一種用于全懸浮培養(yǎng)mdck細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的無(wú)血清 培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感(禽流感)是危害人類(lèi)健康和養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病，疫苗接種是目前預(yù)防 流感(禽流感）的最主要手段之一，傳統(tǒng)流感疫苗用雞胚培養(yǎng)生產(chǎn)，該方法存在制備過(guò)程中 微生物污染幾率高、產(chǎn)品內(nèi)毒含量高、注射副反應(yīng)大、廢物有環(huán)境污染處理成本高、流感大 流行暴發(fā)時(shí)雞胚供應(yīng)困難和生產(chǎn)周期長(zhǎng)等工藝缺點(diǎn)，因此開(kāi)發(fā)安全、高效的動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì) 流感疫苗勢(shì)在必行。
[0003] MDCK細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)由Madin和Darby于 1958年 從美國(guó)Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培養(yǎng)。是目前公認(rèn)的適于甲、乙型流感病 毒疫苗生產(chǎn)的理想細(xì)胞系之一，已有荷蘭蘇威制藥公司、瑞±諾華公司和美國(guó)阿斯利康旗 下的Medimmune公司批準(zhǔn)利用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗。我國(guó)也有多家企業(yè)正在利用MDCK細(xì) 胞進(jìn)行流感疫苗的研發(fā)，但目前還沒(méi)有自主研發(fā)的MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗上市，原因除 我國(guó)企業(yè)起步較晚外，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)個(gè)性化培養(yǎng)基也是制約我國(guó)細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗研發(fā)進(jìn) 程的重要因素。
[0004] 我國(guó)許多細(xì)胞基質(zhì)的疫苗正在進(jìn)行或完成了從傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝向生物反應(yīng)器高 密度培養(yǎng)工藝升級(jí)轉(zhuǎn)型，生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞有兩種方式，一種是利用細(xì)胞本身要貼附在 培養(yǎng)物表面生長(zhǎng)的特性進(jìn)行微載體培養(yǎng)，運(yùn)種方式要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)工藝路線復(fù)雜不容 易掌握，導(dǎo)致的結(jié)果是現(xiàn)有條件下培養(yǎng)規(guī)模小，在生產(chǎn)中要使用數(shù)量很多的小型生物反應(yīng) 器才能生產(chǎn)任務(wù)，由于反應(yīng)器之間的差異最終導(dǎo)致整個(gè)產(chǎn)品有較大的批間差，而且培養(yǎng)工 藝中要使用動(dòng)物血清提供細(xì)胞在微載體上貼附的貼壁因子，增加了生物安全的風(fēng)險(xiǎn)和下游 純化工藝。第二種將細(xì)胞馴化成可全懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞后進(jìn)行生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)，目前 用BHK21細(xì)胞在口蹄疫疫苗中已全部完成工藝升級(jí)，國(guó)內(nèi)生物反應(yīng)器無(wú)血清培養(yǎng)的單罐培 養(yǎng)體積可達(dá)3000L，是微載體培養(yǎng)單罐體積的60倍之多。全懸浮培養(yǎng)工藝容易線性放大，而 且還可采用無(wú)血清培養(yǎng)基，提高了下游產(chǎn)品的生物安全性，簡(jiǎn)化了純化工作，是目前新疫苗 研發(fā)的方向。
[000引無(wú)血清培養(yǎng)基使用成分明確的血清替代物，不僅簡(jiǎn)化了下游工藝，也避免了生物 污染風(fēng)險(xiǎn)，但是目前血清成分仍不清楚，況且MDCK細(xì)胞本身對(duì)培養(yǎng)條件要求高，開(kāi)發(fā)該細(xì)胞 無(wú)血清培養(yǎng)基一直是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的 無(wú)血清培養(yǎng)基，為我國(guó)流感疫苗生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝提供支撐。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述 培養(yǎng)基由含化Cl為5g/L的DMEM/F12培養(yǎng)基和w下組分組成：亞錫酸鋼;重組人表皮細(xì)胞生 長(zhǎng)因子化GF);氨化可的松;重組全鏈膜島素;前列腺素化1);人轉(zhuǎn)鐵蛋白；甲狀腺素(T3);維 生素 E;膽固醇；乙醇胺;β-琉基乙醇；吐溫-80; Η評(píng)ep 1510;重組人血白蛋白ACF;甘露醇糖。
[0008] 作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基由含NaCl為5g/L的DMEM/F12培養(yǎng)基和W下組分組成：
[0009] 微量元素：
[0010] 亞錫酸鋼 0.000001-0.0 OOOlg/L
[OOU] 生長(zhǎng)因子；
[0012] 重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子化GF) 0.00005-0.0005g/L
[0013] 氨化可的松 0.000012-0.00006g/L
[0014] 重組全鏈膜島素 0.001-0.0 lg/L
