專利名稱：控制植物衰老程序性細(xì)胞死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具衰老誘導(dǎo)性表達(dá)的植物多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及含反義方向所述多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物以及控制植物程序性細(xì)胞死亡(包括衰老)的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及衰老誘導(dǎo)性植物脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因和衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因，它們的表達(dá)受程序性細(xì)胞死亡(包括衰老)發(fā)生誘導(dǎo)，植物脫氧8-羥-2， 7，10-三氨基癸酸合酶基因和elF-5A基因單獨或組合用于控制植物程序性細(xì)胞死亡和衰
ο
背景技術(shù)：
衰老在植物生命中屬于生物發(fā)育末期。衰老預(yù)示著死亡，并在各個階段的生物組織中發(fā)生，包括全株、器官、花和果實、組織以及個體細(xì)胞。衰老的發(fā)生可由不同因素引起，既有外部的，也有內(nèi)部的。衰老在植物或植物組織 (例如果實、花和葉)生命中是一個復(fù)雜的高度受控的發(fā)育階段。衰老導(dǎo)致細(xì)胞膜和大分子協(xié)調(diào)裂解，代謝物隨后轉(zhuǎn)移至植株的其它部分。除了正常植物發(fā)育過程中發(fā)生的程序性衰老以外，細(xì)胞和組織死亡以及隨后的代謝物再轉(zhuǎn)移為對外部環(huán)境因素的同步反應(yīng)。外部因素誘導(dǎo)衰老過早開始，也稱作壞死或凋亡，這些因素包括環(huán)境壓力，例如溫度、干旱、日照或營養(yǎng)供應(yīng)差以及病原體攻擊。暴露在環(huán)境壓力下的植物組織還產(chǎn)生乙烯，通常稱為應(yīng)激乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997， J. Exp. Botany, 48 :181-199 ；Wright,Μ.，1974, Plant, 120 :63-69)。已知乙烯引起某些植物哀老。衰老不是一個被動過程，而是一個涉及特定基因協(xié)同表達(dá)的主動受控過程。在衰老過程中，總RNA水平降低，許多基因的表達(dá)關(guān)閉(Bate等，1991，J. Exper. Botany,42, 801-11 ；Hensel等，1993，The PlantCell，5，553-64)。但是，越來越多的證據(jù)表明衰老過程取決于核基因從頭轉(zhuǎn)錄。例如，mRNA和蛋白合成以及去核的抑制劑阻斷衰老。體外翻譯實驗使用衰老葉和綠色葉的mRNA進行分子研究，結(jié)果顯示衰老階段的葉蛋白產(chǎn)物圖譜改變 (Thomas等，1992，J. Plant Physiol.，139，403-12)。使用差異篩選和扣除雜交技術(shù)，已經(jīng)由一系列不同植物(既包括單子葉植物，也包括雙子葉植物，例如擬南芥(Arabidopsis)、 玉米、黃瓜、蘆筍、番茄、水稻和馬鈴薯)中鑒定出許多代表衰老誘導(dǎo)基因的cDNA克隆。衰老過程中特異性表達(dá)基因的確定是衰老發(fā)生需要從頭轉(zhuǎn)錄的強有力證據(jù)。衰老過程中發(fā)生的事件似乎高度協(xié)調(diào)，以在壞死和死亡發(fā)生前最大程度利用細(xì)胞組分。為調(diào)節(jié)該過程，一定在特定信號感知和基因表達(dá)級聯(lián)誘導(dǎo)之間發(fā)生了復(fù)雜相互作用。 編碼衰老相關(guān)蛋白的基因表達(dá)可能通過普通激活蛋白調(diào)節(jié)，而這些激活蛋白又由激素信號直接或間接活化。幾乎不知道有關(guān)該過程初始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或隨后協(xié)調(diào)所涉及的機制。協(xié)調(diào)基因表達(dá)需要涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯的因子，包括起始因子。已經(jīng)分離并特征鑒定出各種生物(包括植物)的轉(zhuǎn)錄起始因子基因。真核生物翻譯起始因子5A(elF-5A)是約17KDa大小的必需蛋白因子，它參與真核生物細(xì)胞蛋白合成的起始。其特征在于存在 8-羥-2，7，10-三氨基癸酸[N-(4-氨基-2-羥丁基)賴氨酸]，它是一個獨特的修飾氨基酸，已知僅存在于elF-5A中。通過將多聚胺亞精胺的丁氨基基團轉(zhuǎn)移至elF-5A的特定賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基基團并羥基化，翻譯后形成8-羥-2，7，10-三氨基癸酸。elF-5A的活化包括將亞精胺的丁氨基殘基轉(zhuǎn)移至elF-5A的賴氨酸，形成8-羥-2，7，10-三氨基癸酸并活化elF-5A。在真核生物中，脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)介導(dǎo)elF_5A中 8-羥-2，7，10-三氨基癸酸的翻譯后合成。相應(yīng)的DHS基因還沒有在植物中鑒定出來，但已知植物elF-5A含有8-羥-2，7，10-三氨基癸酸。已經(jīng)用甲硫氨?；堰拭顾販y定證明， 8-羥-2，7，10-三氨基癸酸修飾對體外elF-5A活性必須的。8-羥-2，7，10-三氨基癸酸僅存在于elF_5A中，并可見于所有真核生物、某些古生菌(似乎與真核生物相關(guān))中，但真細(xì)菌中沒有。而且，elF-5A的氨基酸序列高度保守，特別是在8-羥_2，7，10-三氨基癸酸殘基周圍的區(qū)域，提示elF-5A及其活化蛋白脫氧8-羥-2， 7，10-三氨基癸酸合酶在真核生物細(xì)胞生理學(xué)中基本上執(zhí)行重要步驟(Joe等，JBC, 270 22386-22392，1995)。已經(jīng)由人、苜蓿、粘菌、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、煙草和酵母中克隆出elF-5A。原來根據(jù)其分離自兔網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物核糖體及其刺激甲硫氨酰基嘌呤霉素合成的體外活性將其鑒定為一般翻譯起始因子。但是，更多的近期數(shù)據(jù)表明，elF-5A不是總體蛋白合成的翻譯起始因子，而是用于促進mRNA群特定亞群的翻譯。例如，采用動物細(xì)胞和酵母的實驗強有力地證明，elF-5A的一種或多種同種型在介導(dǎo)參與細(xì)胞增殖的mRNA 亞群翻譯方面起必不可少的作用。elF-5A在酵母中存在兩種同種型，如果兩種基因都是沉默的，則細(xì)胞不能分裂(Park等，Biol. Signals, 6 :115-123,1997) 0同樣，激活elF_5A的酵母脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶表達(dá)沉默阻止細(xì)胞分裂。