合于在本發(fā)明的方法中使用的樣品
[0063] 本發(fā)明的方法利用提供關(guān)于進(jìn)行研究中的受試者中的miRNA生物標(biāo)志物的存在有 用的生物學(xué)信息的樣品。
[0064] i)組織樣品
[0065] 在合適的實(shí)施方案中，樣品可為組織樣品。僅僅舉例來(lái)說(shuō)，樣品可為活檢樣品諸如 腦活檢樣品。
[0066] 盡管收集組織樣品諸如活檢樣品一般比收集體液樣品（在下面討論)是更侵入性 的，其可能仍然代表許多臨床方面中常用的步驟。在運(yùn)種情況下，可適合地測(cè)定來(lái)自受試者 的組織樣品W確定在樣品中的感興趣的至少一種miRNA的量。
[0067] 可將W上討論的任何下調(diào)的miRNA用于在組織樣品上實(shí)踐的本發(fā)明的方法。
[0068] 盡管發(fā)明人相信在前段所提及的所有生物標(biāo)志物miRNA在樣品中被下調(diào)（與參考 值相比較)具有診斷效用，運(yùn)些標(biāo)記物中的某些顯示了在它們的豐度中特別地顯著的變化。 因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可設(shè)及比較選自由W下組成的組的至少一 種 miRNA 的水平與參考值：化日-11111?-141-39;化日-11111?-148日-39;化日-11111?-16-59;化日-1111尺-182-5p;Hsa-miR-18a-5p;Hsa-miR-200a-：3p;Hsa-miR-203a;Hsa-miR-31-5p;Hsa-miR-326 和化a-miR-425-5p，其中在樣品中所述至少一種miRNA的量與參考值比較的減少指示癌癥。
[0069] 發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了某些上面描述的上調(diào)的miRNA在腦癌細(xì)胞中是特別增加的，且如 此可在樣品為組織樣品的實(shí)施方案中具有顯著的診斷效用。相應(yīng)地，在此類(lèi)實(shí)施方案中，該 方法可設(shè)及測(cè)定組織樣品中選自由W下組成的組的至少一種miRNA的水平:hsa-miR-101-3p ;hsa-miR-29b-3p ;hsa-miR-328和hsa-miR-9-5p，其中在所述樣品中至少一種選定的 miRNA與參考值比較的增加的豐度指示癌癥的存在。
[0070] ii)體液樣品
[0071] 在可選的實(shí)施方案中，樣品是體液樣品。在合適的實(shí)施方案中，體液樣品選自由W 下組成的組:腦脊液(CS巧樣品；血液樣品和血清樣品。
[0072] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，在正常的情況下，很難獲得關(guān)于生物學(xué)過(guò)程諸如發(fā) 生在腦內(nèi)的癌癥的存在或進(jìn)展的詳細(xì)的信息。腦通過(guò)血腦屏障與機(jī)體的大部分分離，且在 煩骨內(nèi)被生理包圍和保護(hù)。已經(jīng)在本說(shuō)明書(shū)的其他地方討論了運(yùn)些考慮，W及運(yùn)些施加于 腦癌的診斷或監(jiān)測(cè)的困難。
[0073] 鑒于運(yùn)些已知的困難，應(yīng)該理解的是，體液樣品可代表能夠用于本發(fā)明的方法的 樣品的特別有用的實(shí)例，由于它們可能通常通過(guò)比趨向于為獲得腦組織樣品諸如活檢樣品 所必要的侵入性程序更少的侵入性程序而獲得。特別地，特別容易和安全地獲取樣品諸如 血清樣品，因?yàn)樗鼈儍H僅取自血液樣品。高度有利的和出人意料的是本發(fā)明的方法能夠使 用通常通過(guò)血腦屏障與腦分離的血清(作為血液的成分)提供信息，諸如腦中的癌癥的存在 或進(jìn)展。
[0074] 使用生物流體作為監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)的診斷和預(yù)后的手段是相對(duì)非侵入性的程序。它 規(guī)避了有風(fēng)險(xiǎn)的手術(shù)的需要并提供了明確的診斷因此消除了組織病理學(xué)切片的主觀的解 釋。
[0075] 對(duì)于手術(shù)是必要的個(gè)體，腫瘤組織的微RNA表達(dá)又為診斷、預(yù)后信息和對(duì)治療的響 應(yīng)的預(yù)測(cè)提供了改進(jìn)的準(zhǔn)確性。
