針對程序性死亡-1(pd-1)的抗體的制作方法
【專利說明】針對程序性死亡-1(PD-1)的抗體
[0001] 對W電子形式提交的材料的參考并入
[0002] 與本申請同時提交的計(jì)算機(jī)可讀的核巧酸/氨基酸序列表通過引用整體并入本 申請，并明確為如下：一個45, 084字節(jié)的ASCII(文本）文件，命名為"716746_ST25.TXT"， 創(chuàng)建于2014年5月1日。 陽00引發(fā)明背景
[0004] 程序性死亡l(PD-l)(也稱為程序性細(xì)胞死亡1)是具有268個氨基酸的I型 跨膜蛋白，其最初是通過對發(fā)生調(diào)亡的小鼠T細(xì)胞系的消減雜交而被鑒定的（Ishida etal.，EmboJ.，11:3887-95 (1992))。PD-1 是T細(xì)胞調(diào)節(jié)物CD28/CTLA-4 家族的成 員，并且在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞上表達(dá)（Greenwaldetal.,Annu.Rev. Immunol., 23:515-548 (2005);和化arpeetal.,化t.Immunol., 8:239-245 (2007))。
[0005] 已經(jīng)鑒定了PD-1的兩種配體：PD配體1 (PD-Ll)和PD配體2 (PD-L2)， 兩者都屬于B7蛋白超家族（Greenwaldetal.,同上）。PD-Ll在多種細(xì)胞類型 中表達(dá)，包括肺細(xì)胞、屯、臟細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞和腎細(xì)胞（參見，例如，化eeman etExp.Med. ,192(7):1027-1034(2000);和Yamazakietal.,J.Immun ol.，169(10) :5538-5545(2002))。用脂多糖（LP巧和GM-CSF處理后巨隧細(xì)胞和樹突細(xì) 胞值C)上PD-L1的表達(dá)上調(diào)，并且經(jīng)由T細(xì)胞和B細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，T細(xì)胞和B細(xì)胞 上PD-L1的表達(dá)得到上調(diào)。PD-L1還在多種鼠腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)（參見，例如，Iwaiet al.'Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 99(19):12293-12297(2002);和Blanketal.,Cancer Res.，64(3) : 1140-1145(2004))。與此相反，PD-L2呈現(xiàn)出更受局限的表達(dá)模式并且主要由 抗原呈遞細(xì)胞（例如，樹突細(xì)胞和巨隧細(xì)胞）和某些腫瘤細(xì)胞系表達(dá)（參見，例如，Latchman etal.,化t.Immunol. , 2(3) :261-238(2001))。無論在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)或是 其他細(xì)胞上，腫瘤中PD-L1的高表達(dá)都與較差的臨床預(yù)后相關(guān)，據(jù)推測運(yùn)是由于其在腫瘤 中抑制效應(yīng)T細(xì)胞并上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞燈reg)。
[0006] PD-1負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，并且運(yùn)種抑制功能與胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的基于 免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（ITSM)有聯(lián)系（參見，例如，Greenwaldetal.，同 上；和Par巧etal.，Mol.Cell.Biol. ,25:9543-9553 (2005))。PD-1 的缺乏會 導(dǎo)致自身免疫。例如，已經(jīng)顯示PD-1敲除的巧7BL/6小鼠發(fā)展出狼瘡樣綜合 癥（參見，例如，Nishimuraetal. ,Immunity, 11:141-1151 (1999)。在人類 中，PD-1基因上的單核巧酸多態(tài)性與W下疾病的高發(fā)生率相關(guān)：系統(tǒng)性紅斑狼 瘡、1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化發(fā)展（參見，例如，Nielsenet al.,TissueAntigens, 62 (6) :492-497 (2003)；Bertsiasetal. ,Arthritis Rheum. ,60 (1):207-218 (2009);Nietal.，Hum.Genet. ,121 (2):223-232 (2007); Tahoorietal. ,Clin.Exp.Rheumatol. , 29(5):763-767 (2011);和Kroneretal. ,Ann. Neurol.，58(1) :50-57(2005))。PD-1的異常表達(dá)也參與一些病理（例如腫瘤的免疫逃逸和 慢性病毒感染）中的T細(xì)胞障礙（參見，例如，Barberetal.，化Uire, 439:682-687(2006); 和化a巧eetal.,同上）。
