調節(jié)性t細胞的擴增方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明設及細胞領域，尤其設及一種調節(jié)性Τ細胞的擴增方法。
【背景技術】
[0002] 調節(jié)性Τ細胞(Regulatory cell，簡稱化eg)是一群具有免疫抑制效應的Τ細胞亞 群。對人體的免疫系統(tǒng)來說，Treg細胞無疑是把雙刃劍。它對維持機體免疫耐受和免疫應答 穩(wěn)態(tài)具有非常重要的作用，可W通過一系列機制抑制過強的免疫應答，使得機體在自身損 傷最小的情況下有效的清除抗原或病原體?？刂苹痚g細胞的數(shù)量與表達可W幫助我們控制 疾病的進程。Treg細胞主要通過兩種方式發(fā)揮免疫抑制功能。第一種方式是化eg細胞可W 通過分泌異質性細胞因子等發(fā)揮免疫調節(jié)作用;第二種方式是Treg細胞主要通過細胞與細 胞的直接接觸來發(fā)揮作用。
[0003] CD4 乂 D25+化eg細胞作為一類調節(jié)性T細胞，在自身反應性T細胞的增殖，維持免疫 耐受方面起著重要的作用?，F(xiàn)有技術中采用免疫磁珠兩步法分離CD4+CD25+Treg細胞，并用 CD4+CD25+Treg細胞專用的完全培養(yǎng)基和一定濃度的化-2培養(yǎng)擴增CD4+CD25+Treg細胞。在 上述現(xiàn)有技術中使用的培養(yǎng)基成本較高，免疫磁珠分選CD4+CD25+化eg細胞需要過柱，操作 繁瑣。而且，分離得到的CD4+CD25+Treg細胞的擴增效率低。因此，如何簡單分離并提高CD4+ CD25+化eg細胞的擴增效率，是當下研究的熱點。

【發(fā)明內容】

[0004] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種調節(jié)性T細胞的擴增方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0006] 調節(jié)性T細胞的擴增方法，將CD4+CD25+Treg細胞和hUC-MSCs共同培養(yǎng)。
[0007] 優(yōu)選地，所述CD4+CD化+Treg細胞和hUC-MSCs共同培養(yǎng)的方法為：
[000引將hUC-MSCs接種到Transwell小室的上室，將CD4+CD25+Treg細胞接種到Transwell 小室的下室，共同培養(yǎng)14天，每隔2天對細胞進行補液。
[0009] 優(yōu)選地，所述hUC-MSCs的密度為lX105cells/ml，CD4+CD25+Treg細胞的密度為lX l〇6cells/ml。
[0010] 優(yōu)選地，共同培養(yǎng)時所使用的培養(yǎng)基為X-VIV0 15培養(yǎng)基，其中添加200-1000U/ml 的]Χ-2和 10-50ng/ml的Flt3(Fms-like tyrosine kinase,FMS樣的酪氨酸激酶3)。
[0011] 優(yōu)選地，CD4+CD化+Treg細胞通過W下方法制備：
[001^ S11、采用密度梯度離屯媒自血液中分離單個核細胞(PBMC);
[0013] S12、自PBMC中分選出CD4+CD化+Treg細胞。
[0014] 更優(yōu)選地，所述血液為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血液。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者因自身 抗原免疫耐受缺失，導致淋己細胞大量活化和增生、自身抗體大量產(chǎn)生和炎性介質的大量 釋放。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者緩解期體內的CD4+CD化+Treg細胞對由免疫過強而引起的自身免 疫性疾病有很好的治療效果。
[001引更優(yōu)選地，所述步驟S12使用EasySep?人CD4+CD25+T細胞分選試劑盒自PBMC中分 選出CD4+CD化+Tr eg細胞。
[0016] 優(yōu)選地，hUC-MSCs通過W下方法制備：
[0017] S21、去除廝帶中的動靜脈和羊膜;將廝帶剪成碎塊；用0.2m/v%的Π 型膠原酶消 化液廝帶碎塊2-4h，2000巧m離屯、得到原代的hUC-MSCs;