[0076] 在其中樣品是體液諸如血清樣品的實(shí)施方案中，可通過(guò)選自由W下組成的組的至 少一種miRNA的豐度與參考值比較的增加來(lái)指示癌癥的存在：恥日-1日*-76-59;化日-1111尺-106b-5p;Hsa-miR-191-5p;Hsa-miR-24-：3p ;Hsa-miR-25-：3p ;Hsa-miR-320a;Hsa-miR-486-5p;Hsa-miR-451a;Hsa-miR-34a-5p和Hsa-miR-92a-3p。
[OOW]在樣品是血清樣品且受試者是男性的實(shí)施方案中，可通過(guò)選自由W下組成的組的 至少一種miRNA的豐度與參考值比較的增加來(lái)指示癌癥的存在邊3日-1日*-76-59記3日-1111尺-106b-5p;Hsa-miR-191-5p;Hsa-miR-24-：3p;Hsa-miR-25-：3p;Hsa-miR-320a 和 Hsa-miR-486-5p。
[0078] 在樣品是血清樣品且受試者是男性的優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上面提 及的miRNA標(biāo)志物的子集經(jīng)歷特別顯著的豐度的增加。相應(yīng)地，在如此的實(shí)施方案中，可通 過(guò)選自由W下組成的組的至少一種miRNA的豐度與參考值比較的增加來(lái)指示癌癥的存在： Hsa-miR-191-5p;Hsa-miR-486;Hsa-let-7b-5p 和 Hsa-miR-25-化。發(fā)明人認(rèn)為在本發(fā)明的 此類(lèi)實(shí)施方案中運(yùn)些標(biāo)志物具有特定的診斷價(jià)值。
[0079] 在樣品是血清樣品且受試者是女性的本發(fā)明的方法的實(shí)施方案中，可通過(guò)選自由 W下組成的組的至少一種miRNA的豐度與參考值比較的增加來(lái)指示癌癥的存在邊3日-1111尺-451a;Hsa-miR-486-5p;Hsa-miR-92a-3p和Hsa-miR-25-化。
[0080] 在使用來(lái)自女性受試者的血清樣品的本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過(guò) 與參考值比較選自由W下組成的組的至少一種miRNA的豐度的增加來(lái)指示癌癥的存在： Hsa-miR-486-5p和Hsa-miR-25-化。運(yùn)些miRNA代表患有腦癌的女性受試者的血清中被特別 地強(qiáng)烈地上調(diào)，且因此被認(rèn)為有顯著的診斷效用的生物標(biāo)志物。
[0081] 在樣品是血清樣品且受試者為年齡60歲或更大的本發(fā)明的方法的合適的實(shí)施方 案中，可通過(guò)化a-miR-34a-5p豐度與對(duì)照值的比較的增加來(lái)指示癌癥的存在。合適的對(duì)照 將是合適地年齡匹配的。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了化a-miR-34a是在患有腦癌的60歲或更大的受 試者的血清中上調(diào)的生物標(biāo)志物，且因此認(rèn)為化a-miR-34a-5p在來(lái)自該年齡的個(gè)體的血清 樣品中具有特別的診斷效用。
[0082] 。比絞'
[0083] 比較在樣品中的miRNA的量與在參考值的那些的步驟將一般地僅需要可用于確定 存在于樣品中的miRNA的豐度與參考值比較是增加或降低的足夠的信息。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，可獲得的信息可W足W允許鑒定miRNA的豐度與參考值比較的倍數(shù)-變化。
[0084] 樣品中miRNA的量與參考值之間的"不同"
[0085] 存在于樣品中的miRNA的量與參考值之間的不同可能為樣品中的miRNA的豐度與 參考值比較的相對(duì)增加，或樣品中的mi RNA豐度與參考值比較的相對(duì)減少。與不同的mi RNA 標(biāo)志物使用相關(guān)的"不同"的性質(zhì)(例如，如果與參考值比較增加或降低，特定標(biāo)志物是否具 有診斷效用)在本公開(kāi)內(nèi)容中其他地方討論。
[0086] 。參考值"