[0015] 前列腺素化 1) 0.00001-0.00005g/L
[0016] 人轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.002-0.008g/L
[0017] 甲狀腺素(T3) 1-5X10-1 VL
[0018] 脂類(lèi)復(fù)合物：
[0019] 維生素 E 0.00001-0.0 OOlg/L
[0020] 膽固醇 0.00001-0.0 OOlg/L [0021 ]乙醇胺 0.0005-0.0 Olg/L
[0022] β-琉基乙醇 0.0005-0.0 Olg/L
[0023] 吐溫-80 0.005-0.0 lg/L
[0024] 植物水解物：
[00 巧]Hy化pl510 1-lOg/L
[0026] 重組人血白蛋白：
[0027] ACF 0.5-5g/L
[002引 其它；
[0029] 甘露醇糖 0.5-5g/L。
[0030] 作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述培養(yǎng)基由含化Cl為5g/L的DMEM/F12培養(yǎng)基和W下組分組 成：
[0031 ] 微量元素：
[0032] 亞錫酸鋼 〇.〇〇〇〇〇5g/L
[0033] 生長(zhǎng)因子：
[0034] 重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子化GF) 0.0 OOlg/L
[0035] 氨化可的松 0.000036g/L
[0036] 重組全鏈膜島素 0.005g/L
[0037] 前列腺素 El 0.000025g/L [003引人轉(zhuǎn)鐵蛋白0.0047g/L
[0039] 甲狀腺素 (T3) 4.0X10-Wg/L
[0040] 脂類(lèi)復(fù)合物：
[0041 ]維生素 E 0.00005g/L [0042]膽固醇 0.00005g/L
[0043] 乙醇胺 0.000925g/L
[0044] β-琉基乙醇 0.000975g/L
[004引 吐溫-80 0.00625g/L
[0046] 植物水解物：
[0047] Hyl^pl510 5g/L [004引重組人血白蛋白：
[0049] ACF 0.5-lg/L
[0050] 其它；
[0051] 甘露醇糖Ig/L。
[0052] 作為優(yōu)選，所述重組人血白蛋白ACF的濃度為0.5g/L或Ig/L。
[0053] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:是將脂溶性原 料乳化凍干后與其它原料混合，磨細(xì)即得。
[0054] 使用時(shí)，用注射用水溶解，每升加2200mg化HC03，定容，用1N氨氧化鋼或1N鹽酸調(diào) pH值至7.1-7.2,過(guò)濾除菌即得。
[0055] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供上述培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:將脂溶性原料 乳化后（不需要凍干）與其它原料依次溶解于注射用水，然后每升加入2200mg NaHC〇3,定 容，最后用IN氨氧化鋼或IN鹽酸調(diào)抑值至7.1-7.2,過(guò)濾除菌即得。
[0056] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述培養(yǎng)基在無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0057] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供應(yīng)用上述培養(yǎng)基全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法，在權(quán)利 要求1-4任一所述的培養(yǎng)基中直接接種MDCK細(xì)胞，不添加血清，在37°C，120rpm的轉(zhuǎn)速下?lián)u 床培養(yǎng)。
[0058] 為了得到全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，本申請(qǐng)人進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，在基本 確定了培養(yǎng)基中含有的各項(xiàng)組分后，又對(duì)最佳配比進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，W下為部分實(shí)驗(yàn)過(guò)程 及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0059] 本申請(qǐng)人W商品化的DMEM/F12培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)整氯化鋼濃度調(diào)節(jié)滲透 壓和添加植物水解蛋白、重組人血白蛋白、生長(zhǎng)因子和脂類(lèi)，設(shè)計(jì)和優(yōu)化MDCK懸浮細(xì)胞生長(zhǎng) 的無(wú)血清培養(yǎng)基配方。
[0060] ①預(yù)試驗(yàn)一:在DMEM/F12培養(yǎng)基直接加下列添加物(單位:g/L):
[0061] 微量元素：
[0062] 亞錫酸鋼（Na2Se〇3-甜 2〇) 0.000005
[0063] 生長(zhǎng)因子：
[0064] 重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子化GF) 0.0001 [006引 氨化可的松0.000036
[0066] 重組全鏈膜島素0.005
[0067] 前列腺素 E1 0.000025 [006引人轉(zhuǎn)鐵蛋白0.0047
[0069] 甲狀腺素(T3) 4.0X10-W
[0070] 脂類(lèi)復(fù)合物：
[0071] 維生素 E 0.0002
[0072] 膽固醇 0.0002
[0073] 乙醇胺 0.0037
[0074] β-琉基乙醇 0.0039
[007引吐溫-80 0.025(密度為1.09g/ml，稱(chēng)量時(shí)按Ig/ml計(jì)）
[0076] 植物水解物：
[0077] Hy 化 pl510 10 [007引重組人血白蛋白：
[0079] ACF 1
[0080] 其它；
[0081] 甘露醇糖1
[0082] 調(diào)抑為7