實際上，已經(jīng)開發(fā)出脫氧 8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶抑制劑，它們可能對治療高增殖病很重要(Wolff等，JBC, 272 15865-15871，1997)。其它研究表明，elF-5A的另一個同種型對HIV-I復(fù)制中的Rev功能或HTLV V復(fù)制中的Rex功能是必須的(Park等，Biol. Signals，6 :115_123，1997)。在煙草中還存在至少兩種表達(dá)的elF-5A基因?；蛱禺愋蕴结槺砻?，盡管它們在所有檢測的組織中都表達(dá)，但每種基因都具有不同的表達(dá)圖譜，推測調(diào)節(jié)特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯(Chamot等， Nuc. Acids Res.，20 :625-669,1992)。已經(jīng)由大鼠睪丸、HeLa細(xì)胞、粗糙脈孢菌和酵母中純化出脫氧8_羥_2，7，10_三氨基癸酸合酶。脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶的氨基酸序列高度保守，不同物種的該酶共同擁有相似的物理和催化特性，并表現(xiàn)出與異源elF-5A前體的物種交叉反應(yīng)性(Park 等，6 Biol. Signals, 6 :115-123,1997)。植物多聚胺涉及各種各樣的生理作用，包括成花誘導(dǎo)、胚胎發(fā)生、病原體抗性、 細(xì)胞生長、分化和分裂(Evans 等，1989，Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol.，40， 235-269 ；和 Galston 等，1990，Plant Physiol.，94，406-10)。已經(jīng)表明，elF_5A 是中間體，多聚胺通過 elF-5A 發(fā)揮其作用(Chamot 等，1992，Nuc. Acids Res.，20 (4)，665-69)。已經(jīng)鑒定出兩種編碼煙草elF_5A同種型的基因(NelF_5Al和NelF_5A2) (Chamot 等，1992，Nuc. Acids Res.，20 (4)，665-69)。研究顯示兩種基因非常相似。但是，它們顯示出不同的表達(dá)圖譜。一種基因似乎在mRNA水平上組成型表達(dá)，而另一種基因的表達(dá)圖譜與有或沒有光合活性相關(guān)。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和基因組DNA作圖，提示在煙草中存在一個NelF-5A 基因的多基因家族。有可能存在調(diào)節(jié)衰老/壞死特異性mRNA轉(zhuǎn)錄物亞群翻譯的elF-5A同種型。目前，沒有廣為適用的方法控制由內(nèi)部或外部因素(例如環(huán)境壓力)引起的程序性細(xì)胞死亡(包括衰老)的發(fā)生。因此，開發(fā)應(yīng)用于所有類型植物并在衰老一系列事件中的最早期階段有效的衰老調(diào)節(jié)技術(shù)令人感興趣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)和克隆了編碼番茄衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥_2，7，10-三氨基癸酸合酶(DiB)的全長cDNA克隆以及擬南芥葉和香石竹花瓣全長衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA克隆。本文公開了核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明還部分基于編碼番茄、擬南芥和香石竹衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因的全長 cDNA克隆的發(fā)現(xiàn)和克隆。本文公開了每種elF-5A cDNA克隆的核苷酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明提供一種遺傳修飾植物以控制衰老(或年齡相關(guān)性衰老，或環(huán)境壓力誘導(dǎo)性衰老)發(fā)生的方法。將本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)性DHS核苷酸序列、其片段或這些片段的組合反向?qū)胫参锛?xì)胞，以抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS基因表達(dá)，由此降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS蛋白的水平，并降低和/或預(yù)防elF-5A的活化以及隨后的介導(dǎo)衰老的基因表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，將本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)性elF_5A核苷酸序列、其片段或這些片段的組合反向?qū)胫参锛?xì)胞，以抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的表達(dá)，由此降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A蛋白的水平，并降低和/或預(yù)防隨后的介導(dǎo)衰老的基因表達(dá)?；蛘撸珼HS 序列和elF-5A序列可一起用于降低內(nèi)源DHS和elF_5A蛋白的水平。再另一方面，本發(fā)明涉及一種遺傳修飾植物的方法，該方法通過將組合的本發(fā)明衰老誘導(dǎo)性elF-5A核苷酸序列和本發(fā)明衰老誘導(dǎo)性DHS核苷酸序列反向?qū)胫参锛?xì)胞，以抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因和衰老誘導(dǎo)性DHS基因表達(dá)，由此降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性 DHS蛋白的水平，并降低和/或預(yù)防elF-5A活化以及隨后的介導(dǎo)衰老的基因表達(dá)，從而控制衰老(或年齡相關(guān)性衰老，或環(huán)境壓力誘導(dǎo)性衰老)的發(fā)生。再另一方面，本發(fā)明涉及一種遺傳修飾植物的方法，該方法通過將組合的本發(fā)明衰老誘導(dǎo)性elF-5A核苷酸序列和/或本發(fā)明衰老誘導(dǎo)性DHS核苷酸序列反向?qū)胫参锛?xì)胞，以抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因和/或衰老誘導(dǎo)性DHS基因表達(dá)，由此降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS蛋白的水平，和/或降低和/或預(yù)防elF-5A活化以及隨后的介導(dǎo)衰老的基因表達(dá)，從而增加對生理疾病(例如但不限于蒂腐病)的抗性。