 化反應常用抑緩沖系統(tǒng)，酸-鹽緩沖范圍與本發(fā)明設及酶最適抑范圍相符，且不會干擾成品 酶劑的使用。
[001引優(yōu)選地，步驟(2)中靜置的溫度為4~40°C、時間為2~30min。
[0016] 優(yōu)選地，步驟(2)中的娃藻±是按照上一步驟體系體積的10~100%(w/v)加入。
[0017] 優(yōu)選地，步驟(3)中預凍的溫度為-20~-80°C，真空冷凍干燥的條件為溫度為-60 ~-80°C、真空度1~500Pa。當溫度高于-20°C時，含印跡因子、酶蛋白及緩沖鹽的印跡體系 難W充分凍結(jié)，在真空干燥過程中會造成大量氣泡鼓出，成品得率降低等不良后果。
[0018] 優(yōu)選地，步驟(4)中，按照固定化印跡憐脂酶粉2~10倍體積加入洗涂液，滿旋振蕩 分散的溫度為4~40°C，靜置時間為2~30min，重復洗涂次數(shù)為3~4次。本發(fā)明使用的印跡 激活劑在油脂精煉過程中為難脫除雜質(zhì)，該激活劑易溶解于非極性有機溶劑，考慮到后續(xù) 脫溶條件及有機溶劑對酶蛋白的變性影響，優(yōu)選洗涂液為正己燒、石油酸，乙酸中的一種。 洗涂條件低于該提出范圍，印跡因子殘留對后續(xù)使用的不良影響不能被忽略。
[0019] 優(yōu)選地，在步驟(1)、（2)之間還進行抗凍保護，在激活的印跡憐脂酶中加入抗凍保 護劑，混合均勻、靜置后，完成抗凍保護。
[0020] 優(yōu)選地，所述的抗凍保護劑為甘油或甘露糖;抗凍保護劑濃度為0~500mMol/L，靜 置的溫度為4~40°C、時間為2~30min。甘油及甘露糖是生化常用抗凍保護劑，且具有無毒， 水溶，對后續(xù)步驟及成品使用無不良影響的特點。在該范圍內(nèi)，抗凍保護劑能有效保護酶活 性不在預凍及冷凍真空干燥環(huán)節(jié)中降低，更高濃度的抗凍保護劑條件下，洗涂印跡因子環(huán) 節(jié)難度加大，且成品酶劑不易保持粉末性狀，影響后續(xù)保存使用。
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0022] 本發(fā)明利用憐脂酶蛋白分子構(gòu)象在水相中的柔性，采用冷凍干燥的方法將憐脂酶 蛋白構(gòu)象進行誘導固化，使之保持適合與底物結(jié)合的狀態(tài)，利于催化反應進行。由于在非水 介質(zhì)中憐脂酶蛋白構(gòu)象相對剛性，該方法所提供的憐脂酶高催化活性構(gòu)象更容易得到保 持。在生物印跡過程的基礎上，通過將印跡憐脂酶分子與固定化載體結(jié)合，可W提高憐脂酶 在有機溶劑中的分散性，進一步提高憐脂酶催化能力，同時為憐脂酶的重復使用提供回收 基礎。
[0023] 另外，本發(fā)明工藝簡單，激活效果明顯，生產(chǎn)成本低，具有廣闊的工業(yè)應用前景和 經(jīng)濟價值。經(jīng)印跡激活固定化后，憐脂酶在非水相介質(zhì)中活力可提高1~2個數(shù)量級，底物特 異性也有明顯增強，在工業(yè)生產(chǎn)，特別是油脂精煉加工中有良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[00巧]量取50g憐脂酶AULecitase叫tra，12000IU/g)，溶解于300mL含5%憐脂酸巧鹽 的pH 4.5，濃度為2〇1111〇1幾的巧樣酸緩沖液乳液中，20°(：條件下，靜置1〇111111。加入8邑 (148mMol/L)甘露糖，充分溶解混勻后，20°C條件下，靜置lOmin。加入150g(50%，w/v)娃藻 上，充分滿旋振蕩，混合均勻，20°C靜置lOmin?；旌衔镉?20°C下預凍至完全凍結(jié)，經(jīng)-80°C， 1化低溫凍干成為固定化印跡憐脂酶A1。加入900mL正己燒，充分振蕩混勻，20°C下靜置 lOmin，過濾除去溶劑，重復Ξ次。將洗去印跡因子的固定化印跡憐脂酶真空干燥除去有機 溶劑，4°C下密封保存。經(jīng)測定，在含水4%的正己燒環(huán)境下，W憐脂酸巧為底物催化水解反 應，印跡激活憐脂酶A1活力比未激活憐脂酶提高79倍，使用油酸甘油Ξ醋作為競爭性底物 測定，酶底物特異性提高213倍。