調(diào)控調(diào)節(jié)性t細(xì)胞功能的方法和組合物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的方法和組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)，具體涉及增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)的方法，更具體地說(shuō)是涉及逆轉(zhuǎn) 調(diào)節(jié)性Τ細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)抑制的方法。 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2013年3月14日、專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?1/781，024的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān) 利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該專(zhuān)利申請(qǐng)內(nèi)容通過(guò)參考并入本申請(qǐng)中。 發(fā)明背景
[0003] 通過(guò)調(diào)控免疫系統(tǒng)來(lái)消除傳染物、惡性腫瘤細(xì)胞等是一個(gè)很有前景的治療方法。 直到最近這種治療方法在腫瘤免疫上的應(yīng)用也僅僅有零星的成功案例（DiLorenzoet al.，2011;Lesterhuisetal.，2011;Rosenberg，2011)。最近FDA批準(zhǔn)通過(guò)了免疫治療性 疫苗/藥物sipuleucel-T(Provenge)和ipilimumab(Yervoy)代表腫瘤免疫治療領(lǐng)域里程 碑式的成就（Hodietal.，2010;Kantoffetal.，2010)。此外，應(yīng)用gplOO肽治療黑色素 瘤的三期臨床試驗(yàn)取得了很好的臨床效果（Schwartzentruberetal.，2011)。然而，這些 藥物的臨床效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到完全有效和永久治愈的程度。對(duì)于sipuleucel-T，病人使用 后也只延長(zhǎng)4. 1個(gè)月的存活期，沒(méi)有明顯的腫瘤消退及PSA水平的變化；而每個(gè)病人的花費(fèi) 卻高達(dá)93, 000美元。因此，急需要為癌癥患者，包括轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，開(kāi)發(fā)一種更為有 效和平價(jià)的疫苗/藥物。
[0004] 多種因素可造成肽為基礎(chǔ)的疫苗，包括FDA批準(zhǔn)的疫苗臨床效果差的原因 (Buonerbaetal.，2011)，其中，強(qiáng)有力的負(fù)調(diào)控機(jī)制，包括腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg)介導(dǎo)的免疫抑制，是改善腫瘤疫苗和藥物療效的主要障礙Curieletal.，2004; Wangetal·，2004;WangandWang，2007 ;Zou，2006)。例如，原先就存在于腫瘤病灶位置 的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)，可以潛在地抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而成為腫瘤免疫治療 的主要障礙（Wangetal.，2004;Wangetal.，2005;WrzesinskiandRestifo,2005)〇 ⑶4+Treg介導(dǎo)的腫瘤免疫抑制在腫瘤動(dòng)物模型和腫瘤患者中都有報(bào)道（Berendtand North，1980;Mukherjietal.，1989)，在不同種類(lèi)腫瘤的患者，包括肺癌，乳腺癌及卵巢癌 患者，其CD4+CD25+Treg細(xì)胞在全部CD4+T細(xì)胞中所占的比例升高（Curieletal.，2004; Wooetal.，2001)。我們的研究進(jìn)一步證明腫瘤病灶中存在抗原特異性⑶4+Treg細(xì)胞， 它們可以誘導(dǎo)抗原特異性和局部免疫耐受（Wangetal.，2004;Wangetal.，2005)。因此 克服這些免疫抑制可能是成功開(kāi)發(fā)更有效的腫瘤疫苗和藥物的關(guān)鍵。一些研究者試圖用 CD25+抗體消除CD4+CD25+Treg細(xì)胞（Mahnkeetal.，2007;Morseetal.，2008;Powell etal·，2008;RechandVonderheide，2009)，另有研究者用環(huán)磷酰胺去除Treg細(xì)胞（Audia etal.，2007;Ghiringhellietal.，2007)。然而，無(wú)論是⑶25抗體還是環(huán)磷酰胺均不是 特異針對(duì)Treg細(xì)胞，因?yàn)棰?5不僅僅表達(dá)在⑶4+⑶25+Treg，還表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面。
