一種克百威羧基化半抗原的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種克百威羧基化半抗原的制備方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 克百威（0&4〇扣抑11，041〇，化學(xué)名為2,3-二氫-2,2-二甲基-7-苯并呋喃 基-N-甲基氨基甲酸酯，商品名為呋喃丹，是廣譜性殺蟲、殺線蟲劑，具有觸殺和胃毒作用。 克百威屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥，與膽堿酯酶不可逆結(jié)合，使得乙酰膽堿不能分解而蓄積在 體內(nèi)，影響神經(jīng)中樞傳導(dǎo)，具有神經(jīng)毒性?？税偻谒嵝酝寥乐胁灰捉到鈿埩羝陂L，可以被 植物根部吸收并輸送到植物體的各器官，也可能通過徑流滲透污染地下水源，給食品安全 和環(huán)境帶來潛在威脅。目前，雖然克百威已經(jīng)禁用于蔬菜，但仍由不少違法使用現(xiàn)象，導(dǎo)致 克百威在果蔬中時(shí)有檢出。因此，在加強(qiáng)克百威使用監(jiān)管力度的同時(shí)，加強(qiáng)克百威農(nóng)藥殘留 的檢測十分必要。
[0003] 目前克百威的檢測多采用儀器分析法，需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，對(duì) 檢材要求較高，樣品前處理和提純過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿足現(xiàn)代檢測對(duì)方便、快速、準(zhǔn)確的 要求。酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金試紙條法操作簡便，對(duì)樣本要求不高，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測 的要求?？税偻旧聿缓锌膳悸?lián)的功能基團(tuán)，需要進(jìn)行半抗原從頭合成，目前國內(nèi)外克百 威半抗原合成中普遍采用傳統(tǒng)的三光氣合成工藝，由于大量光氣和甲苯的使用，極易危害 健康，造成環(huán)境污染。因此，本發(fā)明以呋喃酚為原料，設(shè)計(jì)一種新的克百威半抗原合成方法， 并制備了完全抗原，為建立克百威免疫檢測技術(shù)提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)目前克百威半抗原三光氣傳統(tǒng)合成方法的危害性，提供了一種新的克 百威羧基化半抗原合成方法，制備得到的半抗原和人工抗原可用于克百威免疫分析方法研 究。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：以克百威的水解產(chǎn)物呋喃酚為原料，首先與二(對(duì)硝基苯）碳 酸酯和4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽反應(yīng)生成中間體，再和三氟醋酸反應(yīng)，合成克百威羧基化半 抗原；然后利用改良活性酯法將半抗原和載體蛋白上偶聯(lián)，制備克百威人工抗原。其中半抗 原合成路線為
[0006] 工藝步驟如下。
[0007] 1.克百威半抗原的合成。
[0008] (1)將四口燒瓶置于磁力攪拌器上，配置溫度計(jì)。取一定量的呋喃酚溶于50mL二 氯甲烷（DCM)中，冰浴下加入三乙胺（Et3N)，攪拌10分鐘后，將二(對(duì)硝基苯）碳酸酯溶于 15mL二氯甲烷中，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，控制反應(yīng)摩爾比為呋喃酚：三乙胺：二(對(duì) 硝基苯)碳酸酯=1:1. 1:1 ;逐漸升溫至30°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)，TLC板監(jiān)控反應(yīng)完成(展 開劑：石油醚：乙酸乙酯=10:1)。
[0009] (2)稱取一定量經(jīng)三乙胺堿化的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽(與呋喃酚摩爾比為 1:1)，溶于10mL二氯甲烷中，在冰浴條件下加入到上述反應(yīng)液中，將溫度升到室溫并繼續(xù) 攪拌過夜；依次用50mL水和50mL飽和食鹽水各洗滌2次；用無水硫酸鈉干燥后，過濾除去 干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原中間體，洗脫劑為石 油醚：乙酸乙酯，體積比為10:1，收率為58%。
[0010] (3)將步驟2得到的半抗原中間體溶于15mL 1，4-二氧六環(huán)中，加入18mL三氟醋 酸（TFA)和15mL水，60°C加熱反應(yīng)4小時(shí)后泠卻至室溫；用30mL乙酸乙酯萃取2次，合并 有機(jī)相后依次用30mL水，飽和碳酸氫鈉，水，飽和食鹽水各洗滌2次；用無水硫酸鈉干燥后， 過濾除去干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原，洗脫劑為 石油醚：乙酸乙酯，體積比為5:1，收率為42%。
