專利名稱：人重組蛋白pdcd5在治療自身免疫病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品以及免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及人重組蛋白ro⑶5在誘導(dǎo)⑶4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化、抑制Thl7細(xì)胞的分化，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-17A和TNF-α的產(chǎn)生，預(yù)防和/或治療自身免疫病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
PDCD5 (程序性細(xì)胞死亡分子5, programmed cell death 5),以前被稱為TFAR19 (TF-1 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 19, TF-Icell apoptosis-re lated gene 19),是一種新的程序性細(xì)胞死亡調(diào)控基因(中國(guó)專利98101869. 6 ;Biochem Biophy Res Comm, 1999,254 203-210)。該基因進(jìn)化保守，表達(dá)廣泛，其編碼的H)⑶5蛋白由125個(gè)氨基酸組成。前期的功能研究證明TOCD5在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，人重組蛋白TOCD5可以利用窖蛋白 (caveolae) / 脂筏介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞(J. Biol. Chem. 2006，281 =24803-24817)，加入外源性人重組H)⑶5蛋白，細(xì)胞內(nèi)吞后還可到達(dá)細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞的重組人H)⑶5能夠增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥的敏感性，促進(jìn)化療藥引起的腫瘤細(xì)胞的死亡(ChineseScience Bulletin,2009,54(21) :3981-3989 ；Biochem Biophys Res Commun,2010,96(2)224-230 ；中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010 ；18(2) :277-281 ；Apoptosis, 2010,15 :805-813)，是一種潛在的新的抑癌基因，其效應(yīng)機(jī)制是通過(guò)結(jié)合組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60(TatInteractive Protein 60kD, Tip60)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用(Neoplasia, 2009,10(4) :345-354)。Tip60是進(jìn)化上保守的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)Tip60能夠與F0XP3相互作用，促進(jìn)F0XP3的乙?；瑥亩閷?dǎo)F0XP3的轉(zhuǎn)錄抑制活性(Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(11) :4571-4576)。Foxp3分子是賦予調(diào)節(jié)T細(xì)胞細(xì)胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具特異性的標(biāo)志分子。F0XP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(F0XP3+Tregs)屬于T淋巴細(xì)胞中表達(dá)⑶4、⑶25及轉(zhuǎn)錄因子F0XP3的一類T細(xì)胞亞型，其正常功能對(duì)于人體免疫穩(wěn)態(tài)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)必不可少。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育及功能失調(diào)，與多種重大免疫相關(guān)性疾病，包括自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)、急性及慢性傳染性疾病、腫瘤免疫耐受、移植排斥以及過(guò)敏性疾病的生理病變進(jìn)程密切相關(guān)(Cell, 2008,133(5) :775-87, Cell, 2010,140 (6) :845-58)。F0XP3+Tregs 主要可分為兩類:自然性 F0XP3+Treg (natural Treg, nTre g)和誘導(dǎo)性 F0XP3+Treg (induced Treg, iTreg)。nTreg免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮與Foxp3分子的持續(xù)表達(dá)密切相關(guān)。這些胸腺產(chǎn)生的nTreg細(xì)胞釋放到外周后能夠保持Foxp3分子的穩(wěn)定表達(dá)，在特異性抗原的刺激下，此群細(xì)胞被激活，從而發(fā)揮免疫抑制作用。