[0005] Treg細(xì)胞根據(jù)其表型、細(xì)胞因子表達(dá)譜和抑制機(jī)制的不同可以分為不同的亞 類(lèi)。自然發(fā)生的⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞是⑶4+T細(xì)胞的一個(gè)小亞群，它發(fā)源于胸腺，未接觸 抗原，通過(guò)細(xì)胞接觸機(jī)制抑制免疫反應(yīng)（Sakaguchi，2004 ;Shevach，2002)。相比之下，抗 原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞，例如Trl和Tr3是在外周中經(jīng)抗原刺激生成，它們通過(guò)釋放抑制性 的細(xì)胞因子IL-lO/TGF-β來(lái)抑制免疫反應(yīng)（Levingsetal.，2002 ;Shevach，2002;von Boehmer，2005)。我們之前的研究表明LAGE1或ARTC1特異的CD4+Treg細(xì)胞與自然發(fā)生 的⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞一樣，依賴(lài)于細(xì)胞接觸機(jī)制抑制免疫反應(yīng)（Wangetal.，2004;Wang etal.，2005)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞和LAGE1特異的Treg細(xì)胞的抑制功能在DCs不存在 的條件下可以被TLR8配體如多聚鳥(niǎo)苷核苷酸（PolyG-OND)逆轉(zhuǎn)（Pengetal.，2005)。因 為CD4+Treg細(xì)胞富集在腫瘤部位，我們推測(cè)，Treg細(xì)胞的不同亞類(lèi)可能存在于腫瘤病人的 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TILs)中。我們?cè)谘芯框?yàn)證這一推測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型抗原特異性 ⑶4+Treg細(xì)胞亞群，它的免疫抑制作用是通過(guò)釋放不同于IL-10或TGF-β(或二者都有） 的可溶性因子。
[0006]盡管用PolyG-OND處理可以逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞功能（Kiniwaetal·，2007;Penget al·，2005;Pengetal·，2007)，但是還不確定PolyG-OND是否可以逆轉(zhuǎn)人和小鼠Treg細(xì)胞 的抑制功能。
[0007] 急需一種方法和治療試劑可用來(lái)操控Treg細(xì)胞的免疫抑制能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 這里描述的是產(chǎn)生一種新型的⑶4+Treg細(xì)胞，它抑制免疫反應(yīng)是通過(guò)IL-10或 TGF-β非依賴(lài)性的可溶性因子介導(dǎo)的。為克服免疫抑制及去除免疫抑制細(xì)胞所引起的潛 在問(wèn)題，本發(fā)明利用新鑒定的Treg細(xì)胞開(kāi)發(fā)了一種篩選系統(tǒng)用于篩選、鑒定能夠阻斷Treg 細(xì)胞抑制功能的化合物。分別用新鑒定的化合物處理Treg細(xì)胞不同的時(shí)間，可以得到維持 Treg細(xì)胞處于非抑制狀態(tài)的不同時(shí)間窗口期。由于小鼠的TLR8沒(méi)有功能，我們制備了人 TLR8轉(zhuǎn)基因小鼠，研究發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明抑制Treg細(xì)胞功能的化合物分別處理人TLR8轉(zhuǎn)基 因小鼠及C57BL/6野生型小鼠，人TLR8轉(zhuǎn)基因小鼠而不是野生型小鼠的抗腫瘤免疫反應(yīng)增 強(qiáng)。
[0009] 宿主免疫反應(yīng)中的Treg細(xì)胞抑制劑可以增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，可用于在病人的免 疫系統(tǒng)需要增強(qiáng)的情況下，如針對(duì)腫瘤或感染性疾病時(shí)，使用。
[0010] 抑制或增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)中的Treg細(xì)胞功能的化合物、包含化合物的藥物組合 物包括但不局限于表1所列出的代表性化合物號(hào)為1，2, 34, 5,6, 7,13, 22, 23, 24和25的化 合物。
[0011] 因此，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)藥物組合物，其中含有達(dá)到藥學(xué)有效量 的、來(lái)源于表1所列化合物號(hào)為1，2,34,5,6,7，13,22,23,24和25中的一個(gè)化合物，以及符 合藥學(xué)規(guī)范的賦形劑。本發(fā)明中的藥物組合物可進(jìn)一步包含一個(gè)抗原，這個(gè)抗原可能蛋白， 多核苷酸或多糖抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還可進(jìn)一步包含一個(gè)佐劑。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明在哺乳動(dòng)物需要時(shí)提供了一種抑制Treg細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫抑制的方法，或更通俗地說(shuō)是增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)的方法，此方法是給哺乳動(dòng)物用一 個(gè)有效藥物劑量的、激活MyD88-IRAK4信號(hào)通路的一個(gè)Toll樣受體8配體的藥物組合物。 