在一個特別優(yōu)選的方面，反向引入內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS的3'末端。使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株并監(jiān)測生長、發(fā)育以及自然或過早誘發(fā)的衰老。由于衰老誘導(dǎo)性DHS水平、衰老誘導(dǎo)性elF-5A水平降低或二者水平都降低，使植株或植株分離部分(例如插條、花、蔬菜、果實、種子或葉)表現(xiàn)出長壽或長儲存期(例如花期延長、水果或蔬菜變質(zhì)減少、重量增加、種子產(chǎn)量增加、對生理疾病(例如蒂腐病)的抗性增加、種子衰老減輕和/或葉變黃減輕)，選擇這樣的植株或植株分離部分作為具有改進特性的目的產(chǎn)物，所述改進特性包括在運輸和儲存過程中葉變黃減少、花瓣脫落減少、果實和蔬菜變質(zhì)減少。繁殖這些優(yōu)質(zhì)植株。同樣，選擇表現(xiàn)出對環(huán)境壓力抗性增加(例如降低對低溫(冷凍)、干旱、感染等的敏感性和/或增加對病原體和/或生理疾病的抗性)的植株作為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)物。一方面，本發(fā)明涉及編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的分離DNA分子或其功能衍生物，其中所述DNA分子或其功能衍生物與SEQ ID NO :1雜交。在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，所
述分離DNA分子具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列，即與SEQ ID NO=I 100%互補(序列同一)。本發(fā)明還涉及編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的分離DNA分子或其功能衍生物，其中所述DNA 分子或其功能衍生物與SEQ ID N0:9雜交。在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，所述分離 DNA分子具有SEQ IDNO 9的核苷酸序列，即與SEQ ID NO 9 100%互補(序列同一)。本發(fā)明還涉及編碼衰老誘導(dǎo)性elF_5A的分離DNA分子或其功能衍生物，其中所述 DNA分子或其功能衍生物與SEQ ID NO :1USEQID N0:13或SEQ ID N0:15雜交。在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，所述分離DNA分子具有SEQ ID N0:11、SEQ ID NO :13或SEQID NO: 15 的核苷酸序列，即與 SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO 15 100% 互補(序列同一)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供由上文所述的DNA分子編碼的分離蛋白或其功能衍生物。一種優(yōu)選的蛋白具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列，或是其功能衍生物。另一個優(yōu)選蛋白具有SEQ ID NO :10的氨基酸序列，或是其功能衍生物。本發(fā)明的其它優(yōu)選蛋白具有 SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO 16 的氨基酸序列。本文還提供編碼RNA分子的反義寡核苷酸或多核苷酸，所述RNA分子與上文描述的DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄物的對應(yīng)部分互補，其中所述寡核苷酸或多核苷酸與所述RNA轉(zhuǎn)錄物雜交，使得內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS的表達(dá)改變。在本發(fā)明該方面的另一個實施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸是一種RNA分子，它與上文描述的DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄物的對應(yīng)部分雜交，使得內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A的表達(dá)改變。所述反義寡核苷酸或多核苷酸可為全長，或者優(yōu)選具有約6-100個核苷酸。所述反義寡核苷酸或多核苷酸可與編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子的一條鏈的對應(yīng)部分大致互補，其中所述編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子與SEQ ID NO=USEQ ID NO :5、 SEQ ID NO 9或其組合雜交，或者與編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子編碼的RNA序列的至少對應(yīng)部分大致互補。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸與核苷酸序列SEQ ID NO =USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9或其組合的一條鏈的對應(yīng)部分大致互補， 或與由SEQ IDNO =USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9或其組合轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄物的對應(yīng)部分大致互補。在另一個實施方案中，所述反義寡核苷酸與編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子的一條鏈的5'非編碼部分或3'部分的對應(yīng)部分大致互補，其中所述DNA分子與SEQ ID NO USEQ IDNO :5, SEQ ID NO :9 或其組合雜交。另一方面，所述反義寡核苷酸或多核苷酸可與編碼衰老誘導(dǎo)性elF_5A的DNA分子的一條鏈的對應(yīng)部分大致互補，其中所述編碼衰老誘導(dǎo)性elF-5A的DNA分子與SEQ ID NO 11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 15 或其任意組合雜交，或者與由 SEQ ID NO :11、SEQID N0:13或SEQ ID NO 15轉(zhuǎn)錄的RNA序列的至少對應(yīng)部分大致互補。