uts&Bolts of siRNA Technology ,DNA Press ,2003；Gott,RNA Interference,Editing, and Modification : Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press，Totowa，NJ，2004;Sohail，Gene Silencing by 民NA Interference:Technology and Application,C民C，2004d 實施例
[0086] 本發(fā)明通過如下實施例描述，所述實施例只是例證本發(fā)明，不^任何方式限制本 發(fā)明。利用本領域熟知的標準技術或者下文特別描述的技術。
[0087] 實施例1
[0088] 材料和方法
[00例病毒和細胞:這項研究中使用的H7Nl(A/chicken/Malaysia/94)及其它AIV得自新 加坡Agri-Food&VeterinaryAu化orityD重配株流感病毒H7N9(A/Shanghai/l/13)、H7N3 (A/Canada/rv504/04)、H7N6(A/quail/Aichi/3/09)，H7N7(A/duck/Hokkaido/l/10)和H7N7 (A/Netherlands/219/03)通過先前所述的反向遺傳學產生化0 et al. ,2009)。簡而言之， 基于NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫的序列合成H7病毒的HA和NA基因的互補DNA，內部基因的六個 cDNA基于PR8(A/Puerto Rico/8/1934)病毒序列（GenScript，USA)合成。將8個流感病毒基 因節(jié)段每一個的cDNA插入pClpolsaplT載體的pol I啟動子(P化）與pol I終止子之間（由 Ruben Donis，CDC，USA善意提供），并共轉染進共培養(yǎng)的293T人胚胎腎（293T)細胞和Madin- Darby犬腎（MDCK)細胞中，使用lipofectamine 2000(Xife Technologies，USA)進行D在48 小時后，收集轉染的上清并通過標準血凝測定確定。使用如先前所述(Prabakaran et al.， 2009)-特定系列的通用引物證實序列。將原種病毒(stock virus)在11天齡含胚雞卵的尿 囊腔中在35°C增殖36小時-91小時。然后通過Muench-Reed方法（1938)計算重配株病毒的組 織培養(yǎng)感染劑量50(TCID50)。
[0090] MDCK細胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、(ATCC)。將MDCK細胞在補加10%胎牛血清 的Didbecco's最小基本培養(yǎng)基(DMEM;Life Technologies,USA)中增殖。將病毒原種在補加 0.5%牛血清白蛋白（BSA)和200ng/ml膜蛋白酶的DMEM中在MDCK細胞中生長。將293T細胞在 含有5%FBS的Opti-MEMI(Life Technologies,USA)中維持。
[0091] 使用高致病性病毒的所有實驗均遵從CDC/NIH和W冊的建議在生物安全水平3(BSL 3)防護設備中進行且也獲得新加坡Agri-Food and Veterinary Authority許可。
