用于評(píng)價(jià)包含微生物的組合物對(duì)腸道微生物群的作用的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于評(píng)價(jià)包含微生物的組合物對(duì)腸道微生物群的作用的方法
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于確定包含微生物(尤其是細(xì)菌）的組合物的益生/副益生活性的方 法，所述方法基于評(píng)價(jià)在攝取所述組合物之后，糞便微生物群中的定性和/或定量變化。此 夕h本發(fā)明設(shè)及用于進(jìn)行所述方法的試劑盒。
[0002] 胃腸道包含多種微生物群體，其在每個(gè)個(gè)體的發(fā)育過(guò)程中發(fā)展并增殖，形成所謂 腸道微生物群或腸道菌群。
[0003] 因此，腸道微生物群是一個(gè)高度復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其由不同微生物群體之間的平 衡調(diào)節(jié)而成，或所謂生態(tài)平衡是確保身體健康的基礎(chǔ)，因?yàn)槲⑸锶簳?huì)顯著地調(diào)節(jié)宿主個(gè) 體的腸道粘膜的發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
[0004] 換言之，所述腸道微生物群相當(dāng)于一個(gè)真實(shí)的器官。事實(shí)上，個(gè)體的腸道微生物群 的定性和/或定量變化，或所謂失調(diào)或微生物失調(diào)（扣3111；[(31'013131]1)，會(huì)導(dǎo)致喪失腸道內(nèi)穩(wěn) 態(tài)，由此會(huì)決定廣譜病理學(xué)的發(fā)病機(jī)理。
[0005] 為了處理腸道失調(diào)狀況，或者在任何情況下，為了維持腸道微生物群的平衡，攝取 益生/副益生產(chǎn)品的實(shí)踐愈發(fā)地普遍。
[0006] 按照FA0/WH0的定義，益生劑是一組"活的微生物，當(dāng)W適當(dāng)?shù)牧拷o予運(yùn)些微生物 時(shí)，能為宿主提供健康益處"。
[0007] 根據(jù)上述定義，與方法的開(kāi)發(fā)相關(guān)的益處使其能夠快速且可靠地評(píng)價(jià)包含微生物 的外生組合物/制劑對(duì)個(gè)體的腸道微生物群的細(xì)菌組成的相當(dāng)明顯的影響。
[000引事實(shí)上，基于采用該方法檢測(cè)的作用，即基于攝入包含微生物的組合物將如何定 量地和/或定性地改變腸道微生物群，能夠建立所述組合物是否能夠有利于和/或確保人體 健康，W及因此，其是否能夠滿足被鑒定為益生/副益生劑的基礎(chǔ)資格條件之一。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)如下方式來(lái)滿足上述要求:提供通過(guò)分子分析來(lái)確定在按照隨機(jī)、雙 盲、安慰劑-對(duì)照交叉方案攝入了包含微生物(優(yōu)選細(xì)菌)的組合物之后，個(gè)體的糞便微生物 群的組成的定性和/或定量變化的方法。
[0010] 事實(shí)上，申請(qǐng)人已通過(guò)實(shí)驗(yàn)第一次證明，進(jìn)行，尤其是對(duì)健康群體進(jìn)行交叉干預(yù)研 究方案，W防止顯著個(gè)體間變異性會(huì)隱藏處理(具體而言，采用益生/副益生劑的粗粒)的可 能作用，或防止顯著的個(gè)體間變異性導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)假陽(yáng)性。
[0011] 本發(fā)明方法，除了特別有利于確定包含微生物（即假定的益生/副益生劑）的一般 組合物對(duì)糞便微生物群的作用之外，還有利于確定已知益生/副益生劑對(duì)人體的促健康作 用，或用于確定已知益生/副益生劑的任何新的、特定的作用，例如，通過(guò)研究在攝取所述組 合物之后刺激和/或抑制了哪些微生物群體的生長(zhǎng)。事實(shí)上，基于在攝取所述組合物之后， 所設(shè)及的其生長(zhǎng)被刺激和/或被抑制的微生物群體的主要活性，能夠確定所述組合物的可 能的新作用。例如，如果，在攝取了本發(fā)明方法的益生劑之后，發(fā)現(xiàn)特定的細(xì)菌群W定量方 式生長(zhǎng)，并且該細(xì)菌群的代謝主要設(shè)及例如下酸的生成，則可推定，能夠通過(guò)接受所述益生 劑來(lái)增加腸道中下酸的量。