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸與核苷酸序列SEQ ID NO=IUSEQ ID NO :13、SEQ ID NO 15或其組合的一條鏈的對應(yīng)部分大致互補，或者編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物與由編碼衰老誘導(dǎo)性elF-5A的DNA分子編碼的RNA序列的對應(yīng)部分大致互補。在另一個實 施方案中，所述反義寡核苷酸與編碼衰老誘導(dǎo)性elF-5A的DNA分子的一條鏈的5'非編碼區(qū)或3'區(qū)的對應(yīng)部分大致互補，其中所述DNA分子與SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13,SEQ IDN0:15或其組合雜交。本發(fā)明進一步涉及轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，該載體包括(a)與(1)編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子的一條鏈的對應(yīng)部分，其中所述編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子與SEQ ID NO :1、SEQ IDNO 5或SEQ ID NO 9雜交，或(2)由編碼衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子編碼的RNA序列的對應(yīng)部分大致互補的反義寡核苷酸或多核苷酸；和(b)與所述反義寡核苷酸或多核苷酸有效連接使得所述反義寡核苷酸或多核苷酸在其轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明進一步涉及轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，該載體包括(a)與(1)編碼衰老誘導(dǎo)性elF_5A的DNA分子的一條鏈的對應(yīng)部分，其中所述編碼衰老誘導(dǎo)性 elF-5A 的 DNA 分子與 SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 15 雜交或 (2)由編碼衰老誘導(dǎo)性elF-5A的DNA分子編碼的RNA序列的對應(yīng)部分大致互補的反義寡核苷酸或多核苷酸；和(b)與所述反義寡核苷酸或多核苷酸有效連接使得所述反義寡核苷酸或多核苷酸在其轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。所述調(diào)節(jié)序列包括在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中有功能的啟動子，該啟動子可為誘導(dǎo)型或組成型。所述調(diào)節(jié)序列可選包括多腺苷酸化信號。本發(fā)明還提供用上述載體或載體組合轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、由所述細(xì)胞產(chǎn)生的秧苗或成熟植株，或所述秧苗或成熟植株的植株部分。本發(fā)明進一步涉及一種生產(chǎn)與未修飾植株相比具有降低水平的衰老誘導(dǎo)性DHS、 衰老誘導(dǎo)性elF-5A或二者都降低的植株的方法，該方法包括(1)用上述載體或載體組合轉(zhuǎn)化植株；(2)讓植株生長至至少秧苗期；(3)測定轉(zhuǎn)化植株或秧苗的衰老誘導(dǎo)性DHS活性和/或elF_5A活性的改變和/或衰老的改變和/或環(huán)境壓力誘導(dǎo)性衰老的改變和/或病原體誘導(dǎo)性衰老和/或乙烯誘導(dǎo)性衰老的改變；和 (4)選擇并培育與非轉(zhuǎn)化植株相比衰老誘導(dǎo)性DHS活性改變和/或elF_5A活性降低和/或衰老改變和/或環(huán)境壓力誘導(dǎo)性衰老改變和/或病原體誘導(dǎo)性衰老改變和/或乙烯誘導(dǎo)性衰老改變的植株。 如上所述生產(chǎn)的植株或子代、雜種、克隆或植株部分優(yōu)選衰老誘導(dǎo)性DHS表達(dá)降低、衰老誘導(dǎo)性elF-5A活性降低或二者均降低以及延遲衰老和/或延遲壓力誘導(dǎo)性衰老和/或病原體誘導(dǎo)性衰老和/或乙烯誘導(dǎo)性衰老。本發(fā)明還涉及抑制植物細(xì)胞內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS表達(dá)的方法，所述方法包括(1)將載體整合入植物基因組，所述載體包含(A)與(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子的一條鏈的至少一部分，其中所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS的DNA分子與SEQ IDNO =USEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 9雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS基因編碼的RNA序列的至少一部分互補的反義寡核苷酸或多核苷酸；和(B)與所述反義寡核苷酸或多核苷酸有效連接使所述反義寡核苷酸或多核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)序列；和(2)培育所述植株，由此轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，轉(zhuǎn)錄物結(jié)合所述內(nèi)源 RNA,由此抑制所述衰老誘導(dǎo)性DHS基因的表達(dá)。本發(fā)明還涉及抑制植物細(xì)胞內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF_5A表達(dá)的方法，所述方法包括(1)將載體整合入植物基因組，所述載體包含(A)與(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF_5A的DNA分子的一條鏈的對應(yīng)部分，其中所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A的DNA分子與SEQ IDNO =IUSEQ ID NO 15,SEQ ID NO 17 或其組合雜交，或(ii)由內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因編碼的RNA序列的至少一部分互補的反義寡核苷酸或多核苷酸；和(b)與所述反義寡核苷酸或多核苷酸有效連接使所述反義寡核苷酸或多核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)序列；和(2)培育所述植株，由此轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，轉(zhuǎn)錄物結(jié)合所述內(nèi)源 RNA,由此抑制所述衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的表達(dá)。