iTreg穩(wěn)定發(fā)揮免疫抑制作用也需要維持Foxp3分子的穩(wěn)定表達(dá)。Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用的機(jī)制包括分泌細(xì)胞因子(如IL-10，TGF-β，IL-35等)和細(xì)胞接觸抑制。多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一種以血腦屏障遭破壞,伴有炎癥、髓鞘損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性自身免疫性疾病。好發(fā)于青壯年，發(fā)病年齡多在20 40歲，女性多見(jiàn),具有高致殘率、高復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，部分患者病情呈進(jìn)行性加重,甚至死亡,對(duì)社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重的影響。數(shù)據(jù)顯示，在西方一些國(guó)家，該病患病率高達(dá)十萬(wàn)分之一百到三百；而在我國(guó)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，該病患病率也已達(dá)約十萬(wàn)分之五，并呈逐年上升趨勢(shì)。MS的病理學(xué)改變由于自身反應(yīng)性效應(yīng)CD4+T細(xì)胞透過(guò)血-腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中浸潤(rùn)，誘發(fā)組織損傷。自身反應(yīng)性效應(yīng)T細(xì)胞(Thl和Thl7)既存在于MS患者血液中，也存在于健康人群的血液中。調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Regulatory T cell, Treg)在控制自身抗原反應(yīng)性T細(xì)胞以及介導(dǎo)外周耐受過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。Treg與MS的免疫病理學(xué)改變相關(guān)，成為治療MS潛在的靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)是發(fā)生在動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，由CD4+T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的自身免疫性疾病，是目前被公認(rèn)為人類多發(fā)性硬化癥(MS)的理想動(dòng)物模型，EAE與MS在臨床、生化、免疫及病理等方面具有相同的特征，在研究MS的發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)防復(fù)發(fā)中具有重要意義。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種慢性反復(fù)發(fā)作的系統(tǒng)性的自身免疫性疾病。該病在世界范圍內(nèi)普遍存在，其病理機(jī)制目前還不清楚，許多研究已經(jīng)表明淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的異常細(xì)胞免疫、體液免疫，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部和全身的免疫功能紊亂，在RA的病理中起著重要作用。為了進(jìn)一步探討RA的病因、病理、免疫學(xué)、臨床等方面的機(jī)制，以便尋找更有效的治療RA的方案，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并建立了一些比較成熟的整體動(dòng)物病理模型，目前應(yīng)用較廣泛的且較成熟的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕蠭I型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Type II collageninduced arthritis, CIA)模型。這些動(dòng)物模型在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)改變和病理機(jī)制等方面與人RA有許多相似特征，目前國(guó)際上廣泛用于RA發(fā)病機(jī)制的研究以及創(chuàng)新藥物的研發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人重組H)⑶5蛋白在促進(jìn)⑶4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，免疫抑制中的應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組H)⑶5蛋白具有增強(qiáng)⑶4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的作用，可在制備增強(qiáng)⑶4+⑶25+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的藥