人參內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及人參內(nèi)生真菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參（PanaxginsengC.A.Mey.)是五加科植物人參屬植物，其干燥根和根莖同名 入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。是我國常用傳統(tǒng)中藥。味甘、微苦，性微溫。歸肺、 脾、心、腎經(jīng)，具有大補元氣，補脾益肺，生津止渴，安神益智等功效?，F(xiàn)代臨床主要用于治療 心氣虛證、冠心病、心律失常等疾病，是應(yīng)用最廣泛、研究最深入的中藥之一，主要分布在我 國遼寧東部、吉林東半部和黑龍江東部?，F(xiàn)代研究表明，人參含有人參皂苷、氨基酸及揮發(fā) 油等成分，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng) 有廣泛的作用，能增強機體對有害刺激的抵抗力。其有效成分主要是人參皂苷，可分為三 類：一是五環(huán)三萜類的齊墩果烷型皂苷一一人參皂苷R〇 ;二是原人參二醇型的四環(huán)三萜類 達瑪烷型皂苷--人參皂苷Rh2、Rg3、Rb1、Rb、Rc;原人參三醇型的四環(huán)三萜類達瑪烷型皂 苷一一Re、Rf、Rgl。雖然人參資源區(qū)域廣闊，且已進行大量的人工栽培；但是其分布星散， 資源更新周期長，且人工栽培技術(shù)要求高，藥材質(zhì)量參差各異。隨著人參皂苷眾多藥理活性 的發(fā)現(xiàn)，其市場需求增大，通過直接采收人參天然和人工資源將不能滿足市場需求。另一 方面，人參皂苷類成分化學(xué)合成困難，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。研究者們試圖通過生物技術(shù)方法獲 得，因此，近年來這已成為人們關(guān)注的課題。
[0003] 中國專利CN201010571874. 4,發(fā)明名稱為"人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌及利用其制備 人參皂苷Rd的方法"，公開號為CN102080048A，公開了一種人參內(nèi)生灰綠犁頭霉菌（CGMCC No. 4316)，該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rbl制備Rd的能力。中國專利CN201010572006. 8， 發(fā)明名稱為"人參內(nèi)生莫勒接霉菌及利用其制備人參皂苷Rd的方法"，公開號為 〇附020800494，公開了一種人參內(nèi)生莫勒接霉菌化610：如.4315)，該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參 皂苷Rbl制備Rd的能力。
[0004] 可見，從人參中尋找到新的內(nèi)生真菌，特別是能夠提高宿主人參中的人參皂苷類 成分含量的內(nèi)生真菌，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員不懈的追求。
[0005] 另外，目前尚未見文獻報道從人參中分離到普通裂褶菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的人參內(nèi)生真菌，并且提供其用途，即能夠提高人 參毛狀根生物量及阜苷類成分Rc、Rg2成分的含量。
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供一種人參內(nèi)生真菌，命名為普通裂褶菌 3R_2(Schizophyllumcommune)。
[0008] 所述的人參內(nèi)生真菌，是從五加科人參屬植物人參（PanaxginsengC.A.Mey.) 植物活體中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為普通裂褶菌 (Schizophyllumcommune)。該菌株已保藏，保藏號為CGMCCNo. 11009,保藏日期為2015年 7月14日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。
[0009] 本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真菌的固體培養(yǎng)特征為：
[0010] 在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長快，25°C黑暗條件下7天菌落75-80mm，白色，絮 狀，氣生菌絲茂盛；背面淺褐色，無水溶性色素。
[0011] 本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真菌顯微特征為：
[0012] 營養(yǎng)菌絲壁光滑或稍粗糙，分隔稀疏，分枝少，寬2. 5-7. 0μπι;菌絲體中間可見短 突起，鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象較少見。未見任何類型孢子。
[0013] 本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真菌的rRNA基因序列測定結(jié)果，包括18SrRNA片段， ITS1、5. 8SrRNA、ITS2的全序列及28S區(qū)序列片斷如SEQIDNO. 1所示。將測序結(jié)果（SEQ IDNO. 1)于NCBI網(wǎng)站進行序列比對（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同普 通裂裙菌（Schizophyllumcommune)JN088243 的相似性為 100%。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了上述的人參內(nèi)生真菌在制備提高人參毛狀根生物量試 劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供了一種提高人參毛狀根生物量的方法，是將本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真 菌與人參毛狀根的共培養(yǎng)。