所述配體選自ssRNA40,ssRNA33,CpG，Poly-G10,resiquimod，loxoribine，鞭毛蛋白，LPS， Pam3CSK4 ;或從化合物號(hào)為1，2, 34, 5,6, 7,13, 22, 23, 24和25的組中選取。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。哺乳動(dòng)物可能患有癌癥或者是具有患癌癥的 風(fēng)險(xiǎn)。可進(jìn)一步給予哺乳動(dòng)物致免疫量的、含有癌癥特異性抗原的癌癥疫苗。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，進(jìn)一步給予哺乳動(dòng)物佐劑。佐劑可與抗原一起或偶聯(lián)到抗原上給藥。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量的化療藥物也可給予哺乳動(dòng)物。
[0015] 哺乳動(dòng)能可能患感染性疾病或有得感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選抑制宿主免疫反應(yīng)的Treg細(xì)胞抑制劑的方法，包括1) 提供一個(gè)候選化合物，2)提供CD4+Treg細(xì)胞，3)分別在候選化合物存在及不存在的條件 下，將初始型CD4+T細(xì)胞與CD4+Treg細(xì)胞共培養(yǎng)，4)分別在候選化合物存在及不存在的條 件下，檢測(cè)初始型CD4+T細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，5)比較在候選化合物存在與否的條件下CD4+T細(xì) 胞的生長(zhǎng)速率，如果化合物存在的條件下CD4+T細(xì)胞的生長(zhǎng)速率比化合物不存在時(shí)要高， 說(shuō)明此化合物可以逆轉(zhuǎn)CD4+Treg免疫抑制功能，可以作為CD4+Treg的抑制劑。CD4+Treg 細(xì)胞表達(dá)CD25,GITR和FoxP3,釋放IL-10,可以抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。CD4+Treg細(xì)胞也可 對(duì)某種抗原有特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種篩選方法包括將CD4+T細(xì)胞與抗 原呈遞細(xì)胞（APCs)，如呈遞特異抗原的DCs共培養(yǎng)。⑶4+Treg細(xì)胞的生長(zhǎng)速率可以通過(guò)摻 入⑶4+T細(xì)胞的[3H]-胸苷來(lái)檢測(cè)。
[0017] 提供本發(fā)明所述的化合物或者藥物組合物，單獨(dú)使用或聯(lián)合其他治療劑，例如抗 原制劑或疫苗的方法治療所需病人（例如對(duì)于癌癥病人或患有感染性疾病的病人）。 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0018] 圖1.腫瘤反應(yīng)性⑶4+⑶25+T細(xì)胞系或克隆的產(chǎn)生和表征。（A)用流式細(xì)胞儀分析 ⑶4+⑶25+T細(xì)胞在患者初始型⑶4+T細(xì)胞或其TIL108中的情況。（B)自TIL108來(lái)源的細(xì) 胞中分析抗原特異性T細(xì)胞克隆。測(cè)試T細(xì)胞克隆對(duì)一系列腫瘤靶標(biāo)及表達(dá)HLA-DR1，DR4 或DR7 分子的 293T細(xì)胞的反應(yīng)。586mel，1363mel，1558melandl64mel表達(dá)HLA-DR1 分子， 而108meland1359mel分別為HLA-DR7和-DR4陽(yáng)性。T細(xì)胞釋放的GM-CSF通過(guò)ELISA檢 測(cè)。
[0019] 圖2.細(xì)胞因子表達(dá)譜及流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞的結(jié)果。（A)T細(xì)胞克隆的細(xì) 胞因子表達(dá)譜。（B)FACS分析T細(xì)胞克隆。用藻紅蛋白（PE)或FITC標(biāo)記的單克隆抗體靶 向⑶4,⑶25和GITR分子。同型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照。（C)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TIL108T 細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)水平。TIL1363-Th細(xì)胞作為對(duì)照。HPRP作為內(nèi)參。
[0020] 圖3.TIL108Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的功能特征。（A)TIL108CD4+Treg克隆的免 疫抑制活性。所有的TIL108Treg克隆抑制初始型⑶4+T細(xì)胞的增值，而⑶4+效應(yīng)1363-Th 細(xì)胞增強(qiáng)初始型CD4+T細(xì)胞的增值。（B)免疫抑制不依賴(lài)于細(xì)胞接觸機(jī)制。通過(guò)transwell 系統(tǒng)將初始型⑶4+T和Treg細(xì)胞克隆分開(kāi)