物中應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組H)⑶5蛋白具有促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β產(chǎn)生的作用，可在制備促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β產(chǎn)生的的藥物中應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組ro⑶5蛋白具有抑制炎癥性Thl7細(xì)胞分化的作用，可在制備抑制炎癥性Thl7細(xì)胞分化的藥物中應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組H)⑶5蛋白具有抑制炎癥性細(xì)胞因子IL-17、IFN-Y和TMF-α產(chǎn)生的作用，可在制備抑制炎癥性細(xì)胞因子IL-17、IFN-Y和TMF-α產(chǎn)生的藥物中應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組TOCD5蛋白具有預(yù)防和治療多發(fā)性硬化癥和/或其他脫髓鞘疾病的藥物中的應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組ro⑶5蛋白具有預(yù)防和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。上述所說(shuō)的人重組ro⑶5蛋白在制備預(yù)防和治療自身免疫病的藥物中的應(yīng)用。
人重組ro⑶5蛋白可用于治療Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失調(diào)介導(dǎo)的自身免疫疾病EAE，人重組TOCD5蛋白在預(yù)防和治療上都是有效的。因此人重組H)CD5蛋白可用于治療的Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的實(shí)例包括多發(fā)性硬化癥和/或其他脫髓鞘疾病、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、橋本氏病、Grave’ s病、重癥肌無(wú)力等。發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究表明，髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(M0G35_55)成功誘導(dǎo)了小鼠EAE模型，腹腔注射人重組蛋白TOCD5能夠延緩EAE模型小鼠的發(fā)病，減輕病情；組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，人重組蛋白TOCD5處理能夠減少炎性細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)，減少脊髓的脫髓鞘病變；進(jìn)一步研究顯示人重組蛋白TOCD5在小鼠體內(nèi)能夠上調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-IO和TGF-β的產(chǎn)生，增加⑶4+⑶25+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，減少Thl7的數(shù)量，降低炎癥細(xì)胞因子IL-17、IFN-Y和TNF-α的產(chǎn)生。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，人重組蛋白H)⑶5處理的小鼠淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞對(duì)自身抗原M0G35_55的增殖能力顯著低于對(duì)照小鼠；人重組蛋白H)⑶5體外處理naive小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞，能夠促進(jìn)⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化。研究還發(fā)現(xiàn)，在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型中，腹腔注射人重組蛋白TOCD5 能夠減輕CIA模型大鼠的病情；進(jìn)一步研究顯示人重組蛋白TOCD5在大鼠體內(nèi)能夠增加⑶4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-17A和TNF-α的產(chǎn)生。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，人重組蛋白H)CD5處理的大鼠淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞對(duì)II型膠原的增殖能力顯著低于對(duì)照小鼠。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I顯示人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠臨床評(píng)分。圖2顯示人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠的發(fā)病率。圖3顯示人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠脊髓的H&E染色。