[0017] 所述的培養(yǎng)方法為懸浮培養(yǎng)，將植物組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng) 過程中不斷進行旋轉(zhuǎn)震蕩，用135r/min的速度進行；
[0018]培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基（KH2P04:85mg/L，CaCl2:166·lmg/L，ΚΝ0 3:950mg/L，NH4N03: 825mg/L，MgS04:90 . 35mg/L，乙二胺四乙酸二鈉：18. 63mg/L，F(xiàn)eS04 · 7H20 :13. 9mg/L， MnS04 ·Η20 :8. 45mg/L，ZnS04 · 7H20 :4. 3mg/L，硼酸：3.lmg/L，鉬酸：0· 125mg/L，CuS04 · 5H20 : 0· 0125mg/L，CoCl2 · 6H20 :0· 0125mg/L，KI:0· 415mg/L，硫胺素維生素B1 :0· 05mg/L，維生素 B6 :0.25mg/L，煙酸：0.25mg/L，肌醇：50mg/L，蔗糖：30000mg/L，pH(25°C) :6·0)，12Γ(：滅 菌15分鐘后自然冷卻待用。
[0019]培養(yǎng)溫度：25±2°C。
[0020] 培養(yǎng)時間：20-50天不等。
[0021] 搖床轉(zhuǎn)速：135rpm。
[0022] 培養(yǎng)特征：人參毛狀根聚成團向四周生長。
[0023] 進一步地，本發(fā)明提供了上述的人參內(nèi)生真菌在提高人參中人參皂苷Rc和Rgz# 量中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真菌，可提高人參毛狀根生物量和人參皂苷Rc含量，并可 顯著提高人參皂苷1^2的產(chǎn)量。
[0025] 人參皂苷Rc，別名：人參三醇，英文名：GinsenosideRc，分子式：C53H9Q022,CAS: 11021-14-0,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0026]
[0027]人參皂苷Rg2,英文名：GinsenosideRg2,分子式：C42H72013,CAS:52286-74-5,化學(xué) 結(jié)構(gòu)式如下：
[0028]
[0029] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種提高人參中人參皂苷Rc和Rg2含量的方法，所述 的方法將本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真菌與人參毛狀根進行共培養(yǎng)，包括以下步驟：
[0030] (A)取本發(fā)明的人參內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入 已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28°C活化培養(yǎng)72小時；
[0031] (B)人參毛狀根正常培養(yǎng)20-50天以上（較優(yōu)為30天以上）
[0032] 培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基（KH2P04:85mg/L，CaCl2:166.lmg/L，KNO3:950mg/L，NH4N03: 825mg/L，MgS04:90 . 35mg/L，乙二胺四乙酸二鈉：18. 63mg/L，F(xiàn)eS04 · 7H20 :13. 9mg/L， MnS04 ·Η20 :8. 45mg/L，ZnS04 · 7H20 :4. 3mg/L，硼酸：3.lmg/L，鉬酸：0· 125mg/L，CuS04 · 5H20 : 0· 0125mg/L，CoCl2 · 6H20 :0· 0125mg/L，KI:0· 415mg/L，硫胺素維生素B1 :0· 05mg/L，維生素 B6 :0.25mg/L，煙酸：0.25mg/L，肌醇：50mg/L，蔗糖：30000mg/L，pH(25°C) :6·0)，12Γ(：滅 菌15分鐘后自然冷卻待用。
[0033]培養(yǎng)溫度：25±2°C。
[0034] 培養(yǎng)時間：20-50天不等。
[0035]搖床轉(zhuǎn)速：135rpm;
[0036] (C)將步驟A活化的人參內(nèi)生真菌接入步驟B的人參毛狀根的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 15天以上（較優(yōu)為18-20天后收獲）；所述的接入具體為高溫滅菌的接種環(huán)在PDA上挑取 本發(fā)明的人參內(nèi)生真菌菌種約10yL;
[0037] (D)用回流提取及固液分離等方法從人參毛狀根中分離提純得到人參皂苷Rc和 I?g2〇
[0038] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0039] 本發(fā)明所述的人參內(nèi)生真菌，可提高人參毛狀根生物量和人參皂苷Rc含量，并可 顯著提高人參皂苷Rg2的產(chǎn)量。
[0040] 生物材料樣品的保藏信息：
[0041] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0042] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0043] 保藏日期：2015年7月14日
[0044] 保藏編號：CGMCCNo. 11009
[0045] 分類命名：普通裂裙菌 3R-2(Schizophyllumcommune) 〇
【附圖說明】
[0046] 圖1 :本發(fā)明所述人參內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基上的形態(tài)圖（A為菌落正面，B為 菌落背面）及顯微圖（C)。
[0047] 圖2 :本發(fā)明所述人參毛狀根液體懸浮形態(tài)，其中A為毛狀根整體形態(tài)，B為毛狀根 側(cè)面形態(tài)。
[0048] 圖3 :本發(fā)明所述人參內(nèi)生真菌菌絲作用于人參毛狀根21天后人參鮮重增量（A)、 人參皂苷Rg2的含量（B)及人參Rc的含量（