[0012] 本發(fā)明方法的其它益處將根據(jù)下文的詳細(xì)描述和實(shí)施例而更為顯見(jiàn)，然而，其僅 僅起說(shuō)明而非限制作用。
[0013] 為了能夠更好地理解詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明附有圖1-4:
[0014] -圖1顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，其評(píng)價(jià)用本發(fā)明組合物處理之前和之后(A)糞球菌 (Coprococcus)屬的細(xì)菌群的增加（圖1.1)和布勞特氏菌（Blautia)屬細(xì)菌群的減少（圖 1.2)，W及同時(shí)用安慰劑處理之前和之后(B)糞球菌屬的細(xì)菌群的減少（圖1.1)和布勞特氏 菌屬的細(xì)菌群的增加(圖1.2);
[0015] -圖2.1顯示，在用本發(fā)明組合物處理之前和之后，糞球菌屬的細(xì)菌群的增加（深 灰)和布勞特氏菌屬的細(xì)菌群的減少(淺灰）；
[0016] -圖2.2顯示，用本發(fā)明組合物處理之前和之后(A)，糞球菌屬的細(xì)菌群的百分比增 加（深灰）和布勞特氏菌屬的細(xì)菌群的百分比減少（淺灰），W及用安慰劑處理之前和之后 (B)，糞球菌屬的細(xì)菌群的百分比減少（深灰）和布勞特氏菌屬的細(xì)菌群的百分比增加（淺 灰)；
[0017] -圖3顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，其用于建立，用本發(fā)明組合物處理之前和之后煙酸 代謝的增加，和用安慰劑處理之前和之后煙酸代謝的減少;和
[0018] -圖4顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，其用于建立，在用本發(fā)明組合物處理之前和之后葉 酸的生物合成的增加，和相反地用安慰劑處理之前和之后沒(méi)有任何變化。
[0019] 本發(fā)明的第一方面設(shè)及確定糞便微生物群的組成變化的方法，所述糞便微生物群 為個(gè)體按照隨機(jī)、雙盲、安慰劑-對(duì)照的交叉方案攝入包含微生物的組合物/制劑之后的的 糞便微生物群，所述方法包括如下步驟：
[0020] a)在按照隨機(jī)、雙盲、安慰劑-對(duì)照的交叉方案接受所述組合物或安慰劑之前和/ 或期間和/或之后，收集關(guān)于所述個(gè)體的健康狀況和/或飲食習(xí)慣的信息；
[0021] b)獲得在按照隨機(jī)、雙盲、安慰劑-對(duì)照的交叉方案攝入所述組合物或安慰劑之前 和/或期間和/或之后，來(lái)自所述個(gè)體的至少一個(gè)糞便樣品；
[0022] C)通過(guò)對(duì)步驟b)的糞便樣品進(jìn)行的宏基因組學(xué)分析來(lái)分析所述微生物群；
[0023] d)比較按照隨機(jī)、雙盲、安慰劑-對(duì)照的交叉方案攝入所述組合物或安慰劑之前 和/或期間和/或之后的所述個(gè)體的糞便微生物群，優(yōu)選定性地和/或定量地比較。
[0024] 在本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，術(shù)語(yǔ)糞便微生物群指的是存在于個(gè)體糞便中的整個(gè)微生物群 體，并且其反映所述個(gè)體的腸中存在的整個(gè)微生物群體。因此，術(shù)語(yǔ)糞便微生物群在本文中 指的是腸道微生物群的同義詞。具體而言，包括在本發(fā)明組合物中的微生物是單獨(dú)或組合 形式的細(xì)菌和/或酵母和/或其它微生物。