圖4顯示人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠脊髓的luxol fastblue染色。圖5顯示ELISA方法檢測(cè)人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠血清的細(xì)胞因子水平。圖6顯示流式細(xì)胞術(shù)分析人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠淋巴結(jié)和脾細(xì)胞中⑶4+⑶25+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)目。圖7顯示流式細(xì)胞術(shù)分析人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中CD4+IL-17A+細(xì)胞的數(shù)目。圖8顯示[3H]摻入法檢測(cè)人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)mog35_55的反應(yīng)性。圖9顯示ELISA方法檢測(cè)人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞與mog35_55反應(yīng)的培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平。圖10顯示ELISA方法檢測(cè)人重組蛋白H)⑶5和陰性對(duì)照PBS處理的EAE小鼠脾細(xì)胞與mog35_55反應(yīng)的培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平。圖11顯示流式細(xì)胞術(shù)分析人重組蛋白ro⑶5對(duì)小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中⑶4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。圖12顯示人重組蛋白H)⑶5、卵白蛋白(OVA)處理的CIA大鼠以及生理鹽水對(duì)照大鼠的發(fā)病情況。A :人重組蛋白TOCD5組、OVA對(duì)照組和生理鹽水組大鼠的足跖腫脹程度；B :人重組蛋白H)⑶5組、OVA對(duì)照組和生理鹽水組大鼠的臨床評(píng)分；c:人重組蛋白ro⑶5組、OVA對(duì)照組和生理鹽水組大鼠的足部圖片。圖13顯示[3H]摻入法檢測(cè)人重組蛋白H)⑶5和OVA處理的CIA大鼠脾細(xì)胞和淋 巴結(jié)細(xì)胞對(duì)膠原的反應(yīng)性。圖14顯示ELISA方法檢測(cè)人重組蛋白H)⑶5、OVA處理的CIA大鼠以及生理鹽水對(duì)照大鼠的炎性細(xì)胞因子的水平。A :人重組蛋白TOCD5組、OVA對(duì)照組和生理鹽水組大鼠血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α的水平；Β :人重組蛋白H)⑶5組、OVA對(duì)照組和生理鹽水組大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-17A的水平。圖15顯示流式細(xì)胞術(shù)分析人重組蛋白H)⑶5和OVA處理的CIA大鼠大鼠的淋巴結(jié)、外周血以及脾細(xì)胞中⑶4+⑶25+FoXp3+細(xì)胞的數(shù)目。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I、人重組蛋白PD⑶5 (rhPD⑶5)作為蛋白重組藥物，可延緩EAE樽型小鼠的發(fā)病，減輕病情，減少發(fā)病率方法EAE模型的建立與臨床評(píng)分6-8周的雌性C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，SPF級(jí)飼養(yǎng)，所用墊木、飲水、飼料及其與動(dòng)物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作和流程都符合北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理制度。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每只小鼠給予用完全弗氏佐劑乳化的mog35_m抗原20(^1(1.511^/1111)背部皮下三點(diǎn)免疫，同時(shí)尾靜脈注射200μ Ulyg/ml)百日咳毒素(PT)，第2天，再次尾靜脈注射200 μ I PT。同時(shí)將小鼠隨機(jī)分成2組，每組8-10只小鼠。rhPDCD5 處理組第 0、2、4、6、8、10 天腹腔注射 200 μ g 的 rhPDCD5 ；陰性對(duì)照PBS組第0、2、4、6、8、10天腹腔注射200 μ L的PBS。第6天開(kāi)始觀察EAE臨床體征的嚴(yán)重性，給出臨床評(píng)分，觀察發(fā)病率。臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0分無(wú)癥狀；1分尾部無(wú)力；2分前肢或后肢中度癱瘓和運(yùn)動(dòng)失調(diào)；4分前肢或后肢嚴(yán)重癱瘓或運(yùn)動(dòng)失調(diào)，人為翻轉(zhuǎn)不能恢復(fù)；5分瀕死狀態(tài)或者死亡。結(jié)果如圖I所示，陰性對(duì)照PBS組小鼠在第9天開(kāi)始發(fā)病，癥狀呈進(jìn)行性加重；而在rhro⑶5處理組，小鼠在第12天發(fā)病，發(fā)病時(shí)間明顯延遲，癥狀減輕；同時(shí)如圖2所示，rhH)⑶5處理小鼠的發(fā)病率明顯低于PBS陰性對(duì)照組，因此，給小鼠施用rhH)⑶5能夠延緩小鼠誘發(fā)的EAE。實(shí)施例2、rhPDCD5作為蛋白重組藥物，能夠減少炎癥細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)，減少脊髓白質(zhì)脫髓鞘病變方法