[0092] MAb產生:將BALB/c小鼠 W2周的規(guī)律間隔用在0.1ml憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的來 自H7Nl(A/cMcken/Malaysia/94)的二乙締亞胺(BEI)滅活的完整病毒在皮下注射免疫兩 次，其用等體積的Montanide ISA 563佐劑（SEPPIC，化ance)乳化。在脾細胞與SP2/0細胞 化e et al. ,2009)融合之前3天，將小鼠用相同的病毒抗原加強(boosted)。將融合的細胞 接種在96孔平板中，其上清通過如下述免疫巧光測定篩選。產生mAb的雜交瘤通過至少3次 有限稀釋進行克隆。如下文所述檢測陽性mAb的血凝抑制活性。將來自選擇的陽性mAb的免 疫球蛋白使用商業(yè)分型試劑盒(Amersham Bioscience，England)根據(jù)廠商指導分型。在接 種后3天收獲雜交瘤上清，細胞碎片通過在400g離屯、10分鐘沉淀，隨后收集上清并在-20°C 膽存。將mAb用Montage kit ?1'〇369-6(1;[11190'6)針對1旨6純化或者使用蛋白4瓊脂糖珠 (Mi 11 ipore)純化?？贵w的純度通過SDS-PAGE分析證實。然后通過如下文所述的標準血凝抑 審ij測定檢測mAb的中和活性。
[0093] 免疫巧光測定（IFA):將在96孔平板中培養(yǎng)的MDCK細胞用不同的AIV H7毒株感染。 在感染后24小時，將細胞用4%多聚甲醒在室溫固定30分鐘，及用憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH 7.4洗涂2次。將固定的細胞與雜交瘤培養(yǎng)上清在37°C保溫1小時，用憐酸鹽緩沖鹽水(PBS) 漂洗，然后與1:400或1:200稀釋的異硫氯酸巧光素(FITC)-綴合的兔抗小鼠免疫球蛋白 (Dako，Denmark)保溫。將細胞在PBS中再次漂洗，通過寬場epi-巧光顯微鏡(Olympus 1X71) 評估抗體結合情況。
[0094] 血凝抑制測定：血凝抑制（HI)測定如先前所述（（Prabhu et al . , 2009 ; Prabakaran et al. ,2010)進行。簡而言之，將mAb在V形底的96孔平板中系列稀釋(2倍），并 與4HA單位的H7病毒混合。將平板在室溫保溫30分鐘，在每個孔中加入1 %雞RBC。血凝抑制 終點是未觀測到凝集的最高mAb稀釋。
[0095] 微量中和測定:H7毒株的單克隆抗體的中和活性通過先前所述的微量中和測定分 析化e and Kwang,2013)。簡而言之，將10倍稀釋的mAb進一步系列稀釋(2倍），并與10050% 組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)的不同H7毒株進化枝在室溫保溫1小時，并一式兩份鋪板于在 96孔平板中生長的MDCK細胞上?；蛘?，將mAbW2倍系列稀釋，與100TCID50的不同H7毒株進 化枝在室溫保溫1小時，并一式兩份鋪板于96孔平板中生長的MDCK細胞上。MDCK細胞培養(yǎng)中 每個H7毒株的TCID50通過Reed and Muench(1938)方法確定。中和滴度評價為通過光學顯 微鏡觀測到無細胞病理效應的最高mAb稀釋度。
[0096] 逃逸突變體的分離和分析：由mAb 11B9和mAb 62識別的表位如先前所述通過鑒定 逃逸突變體而作圖化e et al.，2010;Kaverin et日1.，2007)。簡而言之，將H7親代病毒與 過量的mAb保溫1小時，然后接種于11天齡的含胚雞卵中。將雞卵在37°C保溫48-72小時。收 獲病毒并用于在含胚雞卵中有限稀釋克隆，并經(jīng)隧斑純化逃逸突變體。從尿囊液中提取 RNA。將血凝素化A)基因經(jīng)逆轉錄酶(RT)-PCR擴增并克隆進TA克隆載體(Promega)中，對一 些克隆進行測序。通過與親代病毒的序列對比分析各個克隆的序列。