圖1圖示了衰老誘導(dǎo)性番茄葉DHS cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)以及由番茄葉cDNA文庫獲得的衍生氨基酸序列(SEQID NO :2)。圖2A圖示了擬南芥DHS基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)，該序列通過對比番茄 DHS 序列和擬南芥基因庫(http //Renome-www. Stanford. edu/Arabidopsis/)中未確定的基因組序列獲得。氨基酸序列之間的間隙代表內(nèi)含子。圖2B圖示了衍生的擬南芥DHS氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。圖2C圖示了由PCR獲得的600個堿基對的衰老誘導(dǎo)性擬南芥 DHS cDNA的核苷酸序列。圖2D圖示了衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA片段的衍生氨基酸序列。圖3是衍生的全長番茄葉衰老誘導(dǎo)性DHS氨基酸序列(SEQ IDNO 2)和衍生的全長擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS氨基酸序列與人、酵母、真菌和古生菌DHS蛋白序列的對比。黑框表示3或4個序列中相同的氨基酸。圖4是番茄DHS cDNA的限制性圖譜。

圖5是由番茄葉分離的基因組DNA的DNA印跡，用32P_dCTP標(biāo)記的全長番茄衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA探測。圖6是由不同發(fā)育階段番茄花分離的RNA的RNA印跡。圖6A是總RNA的溴化乙錠染色凝膠。每個泳道包含IOyg RNA。圖6B是用32P-dCTP標(biāo)記的全長番茄衰老誘導(dǎo)性 DHS cDNA探測的RNA印跡的放射自顯影。
圖7是由不同成熟期的番茄果實分離的RNA的RNA印跡，用32P_dCTP標(biāo)記的全長番茄衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA探測。每個泳道包含IOyg RNA。圖8是分離自用2M山梨糖醇處理6小時進行干旱應(yīng)激的番茄葉的RNA的RNA印跡。每條泳道包含IOyg RNA。用32P-dCTP標(biāo)記的全長番茄衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA探測所述印跡。

圖9是由暴露于冷凍溫度的番茄葉分離的RNA的RNA印跡。圖9A是總RNA的溴化乙錠染色凝膠。每條泳道包含IOyg RNA。圖9B是用32P-dCTP標(biāo)記的全長番茄衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA探測的RNA印跡的放射自顯影。圖9C顯示根據(jù)葉滲出物電導(dǎo)率檢測的對應(yīng)滲漏數(shù)據(jù)。圖10是不包含PolyA尾和5'末端非編碼區(qū)的香石竹DHS全長(1384個堿基對) cDNA克隆核苷酸序列(SEQ ID NO 9)。在核苷酸序列下方顯示衍生的氨基酸序列(373個氨基酸)(SEQ ID NO :10)。圖11是衰老的擬南芥葉的總RNA的RNA印跡，用32P_dCTP標(biāo)記的全長擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA探測。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖12是由不同時期香石竹花花瓣分離的總RNA的RNA印跡。所述印跡用32P_dCTP 標(biāo)記的全長香石竹衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA探測。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖13是番茄果實衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQ ID NO=Il) 和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO 12)。圖14是香石竹衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQID NO 13)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO 14)。圖15是擬南芥衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因的核苷酸序列(頂部)(SEQID NO 15)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO 16)。圖16是由不同發(fā)育階段擬南芥植株葉分離的總RNA的RNA印跡。所述印跡用 32P-dCTP標(biāo)記的全長擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA和全長衰老誘導(dǎo)性elF-5A探測。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖17是由花端著色(BK)發(fā)育期、堅熟期(RF)發(fā)育期和軟熟期(RS)發(fā)育期的番茄果實分離的總RNA的RNA印跡。所述印跡用32P-dCTP標(biāo)記的全長衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA 和全長衰老誘導(dǎo)性elF-5A探測。軟熟期果實中的DHS和elF_5A同時上調(diào)，與成熟果實一致。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖18是由用山梨糖醇處理以誘導(dǎo)干旱壓力的番茄葉分離的總RNA的RNA印跡。C 是對照；S為山梨糖醇處理。所述印跡用32P-ClCTP標(biāo)記的全長衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA和全長衰老誘導(dǎo)性elF-5A探測。elF-5A和DHS在干旱壓力作用下都上調(diào)。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖19是由番茄植株的花芽和開放衰老花分離的總RNA的RNA印跡。所述印跡用 32P-dCTP標(biāo)記的全長衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA和全長衰老誘導(dǎo)性elF_5A探測。DHS和elF_5A 在開放花/衰老花中都上調(diào)。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖20是由冷損傷番茄葉分離的總RNA的RNA印跡。所述印跡用32P_dCTP標(biāo)記的全長衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA和全長衰老誘導(dǎo)性elF-5A探測。在復(fù)溫過程中冷損傷的發(fā)展使elF-5A和DHS都上調(diào)。放射自顯影在頂部，下方是溴化乙錠染色凝膠。圖21是3. 1周齡擬南芥野生型植株(左)和以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖36顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因植株的照片，照片顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉增大。