I EAE模型的建立與臨床評(píng)分同見(jiàn)實(shí)施例I。2 :組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后打開(kāi)胸腔，PBS心臟灌注，用4%多聚甲醛灌注內(nèi)固定，再取出脊髓，放入裝有4%多聚甲醛的玻璃瓶中固定，再將標(biāo)本做脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、烘片。然后進(jìn)行H&E染色和勒克索爾固藍(lán)(Luxol Fast Blue)染色，封片進(jìn)行觀察。H&E染色結(jié)果如圖3所示，rhTO⑶5處理的小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)要比陰性對(duì)照PBS組輕；說(shuō)明施用rhH)CD5減少炎癥細(xì)胞在EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤(rùn)。Luxol Fast Blue染色如圖4所示，在rhH)⑶5處理組脊髓的白質(zhì)區(qū)致密，脫髓鞘現(xiàn)象很輕，而在PBS陰性對(duì)照組脊髓的白質(zhì)區(qū)脫髓鞘現(xiàn)象明顯。說(shuō)明施用rhro⑶5減少EAE小鼠的脊髓脫髓鞘反應(yīng)。 實(shí)施例3、rhPDCD5作為蛋白重組藥物，能夠減少EAE小鼠Thl7細(xì)胞的數(shù)目，減少血·清中炎癥細(xì)胞的水平；同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞0^4￥025午0#3)的分化，增加抑制性細(xì)胞因子的水平方法I EAE模型的建立與臨床評(píng)分同實(shí)施例I。2 =ELISA方法檢測(cè)血清中的細(xì)胞因子rhH)⑶5和PBS處理的EAE小鼠，行麻醉處死，收集血清，按照Biolegend公司的說(shuō)明書操作。3 :流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞亞群rhH)⑶5和PBS處理的EAE小鼠，行麻醉處死，分別摘取體內(nèi)淋巴結(jié)和脾臟，制成細(xì)胞懸液，加入合適濃度抗鼠CD16/32抗體，封閉免疫球蛋白Fe受體，4°C lOmin。1200rpm,離心洗一遍。細(xì)胞重懸100 μ I PBS,分別加入合適濃度的抗CD4和抗CD25表面熒光抗體，40C，避光孵育20min。PBS洗兩遍，加Iml Fix/Perm buffer重懸細(xì)胞，混勻，避光20min,離心，棄上清。用Iml perm buffer洗一遍。重懸Iml permbuffer,避光15min。離心,加100 μ I perm buffer,加入合適濃度抗IL-17A抗體或抗F0XP3抗體，避光30min。PBS洗兩遍。重懸于400 μ IPBS中，流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行分析。ELISA分析的結(jié)果如圖5所示，rhH)⑶5處理的EAE小鼠血清中炎性細(xì)胞因子如IL-17A和IFN- Y含量明顯低于PBS陰性處理組；同時(shí)，rhH)⑶5處理的EAE小鼠血清中抑制性細(xì)胞因子如IL-IO和TGF-β含量明顯高于PBS陰性處理組。說(shuō)明施用rhPD⑶5減少EAE小鼠炎癥細(xì)胞因子水平。流式細(xì)胞計(jì)的分析結(jié)果如圖6所示，rhH)⑶5處理的EAE小鼠淋巴結(jié)中⑶4+CD25+Poxp3+的細(xì)胞為26. 9%,PBS陰性處理組則為7. 4%，在小鼠脾細(xì)胞中，rhH)⑶5處理組⑶4+CD25+Poxp3+的細(xì)胞為14. 9%,PBS陰性處理組則為9. 1%。因此，rhH)⑶5處理小鼠外周免疫器官⑶4+⑶25+Ρ0χρ3+細(xì)胞數(shù)目顯著高于PBS陰性處理組；說(shuō)明施用rhH)⑶5能夠增加外周免疫器官⑶4+CD25+FOXp3+細(xì)胞的數(shù)目。另外如圖7所示，rhH)⑶5處理的EAE小鼠淋巴結(jié)中⑶4+IL-17A+的細(xì)胞為8. 5%, PBS陰性處理組則為14. 62%, rhPD⑶5處理小鼠Thl7細(xì)胞數(shù)目顯著低于PBS陰性處理組。說(shuō)明施用rhH)⑶5能夠減少外周免疫器官CD4+IL-17A+細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)施例4、rhPDCD5作為蛋白重組藥物，能夠抑制MOG-特異性脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞
增葙方法