[001引 S22、用含5-20ng/ml EGFf3的X-VIV015培養(yǎng)原代hUC-MSCs，2地后換液，去掉未貼壁 細胞;繼續(xù)培養(yǎng)至hUC-MSCs匯合度達到90%，用0.25m/v%膜蛋白酶消化2min，1000巧m離屯、 得到P1代hUC-MSCs;繼續(xù)培養(yǎng)直到獲得P3代hUC-MSCs。
[0019] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明調節(jié)性T細胞的擴增方法具有如下有益效果：
[0020] 1、本發(fā)明將CD4+CD25+化eg細胞在體外與人廝帶間充質干細胞化UC-MSCs)進行共 同培養(yǎng)，hUC-MSCs所分泌的生長因子可W促進CD4+CD25+Treg細胞的增殖，增強了擴增效果。 將使用本發(fā)明方法擴增后的CD4+CD化可reg細胞做成制劑，回輸療效良好。
[0021] 2、本發(fā)明采用分選試劑盒免疫磁珠進行分選，無需過柱，操作簡便，節(jié)省時間。
[0022] 3、本發(fā)明采用基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，降低了成本。
【附圖說明】
[002；3 ]圖1為效果實施例1中CD4+CD25+Treg細胞的增殖曲線。
[0024] 圖2為實施例1中分選獲得的CD4+CD化可reg細胞的流式檢測結果。
[0025] 圖3為實施例1共同培養(yǎng)后獲得的CD4+CD化可reg細胞的流式檢測結果。
[0026] 圖4為對比例1中分選獲得的CD4+CD25+Treg細胞的流式檢測結果。
[0027] 圖5為對比例1共同培養(yǎng)后獲得的CD4+CD化可reg細胞的流式檢測結果。
【具體實施方式】
[0028] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結合附圖和具體實施例做進一步說明。本發(fā)明中所 用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再寶述。
[00巧]實施例1
[0030] 調節(jié)性T細胞的擴增方法，包括W下步驟：
[0031] SUCD4+CD化可reg細胞的分離和分選;具體包括W下步驟：
[0032] S11、采用密度梯度離心法自血液中分離單個核細胞(PBMC);所述血液為系統(tǒng)性紅 斑狼瘡患者的血液；
[0033] S12、使用6曰375邱了》人〔04+〔025可細胞分選試劑盒，按照其說明書所述的步驟操作 自PBMC中分選出CD4+CD化+Treg細胞。
[0034] S2、hUC-MSCs的分離和傳代;具體包括W下步驟：
[0035] S21、去除廝帶中的動靜脈和羊膜;將廝帶剪碎至約1mm3大小的碎塊；用0.2m/v% (質量體積濃度）的Π 型膠原酶消化廝帶碎塊2-4h，用含體積分數(shù)10%FBS的培養(yǎng)基終止消 化，2000巧m離屯、5min得到原代的hUC-MSCs;
[0036] S22、用含5-20ng/ml EGFf3的X-VIV015培養(yǎng)原代hUC-MSCs，2地后換液，去掉未貼壁 細胞;繼續(xù)培養(yǎng)至hUC-MSCs匯合度達到90 %，用0.25m/v %膜蛋白酶消化2min;用含體積分 數(shù)10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，lOOOrpm離屯、5min得到P1代hUC-MSCs;繼續(xù)培養(yǎng)至獲得P3代 hUC-MSCso
[0037] S3、將CD4+CD25+Treg細胞和hUC-MSCs共同培養(yǎng);具體包括W下步驟:S31、將密度為 1 X l〇5cells/ml的P3代hUC-MSCs接種到Transwell小室（CORNING，聚碳酸醋膜的孔徑為化 m)中的上室，每孔2ml;
[0038] S32、將密度為lX106cells/ml的CD4+CD25+Treg細胞接種到TYanswell小室中的下 室，每孔2ml;
[0039] S33、共同培養(yǎng)14天，每隔2天對細胞進行補液，所使用的培養(yǎng)基為X-VIV0 15培養(yǎng) 基，其中添加 200-1000