黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單 體化合物的提取方法，以及該大豆素單體化合物在制備抗肝癌藥物和抗肺癌藥物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃綠蜜環(huán)菌（Armillarialuteo-rivens)，又名黃蘑燕、金蘑燕、黃環(huán)菌，隸屬于擔 子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、蜜環(huán)菌屬。黃綠蜜環(huán)菌子實體中等大，菌蓋扁半球形至 平展，直徑5-12cm，菌蓋邊緣內(nèi)卷，表皮開裂形成近環(huán)狀排列的纖毛狀后磷片。菌褶近似菌 蓋色，稍密，彎生，不等長。菌柄柱形，莖部膨大，長2-lOcm，直徑2-2. 5cm，白色或或帶黃色， 內(nèi)實。菌環(huán)中位，單層，菌環(huán)以上為白色，菌環(huán)以下為黃色鱗片。在顯微鏡下觀察，擔孢子橢 圓形，無色至微黃色，淀粉質(zhì)，擔孢子棒狀，無色，具4個孢子，菌絲具明顯鎖狀聯(lián)合。菌絲分 布在土壤5-lOcm。該菌夏秋季生于針葉林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌絲可與主 要植被為嵩草和高山雜類草等形成菌根。在牧草生長季節(jié)，由黃綠蜜環(huán)菌菌絲頂端生長，在 草地上形成或大或小的圓圈、半圓或條帶狀的蘑菇圈。圈的寬度大約為50cm，圈的直徑大約 6cm左右（周連玉.黃綠蜜環(huán)菌的研究概述.安徽農(nóng)學(xué)通報[J]. 2010, 16 (3): 52-54)。
[0003] 國內(nèi)對黃綠蜜環(huán)菌營養(yǎng)成分進行了初步分析，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖多 肽等營養(yǎng)和藥用成分，具有較高的保健和藥用價值。但目前的蜜環(huán)菌制劑主要以初 提混合物為原料，如郭順星等在"蜜環(huán)菌的化學(xué)成分及應(yīng)用研究"（微生物學(xué)通報 [J]· 1996,23(4):239-240)中提出：蜜環(huán)菌糖漿以蜜環(huán)菌培養(yǎng)液（菌絲連同發(fā)酵液）為主 要原料，煮沸濃縮制成，主治眩暈頭痛，神經(jīng)衰弱，失眠，美尼爾綜合癥；蜜環(huán)菌浸膏以菌絲 體為原料，煮沸、過濾，殘渣醇析，醇析物與濾液合并濃縮制成，用于治療血管性頭痛、神經(jīng) 衰弱、冠心病、腦動脈血管硬化等??；蜜環(huán)菌片以菌絲體烤干后磨成細粉壓片而成，對高膽 固醇血癥、高甘油三酯血癥、降低血壓有一定效果。由于蜜環(huán)菌制劑成分一般為混合物，缺 乏必要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效研究，所以其缺乏合理的質(zhì)量控制標準，難以確保臨床用藥 的有效性、安全性、可持續(xù)性?？梢?，對黃綠蜜環(huán)菌的化學(xué)成分進行進一步提取和研究非常 有必要。
[0004] 袁興利等在"蜜環(huán)菌的化學(xué)成分研究"（中國中藥雜志 [J]. 2013, 38(16) :2671-2674)提出以蜜環(huán)菌發(fā)酵培養(yǎng)物（包含菌絲體和發(fā)酵液）為原料 進行有效成分提?。翰捎?5%乙醇浸提后，用閃式提取器提取，合并提取液并濃縮；經(jīng)兩次 硅膠柱色譜和一次Sephadex LH-20色譜柱，并使用不同的洗脫劑進行分離純化后，得到大 豆素（化學(xué)名5, 7-二羥基-3-(4-羥苯基）-4H-1-苯并吡喃-4-酮、4'，5, 7-三羥基異黃 酮）單體化合物。但是使用該方法步驟繁瑣，成本高，得到的大豆素含量極少，得率比較低， 3. 5kg干燥的蜜環(huán)菌發(fā)酵培養(yǎng)物只得到10mg大豆素，這大大限制了大豆素的進一步研究和 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黃綠蜜環(huán)菌中 大豆素單體化合物的提取方法，該方法采用二維高效液相色譜進行分離純化，得到具有生 物活性的大豆素單體化合物，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡單省時，成本低， 大?素提取率尚。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)以黃綠蜜環(huán)菌子實體為原料，經(jīng)干燥并磨成粉末狀后，用乙酸乙酯以液固比 (5-10)mL : lg進行浸泡24-48h，然后過濾取上清，得到乙酸乙酯提取液，并濃縮至膏狀；
[0009] (2)使用乙醇體積分數(shù)為10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解步驟（1)得 到的膏狀乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上樣溶液；
[0010] (3)對上樣溶液進行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜 柱，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為50-150mL/ 針，流動相流速為550-600mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260nm ;采用的洗脫 方式為B相濃度由0%至75% (即按體積百分比B相75%、A相25%混合而成的液體，下 同理）進行梯度洗脫45-75min，根據(jù)紫外吸收光譜收集23-26分鐘洗脫液作為目的組分，減 壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分；
[0011] (4)用乙醇體積分數(shù)為2-15 %的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分， 溶解至濃度為50-100mg/mL ;
[0012] (5)進行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流 動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為500-2000 μ L/針，流動 相流速為10_30mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260nm，采用的洗脫方式為Β相 濃度4%進行等度洗脫20-30min，根據(jù)紫外吸收光譜收集13-18分鐘洗脫液作為目的組分， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到大豆素單體化合物。