[0097] 攻擊研究(實施例4):4-6周齡的近交系SPF BALB/c小鼠用于攻擊研究。小鼠 （n = 10只/組)經(jīng)鼻內感染5MLD50(50%小鼠致死劑量）的適應的H7N7毒株(A/Netherlands/219/ 03)。所有動物實驗均根據(jù)Guides for Animal Experiments Performed at NIID和實驗方 案進行。
[0098] 預防效力（實施例4):為了確定預防效力，將小鼠用lOmg/kg或0mg/kg(PBS)的mAb 11B9或mAb 62經(jīng)腹膜內注射在病毒攻擊之前預處理。24小時后，將小鼠用5MLD50的H7N7毒 株攻擊。每天觀測小鼠 W監(jiān)測體重和死亡率直至所有動物死亡或者直至攻擊后14天。
[0099] 免疫和攻擊(實施例6-10):對于攻擊實驗，如先前所述(Brown, 1990)將H7N7重配 株病毒通過Ξ次連續(xù)的肺至肺傳遞W適應小鼠。將在肺傳遞中存在的病毒在10天齡雞卵的 尿囊腔中在37°C增殖48小時W制備病毒原種。如Reed和Munch方法所述計算50 %小鼠致死 劑量(MLD50)。4-6周齡的SPF雌性BALB/c小鼠用于攻擊研究。小鼠 （η = 5只/組)經(jīng)鼻內接種5 或10MLD50 (50 %小鼠致死劑量)的致病性Η7Ν7 (A/Nether lands/219/03)毒株。
[0100] 對于鼻內免疫，首先將小鼠經(jīng)腹膜內用10化1氯胺酬（lOmg/ml)和甲苯嚷嗦（Img/ ml)鹽水麻醉。每只小鼠用經(jīng)鼻內接種10化1的于PBS中的Mab或病毒。
[0101] 預防效力（實施例6-10):為了確定預防效力，小鼠經(jīng)鼻內或腹膜內用2.5mg/kg、 5mg/kg或lOmg/kg純化的Mab 62在進行病毒攻擊之前預處理。對照小鼠經(jīng)鼻內僅用PBS處 理。24小時后，將小鼠用5MLD50的H7N7毒株攻擊。每天觀測小鼠 W監(jiān)測體重和死亡率直至死 亡或攻擊后14天。
[0102] 治療效力（實施例6-10):為了確定治療效力，將每組小鼠實驗性感染5MLD50的 H7N7毒株。在病毒感染后1天、2天或7天，將小鼠經(jīng)鼻內或腹膜內途徑用5mg/kg、10mg/kg或 15mg/kg的Mab 62處理。感染的對照小鼠經(jīng)鼻內僅用PBS處理。每天觀測小鼠 W監(jiān)測體重和 死亡率直至死亡或者攻擊后14天。
[0103] 組織病理學分析(實施例6-10):在攻擊后第2天、第4天和第6天從每組小鼠（N=3) 收獲進行組織學檢驗的肺樣品，并固定于10%緩沖的福爾馬林(pH 7.4)中，在石蠟中包埋 并切成4μηι切片。將切片使用化31：-油〇;!^6(41]16'3(3〇)脫蠟，在連續(xù)梯度乙醇浴中再水合。玻 片用皿染色，通過光學顯微鏡(Olympus, UK)進行病理學評估。通過數(shù)字成像系統(tǒng)捕獲圖像 (Wkon，USA)。
[0104] 統(tǒng)計學分析(實施例6-10):數(shù)據(jù)W算術平均數(shù)和標準差（SD)表示。進行未配對雙 尾Student'S t檢驗W確定兩組平均值之間差異的顯著水平。單向方差分析(AN0VA)也用于 檢測組間差異。所有統(tǒng)計學分析均用SigmaStat 2.0(Jandel Co巧oration)軟件進行。 [0105] 實驗性血清樣品（實施例ll-15):滅活的AI病毒(表l)在ISA-70(SEPPIC，F(xiàn)rance) 佐劑中乳化并肌肉注射至3周齡白色來亨雞(n = 4)中。W2周間隔施用兩次加強。從在第一 次和第二次注射后10天收集的血液中制備血清。應答同源株系的抗體通過下述HI評估。小 鼠組(n = 4)肌肉注射在佐劑(SEPPIC，化ance)中單獨乳化的不同的滅活的H7AIVdW兩周間 隔重復注射兩次。此外，用滅活的H7N1(A/化icken/Malaysia/94)免疫豚鼠。在第二次免疫 后14天收集血液。