[0011] 2.克百威人工抗原的合成。
[0012] (1)取制備好的克百威半抗原、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶于lmL無水N，N_二 甲基甲酰胺（DMF)中，待其完全溶解后再加入碳二亞胺（EDC)，控制摩爾比為半抗原：NHS : DCC=1:1. 5:1. 5 ;室溫下攪拌反應(yīng)過夜；離心去沉淀，收集上清液，此為A液。
[0013] (2)稱取一定量的牛血清白蛋白（BSA)溶解在5mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/ L，pH 7. 4)中，控制摩爾比為半抗原：BSA=40-100:1 (摩爾比)，此為B液。
[0014] (3)在冰水浴中，將A液緩慢滴加到B液中，磁力攪拌下4°C反應(yīng)過夜，即得到克百 威人工抗原混合液。
[0015] (4)將混合液移入透析袋中，于PBS緩沖液中4°C攪拌透析3天，每天更換3次PBS 緩沖液；透析結(jié)束后離心取上清，使用凍干法將其制成粉末，即得到克百威人工抗原。
[0016] 3.克百威人工抗原的鑒定。
[0017] 分別對(duì)半抗原、載體蛋白和人工抗原溶液進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)載體蛋白在偶聯(lián)前 后紫外掃描光譜的變化情況來初步判斷人工抗原偶聯(lián)是否成功。然后，將所制備的人工抗 原免疫新西蘭大白兔，4免后采集抗血清進(jìn)行檢測，判斷所制備的人工抗原是否具有免疫原 性。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明是新型的克百威羧基化半抗原合成方法，該反應(yīng)合成 步驟簡潔有效，避免了傳統(tǒng)三光氣合成方法中大量使用光氣和甲苯的危害性，以呋喃酚為 起始原料，通過酯化和胺解反應(yīng)，引入一條含4個(gè)碳和羧基端的手臂鏈，最大程度暴露克百 威抗原決定簇，可完全用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國 內(nèi)對(duì)克百威殘留的檢測需要。
【附圖說明】
[0019] 圖1克百威羧基化半抗原的核磁圖。
[0020] 圖2克百威人工抗原紫外掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例 僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實(shí)施例1克百威羧基化半抗原的制備。
[0023] (1)將四口燒瓶置于磁力攪拌器上，配置溫度計(jì)。取1.64g即lOmmol呋喃酚溶于 50mL二氯甲烷中，冰浴下加入1. llg三乙胺，攪拌10分鐘后，將3. 04g二(對(duì)硝基苯）碳酸 酯溶于15mL二氯甲烷中，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，逐漸升溫至30°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小 時(shí)，TLC板監(jiān)控反應(yīng)完成(展開劑：石油醚：乙酸乙酯=10:1 )。
[0024] (2)取1.697g經(jīng)三乙胺堿化的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽，溶于10mL二氯甲烷中， 在冰浴條件下加入到上述反應(yīng)液中，將溫度升到室溫并繼續(xù)攪拌過夜；依次用50mL水和 50mL飽和食鹽水各洗滌2次；用無水硫酸鈉干燥后，過濾除去干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干后經(jīng) 200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原中間體1. 8g，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體積比為 10:1，收率為58%。
[0025] (3)將步驟2得到的半抗原中間體L 8g溶于15mL 1，4-二氧六環(huán)中，加入18mL三 氟醋酸和15mL水，60°C加熱反應(yīng)4小時(shí)后冷卻至室溫；用30mL乙酸乙酯萃取2次，合并有 機(jī)相后依次用30mL水，飽和碳酸氫鈉，水，飽和食鹽水各洗滌2次；用無水硫酸鈉干燥后，過 濾除去干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原0. 73g，洗脫劑 為石油醚：乙酸乙酯，體積比為5:1，收率為42%。4 NMR (500 MHz, CDC13) ^6.97 (d, J =7.0 Hz, 1H), 6.93 (d, / = 8. 0 Hz, 1H), 6.78 (t, / = 7. 0 Hz, 8.0 Hz, 1H), 5.24 (br, 1H), 3.34 (m, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.46 (t, / = 7.0 Hz, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.49 (s，6H)〇