I EAE模型的建立與臨床評(píng)分同實(shí)施例I。2 [3H-TdR]摻入法檢測(cè)細(xì)胞的增殖RhH)⑶5和PBS處理的EAE小鼠，行麻醉處死，分別摘取體內(nèi)淋巴結(jié)和脾臟，制成細(xì)胞懸液。將小鼠脾細(xì)胞或者淋巴結(jié)細(xì)胞重懸于10% FBS-RPMI 1640中，加200 μ I細(xì)胞懸液于96孔板中(每孔4 X IO5的細(xì)胞)，每個(gè)標(biāo)本三個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20 μ g/ml的M0G35_55。在含有5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40小時(shí)，在培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)40小時(shí)每孔加Λ IyCi 3H-甲基胸腺嘧啶([3H]-TdR)。培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)48h時(shí)，將細(xì)胞攝取的同位素轉(zhuǎn)移到玻璃纖維素膜。膜烘干后加入閃爍液，計(jì)數(shù)儀上讀取cpm值，檢測(cè)3H的摻入量。結(jié)果如圖8所示，rhH)⑶5處理的EAE小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)M0G35_55的反應(yīng)性明顯低于PBS陰性處理組，顯示[3H]-TdR摻入量的明顯降低，兩者有顯著性差異；同時(shí)，rhro⑶5處理的EAE小鼠脾細(xì)胞對(duì)M0G35_55的反應(yīng)性明顯低于PBS陰性處理組，兩者有顯著性差異。說(shuō)明施用rhH)⑶5能夠抑制M0G35_55特異的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
實(shí)施例5、rhPDCD5作為蛋白重組藥物，能夠促進(jìn)MOG^5特異性脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子，抑制MOG^5特異性脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子方法I EAE模型的建立與臨床評(píng)分同實(shí)施例I。2 =ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子RhH)⑶5和PBS處理的EAE小鼠，行麻醉處死，分別摘取體內(nèi)淋巴結(jié)和脾臟，制成細(xì)胞懸液。將小鼠脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞重懸于10% FBS-RPMI 1640中，加200 μ I細(xì)胞懸液于96孔板中(每孔4Χ IO5的細(xì)胞)，每個(gè)標(biāo)本三個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20 μ g/ml的M0G35_55。在含有5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí),收集細(xì)胞上清,Flow Cytomix(按照e Bioscience公司的說(shuō)明書操作)方法或ELISA(按照Biolegend公司的說(shuō)明書操作)方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子。結(jié)果如圖9所示，M0G35_55與淋巴結(jié)細(xì)胞一起培養(yǎng)的上清中，與PBS處理組相比較，Rhro⑶5處理組的細(xì)胞因子如IL-2、IL-17A以及IFN- Y的水平明顯下調(diào)，甚至檢測(cè)不到，而抑制性細(xì)胞因子IL-10明顯上調(diào)。說(shuō)明施用rhH)⑶5能夠抑制M0G35_55特異的淋巴結(jié)細(xì)胞分泌炎癥因子。在M0G35_55與脾細(xì)胞一起培養(yǎng)的上清中，與PBS處理組相比較，RhH)⑶5處理組的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-17A以及IFN-Y的水平明顯下調(diào)(圖10)，說(shuō)明施用rhH)⑶5能夠抑制M0G35_55特異的脾細(xì)胞分泌炎癥因子。實(shí)施例6、rhPD⑶5作為蛋白重組藥物，能夠促講小鼠⑶細(xì)胞的分化方法I :細(xì)胞培養(yǎng)用160 μ I的抗-CD3抗體(10 μ g/ml)包被48孔板，4°C過(guò)夜，用PBS洗兩遍；麻醉處死的6-8周雌性C57BL/6小鼠，摘取體內(nèi)淋巴結(jié)，制成細(xì)胞懸液(含10%FBS-RPMI 1640)，加500 μ I培養(yǎng)液于預(yù)先包被抗-⑶3抗體的48孔板，每孔為I X IO6的細(xì)胞，同時(shí)加入抗⑶28抗體(5 μ g/ml)、TGF-β (5ng/ml)、IL-2 (2ng/ml)以及加入不同濃度的rhH)⑶5蛋白，在含有5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞。2 :流式細(xì)胞分析收集不同處理的培養(yǎng)細(xì)胞，加入合適濃度的抗鼠⑶16/32抗體，封閉免疫球蛋白Fe受體，4°C lOmin。1200rpm，離心洗一遍。細(xì)胞重懸ΙΟΟμΙ PBS，分別加入合適濃度的抗⑶4和抗⑶25表面熒光抗體，40C，避光孵育20min。PBS洗兩遍，加ImlFix/Perm buffer重懸細(xì)胞，混勻，避光20min,棄上清。用Iml perm buffer洗一遍。重懸Iml permbuffer,避光15min,棄上清。加入合適濃度抗F0XP3抗體,避光30min。PBS洗兩遍。重懸于400μ1 PBS中，流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖11所示，rhH)⑶5后以濃度依賴的方式增加⑶4+CD25+FOXp3+細(xì)胞數(shù)目。說(shuō)明施用rhro⑶5能夠體外增加NaiVe淋巴結(jié)細(xì)胞分化為⑶4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)施例7、rhPDCD5作為蛋白重組藥物，可延緩CIA模型大鼠的發(fā)病，減輕病情。