[0013] 所述步驟（3)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、柱長250mm，其中 硅球粒徑為10-50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。
[0014] 所述步驟（5)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑20mm、柱長250mm，其中 硅球粒徑為10-50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。
[0015] 本發(fā)明還進一步提供上述提取得到的大豆素單體化合物在制備抗肺癌藥物中的 應(yīng)用。該大豆素單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載 體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊、注射劑等。
[0016] 本發(fā)明進一步提供上述提取得到的大豆素單體化合物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng) 用。該大豆素單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體 或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊、注射劑等。
[0017] 按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解，大豆素單體化合物的給藥劑量應(yīng)根據(jù)治療對象 的年齡、體重、疾病嚴重程度等因素而定，一般可以是0. 35-1. 26mg/天。
[0018] 本發(fā)明采用二維液相色譜技術(shù)進行從黃綠蜜環(huán)菌中分離純化大豆素：
[0019] 首先：由于大豆素為苷元，極性非常小，所以粗提選用乙酸乙酯進行相似相溶提 取，該溶劑可以盡可能多地溶解目的組分，且乙酸乙酯為脂溶性溶劑，與其相似相溶的目的 組分也應(yīng)該具備進入生物活性細胞所必需的脂溶性特性，從而具有更高的進入細胞參與細 胞內(nèi)作用的可能性；
[0020] 其次，在一維分離的條件選擇上：多次試驗結(jié)果顯示，Silica正相硅膠色譜柱對 所提物質(zhì)分離效果較好，而通過考察不同流動相組成和不同洗脫方式、流速及進樣量后，結(jié) 果顯示采用本發(fā)明乙醇-正己烷0% -75%梯度洗脫分離效果最佳，且進樣量在50-150mL/ 針范圍內(nèi)、流動相在550-600mL/min范圍內(nèi)時重復(fù)性良好，得到的一維液相組分中目的峰 清晰、無拖尾吸收等現(xiàn)象，與其他峰之間分離好，有利于分離操作和后續(xù)進一步提純；
[0021] 再次，在二維分離的條件選擇上：由于一維得到的組分中目的化合物含量已相當 高，再使用Silica正相硅膠色譜柱，在洗脫條件選擇為B相濃度4%等度洗脫時能將極性與 大豆素非常接近的雜質(zhì)分離開，得到純度可達98%的大豆素單體化合物。
[0022] 在液相色譜的溶劑選擇上，一維色譜分離、二維色譜分離以及中間提取物的溶解， 均采用正己烷、乙醇兩種溶劑混合液，可以通過改變乙醇的比例來調(diào)節(jié)有效成分的溶解能 力和流動相的洗脫能力，且整個色譜分離僅使用兩種溶劑，有利于提取溶劑的回收再利用。
[0023] 總的來說，本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法工藝簡單，成本低， 試劑耗費量小，制備量大，穩(wěn)定可控，重復(fù)性好，批次一致性較高，得到的大豆素純度高，穩(wěn) 定性好，且具備較好的生物活性。通過細胞在線實時監(jiān)測的方法觀測其在體外的抗腫瘤作 用，發(fā)現(xiàn)該大豆素單體化合物對肺癌A549細胞和肝癌Η印-G2細胞具有抑制作用；通過建立 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該化合物對小鼠 Lewis肺癌模型具有一定的療效，對小鼠 Η22肝癌模型也具 有一定的療效。實驗充分表明，該化合物大豆素單體在體內(nèi)、體外實驗抗腫瘤作用較好，具 有抗癌藥物開發(fā)潛力，為抗癌天然藥物的開發(fā)提供了有力的依據(jù)。
【附圖說明】
[0024] 圖1所示的是本發(fā)明實施例1黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法的一維 高效液相色譜圖；
[0025] 圖2所示的是本發(fā)明實施例1黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法的二維 高效液相色譜圖；
[0026] 圖3所示的是本發(fā)明實施例1所得到的目的組分的分析型高效液相色譜圖；
[0027] 圖4所示的是本發(fā)明從黃綠蜜環(huán)菌中提取大豆素單體化合物的方法得到的目的 組分的MS質(zhì)譜圖；
[0028] 圖5所示的是本發(fā)明從黃綠蜜環(huán)菌中提取大豆素單體化合物的方法得到的目的 組分的C13NMR核磁圖；
[0029] 圖6所示的是本發(fā)明從黃綠蜜環(huán)菌中提取大豆素單體化合物的方法得到的目的 組分的tfNMR核磁圖；
[0030] 圖7所示的是本發(fā)明實施例3黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法的一維 高效液相色譜圖；
[0031] 圖8所示的是本發(fā)明實施例3黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法的二維 高效液相色譜圖；
[0032] 圖9所示的是本發(fā)明實施例4黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法的一維 高效液相色譜圖；
[0033] 圖10所示的是本發(fā)明實施例4黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法的二 維高效液相色譜圖；
[0034] 圖11所示的是本發(fā)明實施例5中大豆素單體化合物對肺癌A549細胞的抑制作 用；
[0035] 圖12所示的是本發(fā)明實施例6中大豆素單體化合物對肝癌Hep_G2細胞的抑制作 用；
[0036] 圖13所示的是本發(fā)明實施例7中大豆素單體化合物抗肺癌實驗小鼠平均瘤重，其 中從左到右依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、CTX組、模型組；
[0037] 圖14所示的是本發(fā)明實施例7中大豆素單體化合物抗肺癌實驗小鼠平均肺重，其 中從左到右依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、CTX組、模型組、空白組；
[0038] 圖15所示的是本發(fā)明實施例