[0007] 最近的研究證實(shí)，PD-1誘導(dǎo)的Τ細(xì)胞抑制還參與抑制抗腫瘤免疫。例如，PD-Ll 在多種人和小鼠腫瘤上表達(dá)，并且在腫瘤上PD-1與PD-L1的結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞的抑制W及 腫瘤的免疫逃避和保護(hù)作用值ongetal.，化t.Med. ,8:793-800(2002))。腫瘤細(xì)胞表 達(dá)PD-L1與其在體外抵抗抗腫瘤T細(xì)胞的裂解作用直接相關(guān)值ongetal.，同上；and Blanketal.,CancerRes. ,64:1140-1145(2004))。PD-1 敲除小鼠能抵抗腫瘤侵襲（Iwai etal.，Int.Immunol.，17:133-144(2005))，并且當(dāng)來自PD-1敲除小鼠的Τ細(xì)胞被過繼 轉(zhuǎn)移到帶有腫瘤的小鼠中時，能高度有效地產(chǎn)生腫瘤排斥度lanketal.，同上）。使用 單克隆抗體阻斷PD-1的抑制性信號能增強(qiáng)小鼠中宿主的抗腫瘤免疫（Iwaietal.，同 上；andHiranoetal.,CancerRes.,65:1089-1096(200?5))，并且腫瘤中PD-Ll的高表 達(dá)水平與許多人癌癥類型的預(yù)后不良相關(guān)（Hamanishietal.,P;roc.化tl.Acad.Sci. USA, 104:3360-335(2007),E5;rownetImmunol., 170:1257-1266(2003);andFlies etal.,YaleJournalofBiologyandMedicine, 84(4):409-421(2011))〇
[0008] 鑒于上述情況，已經(jīng)開發(fā)出了用于抑制PD-1活性來治療各種類型癌癥w及用于 免疫增強(qiáng)（例如，來治療感染性疾病）的策略（參見，例如，Asciedoetal.，Clin.Cancer. Res.，19巧）：1009-1020 (2013))。在運(yùn)方面，已經(jīng)開發(fā)了祀向PD-1的單克隆抗體用于治療 癌癥（參見，例如，Weber,Semin.Oncol.,37(5):430-4309(2010);和Tangetal.,Qi;rrent OncologyRepOTts, 15(2) :98-104(2013))。例如，在I期臨床試驗(yàn)中，nivolumab(也稱 為BMS-936558)在非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌中產(chǎn)生了完全應(yīng)答或部分應(yīng)答（參 見，例如，Topalian,New化glandJ.Med. ,366:2443-2454 (2012))，且其目前正處于III期 臨床試驗(yàn)。MK-3575是針對PD-1的人源化單克隆抗體，其已經(jīng)在I期臨床試驗(yàn)中顯示出 抗腫瘤活性的證據(jù)（參見，例如，化tnaiketal.,2012Ame;ricanSocietyofClinical Oncology(ASCO)AnnualMeeting,摘要編號2512)。另外，最近的證據(jù)表明，祀向PD-1的療 法能增強(qiáng)針對病原體（例如HIV)的免疫應(yīng)答（參見，例如，化richisetal.，化rr.HIV/ AIDSR巧.，9(1) :81-90 (2012))。盡管有運(yùn)些進(jìn)展，然而，運(yùn)些潛在療法在人體中的效力可 能是有限的。
[0009] 因此，需要W高親和力結(jié)合PD-1并且有效地中和PD-1活性的PD-1結(jié)合劑（例如， 抗體）。本發(fā)明提供了運(yùn)樣的PD-1結(jié)合劑。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 1所示的互補(bǔ) 決定區(qū)1佑0時氨基酸序列，569 10^:2所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:3所示的 CDR3氨基酸序列，其中任選地，（a)SEQIDN0:1的第9位殘基被不同的氨基酸殘基替換， (b)SEQIDN0:2的第7、8和9位殘基中的一個或多個被不同的氨基酸殘基替換，（c)SEQID N0:3的第1、2和5位殘基中的一個或多個被不同的氨基酸殘基替換，或者（d) (a)至（c)項(xiàng) 的任意組合。