[0025] 包含細(xì)菌的組合物特別優(yōu)選用于本發(fā)明目的。具體而言，所述細(xì)菌屬于選自下組 的屬：乳桿菌(Xactobacillus)、雙歧桿菌（Bifidobacterium)、芽抱桿菌（Bacillus)、丙酸 桿菌（Prop ion ibac ter ium)、鏈球菌（Strep toco ecus)、乳球菌化 ac toco ecus)、氣球菌 (Aerococcus)和腸球菌化nterococcus)。更優(yōu)選地，所述細(xì)菌屬于乳桿菌和/或雙歧桿菌 屬。
[00%] 具體而言，所述乳桿菌選自：副干酪乳桿菌化actobacillus paracasei)、嗜酸乳 桿菌(Xactobacillus acido地ilus)、解淀粉類(lèi)乳桿菌（Lactobacillus amylol}ft;ixus)、嗜 淀粉乳桿菌化actobacillus amylovorus)、食品乳桿菌(Xactobacillus alimentarius)、 鳥(niǎo)乳桿菌化actobacillus aviaries)、短乳桿菌化actobacillus brevis)、布氏乳桿菌 化actobaci llus buchneri )、干酪乳桿菌化actobacil lus casei )、纖維二糖乳桿菌 (Lactobacillus cellobiosus)、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis)、卷曲乳桿菌 化actobacillus crispatus)、彎曲乳桿菌化actobacillus curvatus)、德氏乳桿菌 化actobacillus delbrueckii)、香腸乳桿菌化actobacillus farciminis)、發(fā)酵乳桿菌 化act obacillus fermen turn)、雞乳桿菌化act obacillus gall inarum)、加氏乳桿菌 化過(guò)(3古0^3(3；!_11113卽3 361'；〇、瑞壬乳桿菌化3(3古0^3(3；!_11113 1161￥6古；!_(3113)、希氏乳桿菌 化actobacillus hilgardii)、約氏乳桿菌化actobacillus johnsonii)、馬乳樣乳桿菌 (Lactobacillus kef iranofaciens)、開(kāi)菲爾乳桿菌（Lactobacillus kef iiO、粘膜乳桿菌 化actobacillus mucosae)、面包乳桿菌化actobacillus panis)、丘狀乳桿菌 (Xactobacillus col lino ides)、類(lèi)植物乳桿菌(Xactobacillus paraplantarum)、戊糖乳 桿菌化actobacillus pentosus)、植物乳桿菌化actobacillus plantarum)、蓬蒂乳桿菌 化actobaci llus pontis)、羅伊氏乳桿菌化actobaci llus reuteri )、贏李糖乳桿菌 化actobacillus rhamnosus )、清酒乳桿菌化actobaci 1 lus sake i )、唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)和舊金山季L桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis) 〇
[0027] 對(duì)于本發(fā)明的目的特別優(yōu)選的是屬于副干酷乳桿菌物種的細(xì)菌，更優(yōu)選副干酷乳 桿園DG園株。
[0028] 細(xì)菌菌株副干酷乳桿菌DG由S0FAR S.P.A.于05/05/1995在己黎的己斯德研究所 的國(guó)家微生物保藏中屯、(CNCM)保藏，保藏號(hào)為CNCM 1-1572。所述菌株的最初命名是干酷乳 桿菌DG干酷菌種（Lactobacillus casei DG sub.casei)。
[0029]具體而言，雙歧桿菌屬的細(xì)菌選自：青春雙岐桿菌（BWidobacterium adolescentis)、動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis)、兩岐雙岐桿菌 (Bif idobacterium bif idum)、短雙岐桿菌（Bif idobacterium breve)和長(zhǎng)雙歧桿菌 (Bifidobacterium longum)〇<