[0087] 本發(fā)明的方法利用存在于樣品中的感興趣的miRNA的量與合適的參考值之間的比 較。與參考值的該比較允許對(duì)所研究的miRNA的豐度與合適的對(duì)照比較是增加了或降低了 做出評(píng)價(jià)。
[0088] 應(yīng)該理解的是，在簡(jiǎn)單的實(shí)施方式中，參考值通過(guò)W與感興趣的樣品相同的方式 平行處理合適的對(duì)照樣品來(lái)確定。然而，并不必需是運(yùn)種情況，可W利用關(guān)于在合適的對(duì)照 樣品中感興趣的miRNA的水平的標(biāo)準(zhǔn)化的信息實(shí)踐本發(fā)明的方法。
[0089] 運(yùn)些感興趣的miRNA中的一些是分泌的，而其他不是分泌的。該區(qū)別允許參照可獲 得的樣品的類(lèi)型對(duì)待檢測(cè)miRNA亞-選擇。
[0090] 某些可在本發(fā)明的方法中利用的miRNA是分泌的的認(rèn)識(shí)還對(duì)選擇合適的參考值具 有顯著的影響。如果指示腦癌的miRNA被分泌到體液，那么必須從已知未患癌癥的受試者確 定合適的參考值，因?yàn)?，否則，即使從遠(yuǎn)離腦癌的位點(diǎn)采集的樣品中，也有來(lái)自未知癌癥的 至少一些污染可能會(huì)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
[0091] 相似地，在本發(fā)明的方法中有用的某些miRNA不是分泌的的認(rèn)識(shí)也對(duì)選擇合適的 樣品和參考值用于評(píng)價(jià)運(yùn)些miRNA的實(shí)施方案具有顯著的影響。與分泌的miRNA相比，運(yùn)些 非-分泌的miRNA不適合于在體液樣品中的評(píng)價(jià)?？蓮膩?lái)自非癌性組織樣品確定合適的參考 值?？蛇x地，可從來(lái)自已知為非癌性的培養(yǎng)的細(xì)胞確定合適的參考值。
[0092] 在其中樣品是組織樣品的實(shí)施方案中，可通過(guò)其中所研究的miRNA從樣品提取的 技術(shù)測(cè)定樣品中miRNA的存在與量。運(yùn)樣的方法可利用適用于其中樣品是體液樣品的方法 的許多分析技術(shù)。
[0093] 可選地，其中樣品是組織樣品的發(fā)明的方法可使用其中當(dāng)miRNA保持在原位時(shí)確 定miRNA的存在與含量的測(cè)定?？稍诖祟?lèi)實(shí)施方案中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一系列組 織學(xué)技術(shù)。僅僅舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)使用原位雜交的技術(shù)確定在組織樣品中miRNA的存在與位 置。不希望被任何假說(shuō)束縛，發(fā)明人相信至少一些上面所提及的miRNA可設(shè)及腫瘤發(fā)生，并 且因此確定它們的原位位置的能力可W有利地監(jiān)測(cè)腦癌的進(jìn)展。
[0094] 。測(cè)定"
[0095] 本發(fā)明的方法設(shè)及測(cè)定來(lái)自受試者的樣品W便確定在樣品中發(fā)現(xiàn)的選定的miRNA 的量。通常，用于檢測(cè)miRNA的測(cè)定可為本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道的適合于檢測(cè)核酸的任何種 類(lèi)(此類(lèi)測(cè)定允許簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)"有些量"或"沒(méi)有量"的所研究的miRNA存在），且優(yōu)選地可允 許定量選定的miRNA。
[0096] 本發(fā)明的測(cè)定方法可設(shè)及在患者樣品中天然存在的miRNA分子與非天然劑之間形 成復(fù)合物。非天然劑可包括部分或當(dāng)與來(lái)自患者樣品的miRNA絡(luò)合時(shí)允許它們的檢測(cè)的其 他合適的工具。在本發(fā)明的方法中測(cè)定miRNA可設(shè)及檢測(cè)在miRNA和非天然存在的劑諸如合 成的寡核巧酸、標(biāo)記的抗體等之間形成的運(yùn)些復(fù)合物。