[0012] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 12所示的互補(bǔ) 決定區(qū)1仰時氨基酸序列，569 10^:13所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:14所示 的CDR3氨基酸序列，其中任選地，（a)SEQIDNO: 12的第9位殘基被不同的氨基酸殘基替 換，（b)SEQIDNO: 13的第8位殘基和/或第9位殘基被不同的氨基酸殘基替換，（c)SEQID NO: 14的第5位殘基被不同的氨基酸殘基替換，或者（d) (a)至（c)項(xiàng)的任意組合。
[0013] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 19所示的互補(bǔ) 決定區(qū)1佑0時氨基酸序列，569 10^:20所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:21所示 的CDR3氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括與SEQIDN0:4-11、SEQ IDNO: 15-18和沈QIDN0:22-25中的任一具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0015] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括SEQIDN0:26所示的互補(bǔ) 決定區(qū)1 (CDR)氨基酸序列和SEQIDN0:27所示的CDR2氨基酸序列。
[0016] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括SEQ ID N0:30所示的互補(bǔ) 決定區(qū)l(CDR)氨基酸序列和SEQ ID N0:31所示的CDR2氨基酸序列，其中任選地，SEQ ID NO:30的第12位殘基被不同的氨基酸殘基替換。
[0017] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括SEQIDN0:35所示的互補(bǔ) 決定區(qū)1佑0時氨基酸序列，569 10^:36所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:37所示 的CDR3氨基酸序列，其中任選地，（a)SEQIDNO: 36的第5位殘基被不同的氨基酸殘基替 換，和/或化)SEQIDN0:37的第4位殘基被不同的氨基酸殘基替換。
[0018] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括與SEQIDNO:28、SEQID NO:29、沈QIDNO:32、沈QIDNO:33、沈QIDNO:34、沈QIDNO:38、沈QIDNO:39、沈QID N0:40或者SEQIDN0:41具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0019] 此外，本發(fā)明提供了編碼前述免疫球蛋白多膚的分離的或純化的核酸序列、包括 運(yùn)種核酸序列的載體、包括前述免疫球蛋白多膚的分離的PD-1結(jié)合劑、編碼運(yùn)種PD-1結(jié)合 劑的核酸序列、包括運(yùn)種核酸序列的載體、包括運(yùn)種載體的分離的細(xì)胞、包括運(yùn)種PD-1結(jié) 合劑或者運(yùn)種載體的并且具有藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的組合物、和通過向哺乳動物施用有 效量的運(yùn)種組合物W在哺乳動物中治療癌癥或者感染性疾病的方法。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1示意性地描繪了用于生成如實(shí)施例1所述的抗PD-1單克隆抗體的不同的 PD-1抗原構(gòu)建體。 陽02引圖2顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在存在低水平的抗PD-1抗體APE2058的條件下，在人CD4叮細(xì)胞MLR測定法中抗TIM-3的括抗劑抗體升高的活性。
[0023] 圖3顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在存在低水平的抗PD-1的APE2058的條件下，在人 CD4叮細(xì)胞MLR測定法中抗LAG-3的括抗劑抗體升高的活性。