方法CIA大鼠模型的建立與臨床評(píng)分6-8周的雌性SD大鼠,飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,SPF級(jí)飼養(yǎng),所用墊木、飲水、飼料及其與動(dòng)物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作和流程都符合北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理制度。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將膠原醋酸溶液與不完全佐劑4°C過(guò)夜充分溶解后I I均質(zhì)混合，于大鼠尾根部皮下注射O. 2ml/只，7天后避開(kāi)上次注射部位強(qiáng)化免疫一次。同時(shí)將大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只大鼠。CIA大鼠rhH)CD5處理組從模型制備當(dāng)天起，腹腔注射rhH)CD5 (14mg/kg)，隔日一次,第30天結(jié)束。ClA大鼠OVA無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照組從模型制備當(dāng)天起，腹腔注射卵白蛋白(OVA)(14mg/kg),隔日一次,第30天結(jié)束。陰性對(duì)照生理鹽水組從模型制備當(dāng)天起，腹腔注射生理鹽水，隔日一次，第30天結(jié)束。足跖腫脹度測(cè)量采用容積法測(cè)定大鼠膝關(guān)節(jié)容積。測(cè)量前于每只大鼠膝關(guān)節(jié)上
O.5cm作一標(biāo)記線，每次測(cè)定以標(biāo)記線為標(biāo)準(zhǔn)，每只大鼠每次測(cè)量3次取其平均值為當(dāng)前容積。在造模前I天測(cè)定雙側(cè)后足爪容積，以后每周對(duì)大鼠雙側(cè)足爪容積進(jìn)行測(cè)量，記錄容積值。腫脹程度用當(dāng)前容積減去造模前容積的差值表示。臨床評(píng)分按照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分辦法進(jìn)行評(píng)估病變程度多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評(píng)分如下O分，無(wú)腫脹；1分，I個(gè)趾關(guān)節(jié)受累；2分，多趾關(guān)節(jié)受累；3分，踝關(guān)節(jié)以下受累；4分全爪受累。造模I天后，隔日評(píng)分。結(jié)果如圖12A所示，陰性對(duì)照生理鹽水組大鼠不出現(xiàn)足跖腫脹，OVA無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照組大鼠的足跖腫脹明顯，而在rhH)CD5處理組，大鼠的足跖腫脹度明顯減輕，在第三和第四周，比較OVA無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照組和rhPDCD5處理組大鼠的足跖腫脹度，兩者有明顯的差異，*P
<O. 05。同時(shí)如圖12B所示，與OVA無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照組相比，rhH)⑶5處理組大鼠的臨床癥狀明顯減輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P < O. 05，#P < O. 01。圖12C是分別代表生理鹽水組、OVA無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照組和rhH)CD5處理組大鼠的足部照片。實(shí)施例8、rhPD⑶5作為蛋白重組藥物，能夠抑制膠原(collagen)特異件脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖方法I CIA大鼠模型的建立與臨床評(píng)分同實(shí)施例7。2 [3H-TdR]摻入法檢測(cè)細(xì)胞的增殖同實(shí)施例4。結(jié)果如圖13所示，在體外的培養(yǎng)體系中，rhH)⑶5處理的CIA大鼠淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)膠原的反應(yīng)性明顯低于OVA處理組，顯示[3H]-TdR摻入量的明顯降低，兩者有顯著性差異，*P
<O. 05 ;同時(shí)，rhH)⑶5處理的CIA大鼠脾細(xì)胞對(duì)膠原的反應(yīng)性明顯低于OVA處理組。說(shuō)明施用rhH)CD5能夠抑制膠原特異的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