[0026] 實(shí)施例2克百威人工抗原的制備。
[0027] (1)稱取29. 3mg克百威半抗原和17. 3mg N-羥基琥?自酰亞胺溶于lmL無水DMF 中，待其完全溶解后再加入23. 3mg碳二亞胺，室溫下攪拌反應(yīng)過夜；離心去沉淀，收集上 清液，此為A液。
[0028] (2)稱取載體蛋白BSA83mg溶解在5mL 0· 01 mol/L PBS溶液中，為B液。
[0029] (3)在冰水浴中，將A液緩慢滴加到B液中，磁力攪拌下4°C反應(yīng)過夜，即得到克百 威人工抗原混合液。
[0030] (4)將混合液移入透析袋中，于PBS緩沖液中4°C攪拌透析3天，每天更換3次PBS 緩沖液；透析結(jié)束后離心取上清，使用凍干法將其制成粉末，即得到克百威人工抗原。
[0031] 實(shí)施例3克百威抗血清的制備。
[0032] 用實(shí)施例2制備的人工抗原作為免疫原，與弗氏完全佐劑等量混合，乳化完全后 選取2月齡的健康雌性新西蘭大白兔于頸背部皮下多點(diǎn)注射，每間隔3周加強(qiáng)免疫一次。四 免后第10天耳緣靜脈采血，離心得到抗血清。
[0033] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的克百威人工抗原免疫兔子得到的抗血清，四免效價(jià) 可達(dá)81000，對(duì)克百威具有良好的選擇性識(shí)別能力，抗體特性良好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種克百威簇基化半抗原的合成方法，其特征是W巧喃酪為原料，通過醋化和胺解 反應(yīng)，最終合成克百威簇基化半抗原，具體合成路線如下：本發(fā)明目標(biāo)化合物的合成方法分為W下步驟： (1) 取1. 64g即lOmmol巧喃酪溶于50血二氯甲燒中，冰浴下加入1.llg即llmmolΞ 乙胺，攬拌10分鐘后，將3. 04g即lOmmol二(對(duì)硝基苯)碳酸醋溶于15血二氯甲燒中，緩慢 滴加到上述反應(yīng)體系中，逐漸升溫至30°C，繼續(xù)攬拌反應(yīng)1小時(shí)，TLC板監(jiān)控反應(yīng)完成(展開 劑：石油酸：乙酸乙醋=10:1); (2) 取1. 697g即lOmmol經(jīng)Ξ乙胺堿化的4-氨基下酸甲醋鹽酸鹽，溶于10血二氯甲燒 中，在冰浴條件下加入到上述反應(yīng)液中，將溫度升到室溫并繼續(xù)攬拌過夜；依次用50mL水 和50mL飽和食鹽水各洗涂2次；用無水硫酸鋼干燥后，過濾除去干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干后 經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原中間體1. 8g，洗脫劑為石油酸：乙酸乙醋，體積比 為10:1，收率為58%; (3) 將步驟2得到的半抗原中間體1. 8g溶于15血1, 4-二氧六環(huán)中，加入18血Ξ氣醋 酸和15血水，60°C加熱反應(yīng)4小時(shí)后冷卻至室溫；用30血乙酸乙醋萃取2次，合并有機(jī)相 后依次用30mL水，飽和碳酸氨鋼，水，飽和食鹽水各洗涂2次；用無水硫酸鋼干燥后，過濾除 去干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原0. 73g，洗脫劑為石 油酸：乙酸乙醋，體積比為5:1，收率為42%。
【專利摘要】本發(fā)明“一種克百威羧基化半抗原的合成方法”，涉及生物化工技術(shù)。本發(fā)明是新型的克百威羧基化半抗原合成方法，合成步驟簡潔有效，得率高，避免了傳統(tǒng)三光氣合成方法中大量使用光氣和甲苯的危害性。以呋喃酚為起始原料，通過酯化和胺解反應(yīng)，引入一條含4個(gè)碳和羧基端的手臂鏈，形成羧基化半抗原。采用活性酯法制備克百威人工抗原，紫外光譜掃描和免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明制備的抗原良好的免疫原性。本發(fā)明的半抗原及人工抗原可完全用于克百威免疫分析中，滿足國內(nèi)對(duì)克百威殘留的檢測需要，應(yīng)用前景廣闊。
【IPC分類】C07K14/765, C07D307/86, C07K1/107
【公開號(hào)】CN105399711
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510781615
【發(fā)明人】孫鳳霞, 彭夏雨, 羅小玲, 盧春霞, 李紅敏, 羅瑞峰, 謝勇, 黨富民, 康立超
【申請(qǐng)人】新疆農(nóng)墾科學(xué)院, 孫鳳霞
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日