圖22是4.6周齡擬南芥野生型植株(左)和以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖36顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因植株的照片，照片顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉增大。圖23是5.6周齡擬南芥野生型植株(左)和以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖36顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因植株的照片，照片顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉增大。圖24是6. 1周齡擬南芥野生型植株(左)和以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖36顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因植株的照片，照片顯示轉(zhuǎn)基因植株增大。圖25顯示3個以反義方向表達(dá)衰老誘導(dǎo)性DHS基因的T1轉(zhuǎn)基因擬南芥植物系的種子產(chǎn)量增加。種子產(chǎn)量表示為種子量。野生型植株顯示的標(biāo)準(zhǔn)誤差為η = 30。圖26是以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖36顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因番茄植株(左)和野生型植株(右)的照片，照片顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉增大和植株增大。該照片攝自秧苗轉(zhuǎn)移至土壤后的第18天。圖27是以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖36顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因番茄植株(左)和野生型植株(右)的照片，照片顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉增大和植株增大。該照片攝自秧苗轉(zhuǎn)移至土壤后的第32天。圖28-35是野生型(頂圖)和以反義方向表達(dá)全長衰老DHS基因的轉(zhuǎn)基因植株 (底圖)的番茄果實照片。在花端著色發(fā)育期收獲果實，并在培育室中熟化。收獲后的天數(shù)在每張圖的左上角標(biāo)明。圖36是以反義方向用于轉(zhuǎn)化植株的擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS基因3'末端的核苷酸序列(SEQ ID NO 30)(頂部)和衍生的氨基酸序列(底部)。圖37是以反義方向用于轉(zhuǎn)化植株的番茄衰老誘導(dǎo)性DHS基因3'末端的核苷酸序列(SEQ ID NO 31)(頂部)和衍生的氨基酸序列(底部)。圖38是用于分離全長擬南芥基因的600個堿基對的擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS探針的核苷酸序列(SEQ ID NO 26)(頂部)和衍生的氨基酸序列(底部)。圖39是用于分離全長香石竹基因的483個堿基對的香石竹衰老誘導(dǎo)性DHS探針的核苷酸序列(SEQ ID NO ,21)(頂部)和衍生的氨基酸序列(底部)。圖40 (a)和(b)是以反義方向表達(dá)衰老DHS基因3'末端(圖37顯示的序列)的轉(zhuǎn)基因番茄植株的番茄果實(右)和野生型植株的番茄果實(左)的照片。當(dāng)野生型果實出現(xiàn)蒂腐病時轉(zhuǎn)基因果實沒有出現(xiàn)蒂腐病。
具體實施例方式提供改變植物細(xì)胞中衰老誘導(dǎo)性DHS基因、衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因或二者的表達(dá)的方法和組合物。植物中衰老誘導(dǎo)性DHS和衰老誘導(dǎo)性elF-5A的表達(dá)單獨或組合改變導(dǎo)致衰老延遲發(fā)生，并改善對環(huán)境壓力和病原體的抗性，因此延長了植物保存期和/或生長期。使用分離自冷凍損傷番茄葉的RNA作為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)分離編碼具有衰老誘導(dǎo)性表達(dá)的番茄DHS基因的全長cDNA序列，并使用RT-PCR 產(chǎn)物篩選冷凍損傷、山梨糖醇處理的番茄葉cDNA文庫。使用對應(yīng)于分離番茄葉cDNA序列以及全長番茄葉cDNA的選定區(qū)域的多核苷酸探針測定環(huán)境應(yīng)激(冷凍)番茄葉、(脫水) 山梨糖醇處理的番茄葉、成熟番茄果實和衰老番茄花中DHS基因編碼mRNA的存在與否。使用衰老擬南芥葉cDNA文庫作為模板，使用根據(jù)擬南芥DHS基因組克隆設(shè)計的引物生產(chǎn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物。擬南芥核苷酸序列與衰老誘導(dǎo)性番茄DHS的對應(yīng)序列具有73%的核苷酸序列同一性和81%的氨基酸序列同一性。使用RT-PCR分離本發(fā) 明的衰老誘導(dǎo)性番茄DHS基因。用于分離番茄DHS基因的上游引物是一個有24個核苷酸的引物5' AG TCTAGA AGG TGC TCG TCC TGA T 3' (SEQ ID NO 3)；下游引物包含 34 個核苷酸5' G ACT GCA GTC GAC ATC GAT(T)15 3' (SEQ IDNO 4)。使用IOOpmol所述下游引物，使用標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR分離cDNA的第一鏈。所述第一鏈然后在同時使用上游和下游引物的RT-PCR中用作模板。在瓊脂糖凝膠上分離RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果揭示存在三個不同的條帶，大小范圍為1. 5kb至600bp。分別使用上游和下游引物中存在的 XbaI和SalI克隆位點將三個片段亞克隆入質(zhì)粒載體pBluescript (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA)并測序。