[0106] H7桿狀病毒產生(實施例11-15):如先前所述產生重組桿狀病毒載體(Prabakaran et al. ,2010)。在標準PCR反應中從H7N7(A/化/219/03)重配病毒中擴增全長HA基因。將擴 增的齡基因插入穿梭載體口。45了8曰地了4(1醇;[付0邑6]1,5曰]1〇16邑〇,〔4,1]54)中^在白斑綜合 征病毒(WSSV)立即早期（iel)啟動子下表達。將運個表達盒通過位點特異性轉位整合進 DH10BacTM(Invit;rogen,USA)內的桿狀病毒基因組中，根據(jù)Bac-to-Bac系統(tǒng)（Invitrogen) 的方案進行。將SF9H細胞在28°C在SF90〇n無血清培養(yǎng)基(G化CO BRL，USA)中維持W合成 重組桿狀病毒。然后將重組桿粒轉染進SF9II細胞中，在感染后96小時收獲含有重組桿狀病 毒展示的H7-HA(Bac-H7)的上清。
[0107] 雙功能化ISA(實施例11-15):將96孔圓底微滴定板(Nunc，Roskilde，Demark)用在 100μΙ碳酸鹽緩沖液(73mM碳酸氨鋼和30mM碳酸鋼，pH 9.7)中的0.扣g/孔的捕獲mAb 11B9 在4°C包被過夜或者在37°C包被2小時。將平板用PBST洗涂兩次，隨后在每次與抗體或抗原 保溫后用PBS洗涂兩次?？贵w包被的平板通過與10化1封閉緩沖液(含有5%牛奶的PBS)在室 溫保溫1小時而封閉。對于抗原檢測，然后將經(jīng)封閉的平板與在PBST中稀釋的10化1含有病 毒的樣品在37°C保溫1小時。對于抗體檢測，將與50μ1的8HAU表面表達H7的桿狀病毒混合的 50μ1血清加入經(jīng)封閉的平板中，在37°C保溫1小時。病毒結合或抗體封閉通過與10化1的辣 根過氧化物酶綴合的檢測mAb 62(800ng)(內部標記;Roche)在37°C保溫1小時而檢測。生色 團顯色通過加入10化1新鮮制備的底物溶液(0-苯二胺-二鹽酸化物；Sigma)而介導。使用 0.1N硫酸終止反應，記錄在490nm的光密度?？乖瓩z測限通過給出信號-噪音比為3的光密度 值確定。對于抗體檢測，計算每個樣品稀釋液的由于阻斷mAb結合的血清抗體所致0D密度降 低，使用下式計算:抑制％ =[(陰性參考血清0D-檢測血清00)/(陰性參考血清0D-陽性參考 血清0D )] X 1 0 0 %。為了確定抗體檢測的截斷值，從新加坡的An i ma 1 He a 11 h Biotechnology Serum Bank,Temasek Life Sciences Laboratory獲得無特定病原體雞血 清、小鼠和豚鼠。
[0108] 實施例2:表征鼠單克隆抗體11B9和62
[0109] 單克隆抗體11B9和62從用A/cMcken/Malaysia/94H7Nl病毒免疫的小鼠中產生。 經(jīng)鑒別mAb 11B9和mAb 62均屬于同種型IgGl。除了在使用H7N1感染的MDCK細胞中陽性活性 之外，均呈現(xiàn)針對H7N1毒株A/cMcken/Malaysia/94的中和活性（圖1A和1B)，提示其均識別 H7中的中和表位。在中和和IFA中針對不同H7毒株進一步檢測兩種mAb。在使用不同AIV感染 的MDCK細胞的IFA中，運兩種mAb均呈現(xiàn)與檢測的所有四種H7毒株的特異性反應，而與任何 非H7毒株無任何交叉反應(表1)。因此，mAb 11B9和mAb 62均特異于H7亞型，而與非H7毒株 無任何相互作用。在與不同AIV的中和檢測中觀測到相似結果。mAb 11B9和mAb 62能中和所 有四種檢測的H7,而與任何非H7毒株檢測到無活性(表2)，表示兩種mAbs均是H7特異性中和 抗體。
[0110] 表1:在多種AIV感染的MDCK細胞中篩選單克隆抗體11B9和62
[0111]
[0114] a MAb濃度為0.1 mg/ml.