[0024] 發(fā)明詳述
[0025] 本發(fā)明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚和/或一種分離的免疫球蛋白輕 鏈多膚，或其片段（例如，抗原結(jié)合片段）。本文使用的術(shù)語"免疫球蛋白"或"抗體"，是指 見于脊椎動物血液或者其他體液中的蛋白，其被免疫系統(tǒng)用來識別和中和外來物體，例如 細(xì)菌和病毒。所述多膚是"分離的"，是指其被移除出其天然環(huán)境。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 免疫球蛋白或抗體是包括至少一個互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的蛋白。所述CDR形成抗體的"高變 區(qū)"，其負(fù)責(zé)抗原結(jié)合（在下文中進(jìn)一步討論）。完整的免疫球蛋白通常由四條多膚組成：兩 條具有相同拷貝數(shù)的重化）鏈多膚和兩條具有相同拷貝數(shù)的輕（L)鏈多膚。所述重鏈中的 每一條含有一個N-末端可變（Vh)區(qū)和Ξ個C-末端恒定（CJ、0)2和0)3)區(qū)，并且每條輕 鏈含有一個N-末端可變（\)區(qū)和一個C-末端恒定（CJ區(qū)。基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸 序列，可將抗體的輕鏈歸入兩種不同類型中的一種，kappa(K)或lambdaa)。在典型的免 疫球蛋白中，每條輕鏈通過二硫鍵連接重鏈，并且所述兩條重鏈通過二硫鍵彼此相互連接。 所述輕鏈可變區(qū)與所述重鏈可變區(qū)對齊，并且所述輕鏈恒定區(qū)與所述重鏈的第一恒定區(qū)對 齊。所述重鏈的其余恒定區(qū)彼此互相對齊。
[00%] 每對輕鏈和重鏈的可變區(qū)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述Vh和Vl區(qū)具有相同的基 本結(jié)構(gòu)，其中每個區(qū)域包括四個框架（FW或FR)區(qū)。本文所用的術(shù)語"框架區(qū)"是指在所述 可變區(qū)內(nèi)的相對保守的氨基酸序列，其中所述框架區(qū)位于高變區(qū)或者互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)之 間。每個可變結(jié)構(gòu)域有4個框架區(qū)，命名為FR1、FR2、FR3和FR4。所述框架區(qū)形成β片層，其 提供所述可變區(qū)的結(jié)構(gòu)框架（參見，例如，C.Α.Janewayetal. (eds. ),Immunobiology, 5th Ed.'GarlandPublishing,化wYork,NY(2001))。
[0027] 所述框架區(qū)由Ξ個互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)相連。如上討論，所述Ξ個CDR,即CDRUCDR2 和CDR3,形成抗體的"高變區(qū)"，其負(fù)責(zé)抗原結(jié)合。所述CDR形成環(huán)，所述環(huán)連接，并且在某 些情況下包括部分的，由框架區(qū)形成的β-片層結(jié)構(gòu)。盡管所述輕鏈和重鏈的恒定區(qū)不直 接參與所述抗體與抗原的結(jié)合，但是所述恒定區(qū)能影響可變區(qū)的方向。所述恒定區(qū)還顯示 出各種效應(yīng)功能，例如通過與效應(yīng)分子和細(xì)胞的相互作用參與抗體依賴的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解 或抗體依賴的細(xì)胞毒性。
[0028] 理想地，本發(fā)明所述分離的免疫球蛋白重鏈多膚和分離的免疫球蛋白輕鏈多膚結(jié) 合PD-1。如上討論，程序性死亡-1 (PD-1)(也稱為程序性細(xì)胞死亡1)是具有268個氨基酸 的I型跨膜蛋白（Ishidaetal.，同上）dPD-1是Τ細(xì)胞調(diào)節(jié)物CD28/CTLA-4家族的成員， 并且在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞上表達(dá)（Greenwaldetal.,同上；and化a巧eet al.，同上）。PD-1包括胞外的IgV結(jié)構(gòu)域，后跟短胞外柄、跨膜區(qū)和胞內(nèi)尾。所述胞內(nèi)尾包 含位于基于免疫受體酪氨酸抑制基序和基于免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序中的兩個憐酸化位 點(diǎn)，其在PD-1負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號的能力方面發(fā)揮作用（參見，例如，Ishidaetal.