將所述片段的序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中存在的序列進行對比。結(jié)果顯示1. 5kb和Ikb的片段是番茄DHS序列。600bp片段還與人、酵母和脈孢菌 DHS序列排比。使用600bp RT-PCR片段篩選番茄(栽培品種Match Fl雜種)cDNA文庫，制備該文庫的RNA得自用2M山梨糖醇處理6小時誘發(fā)脫水的番茄葉。使用λ Zap (Stratagene Cloning Systems, Lajolla，CA) cDNA文庫試劑盒構(gòu)建所述cDNA文庫。獲得三個相同的對應(yīng)于衰老誘導(dǎo)性DHS基因的陽性全長cDNA克隆并對其測序。衰老誘導(dǎo)性DHScDNA克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO :1。所述cDNA克隆編碼一個381個氨基酸的多肽(SEQ ID NO: 2)，其計算分子量為42. IKDa0鑒于所述基因在發(fā)育和應(yīng)激的番茄花、果實和葉中的表達(dá)模式，該基因與衰老有關(guān)。比對番茄DHS cDNA序列和擬南芥基因組庫(http //genome-www. Stanford. edu/Arabidopsis)中未鑒定的基因組序列。結(jié)果顯示為與未鑒定的擬南芥基因組序列 (AB107060)的排對。排比信息用于鑒定擬南芥序列中的可讀框，由此獲得其推測的氨基酸序列。獲得的比對擬南芥DHS基因的核苷酸和氨基酸序列分別命名為SEQID N0.5(圖2A) 和 SEQ ID N0. 6。基于鑒定的擬南芥DHS序列的短區(qū)產(chǎn)生兩種引物引物1， 5' GGTGGTGTTGAGGAAGATC 3' (SEQ ID N0. 7)和引物 2，5' GGGTGCACGCCCTGATGAAGC 3' (SEQ ID N0. 8)。擬南芥衰老葉cDNA文庫在標(biāo)準(zhǔn)PCR中用作兩種引物的模板。分離 600bp PCR產(chǎn)物并測序，結(jié)果顯示與基因組DHS序列的相應(yīng)片段具有相同的序列。全長衰老誘導(dǎo)性番茄DHS cDNA克隆還用于分離全長衰老誘導(dǎo)性擬南芥和香石竹 DHS cDNA克隆。使用全長番茄DHS cDNA克隆作為探針分別篩選衰老擬南芥葉cDNA文庫和衰老香石竹花瓣cDNA文庫，由此分離擬南芥和香石竹DHS cDNA克隆。然后對由所述cDNA 文庫獲得的cDNA克隆進行測序。以此方式分離的擬南芥全長cDNA克隆的核苷酸序列與通過和番茄cDNA序列比對鑒定為編碼擬南芥DHS的擬南芥基因組序列編碼區(qū)相同。(圖2A， SEQ ID NO :5)。全長香石竹花瓣衰老誘導(dǎo)性DHS克隆的核苷酸序列以及衍生的氨基酸序列示于圖 10 (分別為 SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10)。
因此，本發(fā)明的編碼番茄、香石竹和擬南芥DHS的cDNA序列可用作探針，以相似的方式以分離其它植物的DHS基因，然后可用該基因改變轉(zhuǎn)基因植物的衰老。衰老誘 導(dǎo)性DHS基因似乎是DHS基因家族的一員。使用由雜交植株提取的基因組 DNA進行番茄葉DNA的基因組DNA印跡分析。用各種識別DHS基因編碼區(qū)中單個位點或不識別DHS基因可讀框內(nèi)任何位點的限制酶切所述DNA。番茄DHS的限制圖譜示于圖4。用32P-dCTP標(biāo)記的全長番茄DHS cDNA探測限制酶消化的番茄葉基因組DNA。高嚴(yán)格條件下的雜交揭示，所述全長cDNA探針與每種限制酶消化的DNA樣品的2-3種限制性片段雜交。特別值得注意的是，當(dāng)用XbaI和EcoRI (它們在DHS可讀框中具有限制性位點(圖 4))消化番茄葉基因組DNA時，在DNA印跡中檢測到2個以上的限制性片段(圖5)。栽培品種Mateh Fl ( 一種雜交品種)和純系UCT5的基因組DNA產(chǎn)生相同的限制片段圖譜。這些結(jié)果提示在番茄植株中存在2個或多個DHS基因同種型。如圖3所示，DHS基因在種間高度保守，所以可預(yù)期任意物種的同種型之間具有顯著量的保守序列。用全長番茄cDNA探測番茄花總RNA的RNA印跡，結(jié)果顯示在番茄花中顯著誘導(dǎo)衰老誘導(dǎo)性DHS基因表達(dá)，但在芽中幾乎檢測不到表達(dá)(圖6)。各個發(fā)育期番茄果實的DHS表達(dá)的RNA印跡分析表明，DHS基因在花端著色果實和粉紅果實中以低水平表達(dá)，而在紅(成熟)番茄果實中DHS表達(dá)顯著增強(圖7)。RNA印跡分析還顯示，環(huán)境壓力條件(例如脫水(圖8)和冷凍(圖9))誘導(dǎo)衰老誘導(dǎo)性DHS基因。用2M山梨糖醇處理誘導(dǎo)脫水的番茄葉顯示，與未處理葉相比，在脫水葉中誘導(dǎo)DHS表達(dá)(圖8)。暴露于低溫并恢復(fù)至室溫的植株顯示，誘導(dǎo)的衰老誘導(dǎo)性DHS基因表達(dá)與冷凍損傷綜合癥的發(fā)展(例如滲漏)一致(圖9)。番茄植株和各種植物組織(例如葉、果實和花)中的基因表達(dá)總圖譜顯示，本發(fā)明的DHS基因涉及這些植物和植物組織的衰老發(fā)生。用擬南芥的葉衰老發(fā)生和香石竹花瓣衰老發(fā)生觀察到誘導(dǎo)DHS基因表達(dá)方面的相似結(jié)果。分離自各個年齡植株的擬南芥葉總RNA的RNA印跡分析顯示，衰老誘導(dǎo)性DHS 基因的表達(dá)在早期(5周齡植株)不明顯，但在約6周時開始出現(xiàn)。第7周時顯著誘導(dǎo)DHS 基因的表達(dá)。RNA印跡分析表明，擬南芥DHS基因隨植株株齡顯著增強(圖11)。RNA印跡分析還顯示，DHS基因在開花植物(例如香石竹)中受到相似調(diào)節(jié)(圖 12)。分離自各個年齡香石竹花瓣的總RNA的RNA印跡分析顯示，在具有年齡誘導(dǎo)性衰老癥狀(例如花瓣內(nèi)卷，這是衰老的第一個形態(tài)表現(xiàn))的花瓣中顯著誘導(dǎo)香石竹DHS表達(dá)，但在緊結(jié)花芽中的表達(dá)低得多。香石竹花花瓣剛剛開始打開時的DHS表達(dá)明顯比緊結(jié)芽期的花高，完全打開的花瓣也顯示出增強的DHS表達(dá)。因此，預(yù)期通過基本抑制或改變植物組織中衰老誘導(dǎo)性DHS基因的表達(dá)，可以延遲衰敗和腐爛，增加易腐爛果實、花和蔬菜的保存期，可使植物及其組織更耐受壓力和抵抗病原體。這可通過生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物實現(xiàn)，在所述轉(zhuǎn)基因植物中DHS cDNA或其寡核苷酸片段以反義構(gòu)型在果實、花、葉和蔬菜中表達(dá)，優(yōu)選使用組成型啟動子如CaMV35S啟動子，或使用組織特異性或衰老/壓力誘導(dǎo)性啟動子。另一個參與誘導(dǎo)植物衰老相關(guān)性形態(tài)改變的基因elF_5A本文也已經(jīng)分離和測序，同DHS—樣，elF-5A可用于改變植物的衰老和衰老相關(guān)性過程，優(yōu)選將其以反義方向?qū)胫仓曛?。