[0115] 6 100個TCID50病毒毒株用于微量中和測定。
[0116] 實施例3:針對鼠單克隆抗體11B9和62的表位作圖
[0117] 由于兩種mAb能中和H7病毒，使用中和化逃逸突變體選擇分析參與兩種mAb的表位 形成的氨基酸。A/chicken/Malaysia/94H7Nl病毒用作用于選擇的親代病毒。將分離自多個 逃逸變體的完整HA基因的序列與親代病毒對比。發(fā)現(xiàn)來自mAb 11B9的突變體在氨基酸組合 136(Ser to Gly)和227(Glu突變?yōu)镚ly)或者 137(Gly突變?yōu)锳rg)和227(Glu to Gly)攜帶 雙突變，而對mAb 62的突變體在氨基酸175(Lys突變?yōu)镚lu)和227(Glu突變?yōu)镚ly)具有雙突 變。序列編號包括信號膚(表3)。
[0118] 表3:使用mAb 11B9和mAb 62通過逃逸突變的H7HA的中和表位
[0119]
[0120] 實施例4:使用mAb 11B9和mAb 62保護小鼠免于致死性病毒攻擊的預防性治療
[0121] 在用適應的H7N7病毒(A/Netherlands/219/03)攻擊的小鼠中單獨檢驗mAb 11B9 和mAb 62的預防性效力。用單一劑量的lOmg/kg任一mAb預處理的所有小鼠在用5MLD50的 H7N7病毒(A/Netherlands/219/03)致死性攻擊之后均得W保護免于死亡（100%保護），而 所有未處理的對照小鼠在攻擊后7天均死于病毒感染（圖1A)。用單一劑量的lOmg/kg任一 mAb預處理的所有小鼠示出在病毒攻擊后低于1%體重喪失。大多數(shù)運些mAb處理的小鼠在 病毒攻擊后獲得體重增加直至8%，而未用mAb處理的小鼠組示出在病毒攻擊后顯著的體重 喪失(>30%)(圖 1B)。
[0122] 實施例5:抗體及抗體片段的產生
[0123] 本發(fā)明的單克隆抗體可W通過任何技術產生，所述技術允許通過培養(yǎng)的連續(xù)細胞 系產生抗體。運種方法包括但不限于最初由Kohler和Mi Istein在1975年掲示的雜交瘤技術 (Nature 256:495-497)，W及Ξ瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術化ozbor et al.，1983， Immunology Today 4:72)W及EBV-雜交瘤技術W產生人單克隆抗體（Cole et al.,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R丄iss, Inc.,pp 77-96(1985))?？?W使用人抗體及人抗體可W通過使用人雜交瘤獲得（Cote et al.，1983，P;roc.Nat = 1. Acad. Sci . U. S. A.，80:2026-2030)，或者通過用EBV病毒在體外轉化人B細胞而獲得(Cole et al.,1985,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77- 96)。此外，可W使用產生"嵌合抗體"或"人源化抗體"而開發(fā)的技術(Morrison et al.， 1984,J.Bacte;riol.l59-870;Neube;rger et al.,1984,化ture 312:604-608;Takeda et al.，1985，Nature 314:452-454)，通過導入本發(fā)明的鼠抗體分子如mAb 11B9或mAb 62的序 列W及具有合適生物活性的人抗體分子的基因進行。嵌合抗體是含有人Fc部分和鼠（或其 它非人)Fv部分的那些抗體。人源化抗體是其中鼠（或其它非人)互補決定區(qū)（CDR)滲入人抗 體的那些抗體。嵌合抗體和人源化抗體是單克隆抗體。運種人或人源化嵌合抗體優(yōu)選用于 人疾病或病癥的體內診斷或治療。
[0124] 根據(jù)本發(fā)明，可W調整產生單鏈抗體描述的技術(美國專利4,946,778)^提供本 發(fā)明的單鏈抗體。本發(fā)明的另一實施方案利用針對構建化b表達文庫描述的技術化use et al.，1989,Science 246:1275-1281)，W使得可此陜速和簡便地鑒別本發(fā)明的抗體具有希 望的特異性的單克隆化b片段或其衍生物或類似物。