實(shí)施例9、rhPDCD5作為蛋白重組藥物，能夠減少血■清和關(guān)節(jié)滑液中炎癥細(xì)胞的水平；同時(shí)增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CDfCDZSiF0xPSi)的數(shù)暈方法I CIA大鼠模型的建立與臨床評(píng)分同實(shí)施例7。2 =ELISA方法檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)液中的細(xì)胞因子rhH)⑶5和OVA處理的CIA大鼠，以及生理鹽水(空白)對(duì)照組大鼠，行麻醉處死，收集血清和關(guān)節(jié)液，按照Biolegend公司的說(shuō)明書操作。3 :流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞亞群rhH)⑶5和OVA處理的CIA大鼠，行麻醉處死，分別摘取體內(nèi)淋巴結(jié)和脾臟，制成細(xì)胞懸液，同時(shí)制備外周血淋巴細(xì)胞，加入合適濃度抗鼠CD16/32抗體，封閉免疫球蛋白Fe受體，4°C IOmin0 1200rpm，離心洗一遍。細(xì)胞重懸100 μ I PBS，分別加入合適濃度的抗⑶4和抗⑶25表面熒光抗體，4°C，避光孵育20min。PBS洗兩遍,加Iml Fix/Perm buffer重懸細(xì)胞，混勻，避光20min,離心，棄上清。用Iml perm buffer洗一遍。重懸Iml perm buffer,避光15min。離心，加100 μ lperm buffer,加入合適濃度抗F0XP3抗體，避光30min。PBS洗兩遍。重懸于400 μ I PBS中，流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行分析。ELISA分析的結(jié)果如圖14Α所示，rhH)⑶5處理的CIA大鼠血清以及關(guān)節(jié)滑液中TNF-α含量明顯低于OVA處理組，#P < O. 01，< O. 001 ;同時(shí)如圖14B所示，rhH)CD5處理的CIA大鼠血清以及關(guān)節(jié)滑液中IL-17A含量明顯低于OVA處理組，*P < O. 05，#P
<O. 01。說(shuō)明施用rhH)⑶5減少CIA大鼠炎癥細(xì)胞因子水平。流式細(xì)胞計(jì)的分析結(jié)果如圖15所示，rhH)⑶5處理的CIA大鼠淋巴結(jié)、外周血以及脾臟中⑶4+⑶25+Ρ0χρ3+的細(xì)胞均高于OVA處理組，說(shuō)明施用rhH)⑶5能夠增加外周免疫器官以及外周血中⑶4+⑶25+FoXp3+細(xì)胞的數(shù)目。
權(quán)利要求
1.人重組ro⑶5蛋白在制備增強(qiáng)⑶4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
2.人重組ro⑶5蛋白在制備促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-IO和TGF-P產(chǎn)生的藥物中的應(yīng)用。
3.人重組H)CD5蛋白在制備抑制炎癥性Thl7細(xì)胞分化的藥物中的應(yīng)用。
4.人重組ro⑶5蛋白在制備抑制炎癥性細(xì)胞因子IL-17、IFN-Y和TNF-a產(chǎn)生的藥物中的作用。
5.人重組TOCD5蛋白在制備預(yù)防和治療多發(fā)性硬化癥和/或其他脫髓鞘疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.人重組ro⑶5蛋白在制備預(yù)防和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
7.人重組蛋白ro⑶5在制備預(yù)防和治療自身免疫病的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述自身免疫病為遲發(fā)型超敏反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、橋本氏病、Grave’ s病或重癥肌無(wú)力。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人重組蛋白PDCD5在治療自身免疫病中的應(yīng)用。人重組蛋白PDCD5能夠誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化、抑制Th17細(xì)胞的分化、抑制炎癥細(xì)胞因子IL-17A和TNF-α的產(chǎn)生，具有免疫抑制作用。因此人重組蛋白PDCD5在誘導(dǎo)自身免疫抑制，應(yīng)用于治療自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化癥和/或其他脫髓鞘疾病、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、橋本氏病、Grave’s病、重癥肌無(wú)力等具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61P21/04GK102755633SQ20111020419
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者宋泉聲, 張穎妹, 肖娟, 許蘭俊, 許冬, 陳英玉, 馬大龍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)