，同 上；和Blanketal.，同上）。本發(fā)明所述分離的免疫球蛋白重鏈多膚和本發(fā)明所述分離 的免疫球蛋白輕鏈多膚能形成運(yùn)樣的試劑：其結(jié)合PD-1和另一抗原，產(chǎn)生"雙反應(yīng)性"的結(jié) 合劑（例如，雙反應(yīng)性抗體）。例如，所述試劑能結(jié)合PD-1和免疫系統(tǒng)的另一負(fù)調(diào)節(jié)物如， 例如，淋己細(xì)胞激活基因3 (LAG-3)和/或T細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3蛋白 0?Μ-3)。 W29] 結(jié)合PD-1的抗體及其組分在本領(lǐng)域是已知的（參見，例如，美國專利號8, 168, 757;Topalianetal.,同上；和化tnaiketal.,同上）。抗PD-1的抗體也可購自 如，例如，Abeam(Cambridge,MA)等來源。
[0030]氨基酸"替換"或"取代"是指位于給定位置上的一個氨基酸或者殘基被位于相同 位置的另一氨基酸或者位于多膚序列內(nèi)的殘基替換。
[0031] 氨基酸大致分為"芳香族"或"脂肪族"。芳香族氨基酸包括芳香環(huán)。"芳香族"氨 基酸的實(shí)例包括組氨酸化或His)、苯丙氨酸（F或化e)、酪氨酸燈或Tyr)和色氨酸（W或 Trp)。非芳香族氨基酸大致歸為"脂肪族"。"脂肪族"氨基酸的實(shí)例包括甘氨酸（G或Gly)、 丙氨酸（A或Ala)、鄉(xiāng)氨酸（V或Val)、亮氨酸化或Leu)、異亮氨酸（I或lie)、甲硫氨酸 (M或Met)、絲氨酸（S或Ser)、蘇氨酸燈或化r)、半脫氨酸（C或切S)、脯氨酸（P或Pro)、 谷氨酸巧或Glu)、天冬氨酸（A或Asp)、天冬酷胺（N或Asn)、谷氨酷胺怕或Gin)、賴氨酸 化或Lys)和精氨酸巧或Arg)。
[0032] 脂肪族氨基酸可W再分為四個亞組。"大脂肪族非極性亞組"由鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸和 異亮氨酸組成。"脂肪族微極性亞組"由甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半脫氨酸組成。"脂肪 族極性/帶電亞組"由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、賴氨酸和精氨酸組成。"小殘 基亞組"由甘氨酸和丙氨酸組成。帶電/極性氨基酸組可W再分為Ξ個亞組：由賴氨酸和 精氨酸組成的"帶正電亞組"、由谷氨酸和天冬氨酸組成的"帶負(fù)電亞組"、W及由天冬酷胺 和谷氨酷胺組成的"極性亞組"。
[0033] 芳香族氨基酸可W再分為兩個亞組：由組氨酸和色氨酸組成的"氮環(huán)亞組"和由苯 丙氨酸和酪氨酸組成的"苯基亞組"。
[0034] 氨基酸替換或取代可W是保守的、半保守的、或者不保守的。短語"保守的氨基酸 取代"或者"保守的突變"是指一個氨基酸被另一具有共同特性的氨基酸替換。一種明確個 體氨基酸之間共同特性的功能性方法是分析同源生物相應(yīng)蛋白之間氨基酸變化的基準(zhǔn)化 步頁率（SchulzandSchirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag,New York(1979))。根據(jù)運(yùn)種分析，可W定義氨基酸的組別，其中組內(nèi)的氨基酸優(yōu)先與彼此交換， 并且因此在其對蛋白質(zhì)總體結(jié)構(gòu)的影響上彼此最為相似（SchulzandSchirmer,同上）。
[0035] 保守的氨基酸取代的實(shí)例包括上述亞組內(nèi)的氨基酸的取代，例如，賴氨酸取代精 氨酸，反之亦然，使得可W保留正電荷；谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，使得可W保留負(fù)電 荷；絲氨酸取代蘇氨酸，使得可W保留游離的-〇H;W及谷氨酷胺取代天冬酷胺，使得可W 保留游離的-畑2。
[0036] "半保守突變"包括上面列出的相同組、而非相同亞組中氨基酸的氨基酸取代。例 如，天冬氨酸對天冬酷胺的取代，或者天冬酷胺對賴氨酸的取代，設(shè)及同組內(nèi)但在不同亞組 內(nèi)的氨基酸。"不保守突變"設(shè)及不同組間的氨基酸取代，例如，賴氨酸取代色氨酸，或者苯 丙氨酸取代絲氨酸等。
[0037] 本發(fā)明提供了一種免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 1所示的互補(bǔ)決定區(qū) 1 (CDR)氨基酸序列，SEQIDNO: 2所示的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO: 3所示的CDR3氨 基酸序列。在本發(fā)