[0097 ]在本發(fā)明的方法中使用的測(cè)定可直接地確定存在于樣品中的miRNA的量。例如，合 適的測(cè)定可設(shè)及僅僅標(biāo)記存在于樣品中的天然miRNA。
[0098] 可選地，本發(fā)明的方法中所使用的測(cè)定可間接地確定存在于樣品中的miRNA的量。 運(yùn)意味著可使用如下測(cè)定:其中產(chǎn)生miRNA的代替物(proxy )，且確定該產(chǎn)生的代替物的量， 由此允許間接地定量miRNA。
[0099] 舉例來(lái)說(shuō)，在合適的實(shí)施方案中，用于確定miRNA的存在的測(cè)定可包括擴(kuò)增步驟， 其中患者樣品中的miRNA被用作模板用于生成人工核酸分子，且評(píng)價(jià)存在的人工核酸分子 的存在與量，因此允許確定存在于樣品中的至少一種miRNA的量。
[0100] 本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將知道使用此類(lèi)擴(kuò)增步驟的測(cè)定的合適的實(shí)例。在合適的 實(shí)施方案中，擴(kuò)增步驟利用了定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)。應(yīng)該理解的是包括 上面所提及的qRT-PCR的實(shí)例的許多此類(lèi)技術(shù)將引起產(chǎn)生互補(bǔ)DNA(cDNA)分子--在自然 中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的人工核酸分子。作為測(cè)定的一部分可將此類(lèi)人工核酸序列與天然存在的序列 分離。
[0101] 。腦癌"
[0102] 發(fā)明人相信本發(fā)明的方法適用于多種多樣腦癌。僅僅舉例來(lái)說(shuō)，與本發(fā)明的方法 結(jié)合所提及的腦癌選自由由w下組成的組：神經(jīng)膠質(zhì)瘤;腦膜瘤;垂體腺瘤和神經(jīng)銷(xiāo)瘤。如 可從本文描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的考慮所理解的，在特別地合適的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可 為所提及的腦癌是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方法。
[0103] 現(xiàn)在將參照下面的試驗(yàn)結(jié)果和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中：
[0104] 圖1是用于提取用于生成試驗(yàn)結(jié)果的miRNA的離屯、柱（spin colimn)方法的示意 圖。
[0105] 圖2示出了在U87MG和SVGpl2細(xì)胞中的miRNA表達(dá)的比較所實(shí)現(xiàn)的結(jié)果。圖2幅A示 出了U87MG細(xì)胞的MiRNA表達(dá)，其中與SVGpl2細(xì)胞比較，26種miRNA是下調(diào)的。圖2幅B示出了 10種下調(diào)最多的miRNA(藍(lán)色的較重輪廓的圈）。圖2幅C示出了化a-miR-101-3p、hsa-miR-29b-化、hsa-miR-328 和 hsa-miR-9-5p 的倍數(shù)變化，與 SVGpl2( 用來(lái)提供參考值的非癌性細(xì) 胞，用于本發(fā)明的方法的目的）比較其全部是上調(diào)的。
[0106] 圖3示出了通過(guò)來(lái)自男性和女性受試者的血清樣品中的miRNA表達(dá)的比較所實(shí)現(xiàn) 的結(jié)果。圖3幅A圖解了四種微RNA顯示了在男性血清中表達(dá)與對(duì)照血清比較的4-倍增加(上 部對(duì)角線上方的紅圈）。展示出最高表達(dá)水平的兩種miRNA在男性和女性之間是共同的： miR-486-5p和25-3P。圖3幅B示出了屯種miRNA在男性血清中與對(duì)照比較是上調(diào)的。女性血 清展示了 11種miRNA的增加。幅C比較了來(lái)自女性受試者的血清樣品（癌癥和對(duì)照）中的 miRNA表達(dá)。在女性血清中MiR-451、486-5p、92a-化和25-化顯示了最高的表達(dá)。<