由成熟番茄果實、衰老擬南芥葉和衰老香石竹花cDNA文庫的每一個中分離全長衰老誘導(dǎo)性elF-5A cDNA克隆。每種全長克隆的核苷酸序列和衍生氨基酸序列示于圖13 (番茄衰老誘導(dǎo)性elF-5A)、14 (香石竹衰老誘導(dǎo)性elF_5A)和15 (擬南芥衰老誘導(dǎo)性 elF-5A)。這些cDN A克隆每一種的核苷酸序列還示于SEQ ID NO 11(番茄)(圖13)、SEQ ID而13(香石竹)(圖14)和SEQ ID NO 15 (擬南芥)(圖15)。每種所述基因的衍生氨基酸序列分別示于 SEQ ID NO 12 (圖 13)、SEQ ID NO 14 (圖 14)和 SEQ IDNO 16 (圖 15)。和本文描述的DHS基因序列一樣，本發(fā)明的elF_5A序列可用于分離其它植物的 elF-5A基因。分離的elF-5A序列可用于改變植物的衰老和衰老相關(guān)性過程?？筛鶕?jù)物種之間至少約70%的序列相似性，使用本領(lǐng)域已知的方法分離植物的elF-5A序列。在植物衰老過程中出現(xiàn)elF_5A和DHS的平行誘導(dǎo)。RNA印跡分析顯示，elF_5A在同時發(fā)生天然和壓力誘導(dǎo)性衰老時與DHS同時上調(diào)(圖16至20)。例如，分離自各個年齡擬南芥植株葉的總RNA的RNA印跡分析顯示，從植物中葉明顯衰老時開始，誘導(dǎo)elF-5A表達(dá)，表達(dá)隨衰老發(fā)展顯著增強。在結(jié)果植物(例如番茄)中，elF-5A和DHS在軟熟果實中平行上調(diào)，與果實變軟和腐爛的發(fā)生一致(圖17)。RNA印跡分析還顯示，植物在環(huán)境壓力(例如干旱(圖18)和冷凍損傷(圖20)) 作用下elF-5A和DHS平行上調(diào)。同樣，在開花植物中，開放的花中的elF_5A和DHS平行上調(diào)，兩種基因的表達(dá)持續(xù)增強，直至開花的后期?？寺〉乃ダ险T導(dǎo)性DHS基因及其片段，或克隆的衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因或其片段，或elF-5A和DHS序列的組合，當(dāng)在組成型啟動子(例如玄參花葉病毒35S啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S、雙35S啟動子或MAS啟動子)控制下以反方向(反義)導(dǎo)入時，可用于遺傳修飾植物并改變修飾植物的衰老。選自與番茄、擬南芥或香石竹衰老誘導(dǎo)性DHS基因或衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因具有足夠序列同一性的其它植物的反義序列可用于實現(xiàn)相似的遺傳修飾。遺傳修飾的一個結(jié)果是降低內(nèi)源可翻譯衰老誘導(dǎo)性DHS編碼mRNA、 elF-5A編碼mRNA或二者的量。因此，植物細(xì)胞中產(chǎn)生的衰老誘導(dǎo)性DHS和/或衰老誘導(dǎo)性 elF-5A量減少，由此降低活性elF-5A的量，這又降低了衰老誘導(dǎo)蛋白(包括衰老誘導(dǎo)性脂肪酶、衰老誘導(dǎo)性蛋白酶和衰老誘導(dǎo)性核酸酶)的翻譯。因此抑制或延遲衰老，因為衰老發(fā)生需要從頭蛋白合成。例如，用在雙35S啟動子調(diào)控下以反義方向表達(dá)擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS基因(SEQ ID N0:26)(圖38)的全長序列或3'區(qū)的載體轉(zhuǎn)化擬南芥植株，轉(zhuǎn)化的擬南芥植株顯示生物量增加，例如與對照植株相比葉較大以及整個生長階段的植株生長總體較高，并且葉衰老延遲，如圖21至24所示。隨著轉(zhuǎn)化植株種子產(chǎn)量的增加，還觀察到在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中以反義方向表達(dá)擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS基因的全長序列或3'區(qū)帶來了衰老誘導(dǎo)性DHS基因表達(dá)降低的效果。表達(dá)擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS基因反義3'非編碼區(qū)的擬南芥植物系生產(chǎn)的種子高達(dá)野生型植株的6倍(圖25)。在雙35S啟動子控制下，用番茄衰老誘導(dǎo)性DHS基因(SEQ IDN0. 27)的3'末端以反義方向轉(zhuǎn)化番茄植株獲得相似的結(jié)果。與對照(非轉(zhuǎn)化)番茄植株相比，用所述基因的 3'末端以反義方向轉(zhuǎn)化的植株顯示葉增大和植株大小增加(圖26和27)。與野生型植株相比，用全長番茄衰老誘導(dǎo)性DHS以反義方向轉(zhuǎn)化的番茄植株生產(chǎn)的果實軟化和腐爛延遲(圖28-35)。因此，本發(fā)明的方法和序列可用于延遲果實軟化和腐爛，并增加植株生物量和種子產(chǎn)量，并且通常延遲植物的衰老。在雙35S啟動子控制下，用表達(dá)番茄衰老誘導(dǎo)性DHS基因(SEQID NO 31)(圖37) 的3'區(qū)的載體以反義方向轉(zhuǎn)化番茄植株的番茄果實，與對照植株相比，轉(zhuǎn)化植株的番茄果實表現(xiàn)出對蒂腐病(一種生理疾病)的抗性增加，如圖40所示。本發(fā)明的分離核苷酸序列可用于分離其它植物或生物的大致互補的DHS和/或 elF-5A核苷酸序列。這些序列可再用于轉(zhuǎn)化植物，由此以和使用本文所示分離核苷酸序列相同的方式改變轉(zhuǎn)化植物的衰老用DHS、elF_5A、其片段或其組合轉(zhuǎn)化植物獲得的遺傳修飾可使植物中的衰老誘導(dǎo)性DHS、elF-5A或二者的水平產(chǎn)生長久的改變，并通過自體繁殖或其它繁殖程序在后代植株中傳遞。遺傳改變的植株用于生產(chǎn)新的植物種或植物系，其中所述改變在代與代之間穩(wěn)定傳遞。本發(fā)明首次提供可用于在大范圍的不同植物中實現(xiàn)穩(wěn)定的衰老遺傳修飾的合適 DNA序列。為鑒定和分離衰老誘導(dǎo)性DHS基因和elF_5A基因，通常使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法進行質(zhì)粒DNA制備、限制酶消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、DNA印跡、RNA印跡、DNA連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化。參見例如Sambrook，J.等， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989。核酸雜交技術(shù)由Sambrook公開(同上)。本文使用的術(shù)語“植物”是指全株、植物部分、植物細(xì)胞或植物細(xì)胞組?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物類型沒有限制，包括例如乙烯敏感植物和乙烯不敏感植物；結(jié)果植物，例如杏、蘋果、橙子、香蕉、柚子、梨、番茄、草莓、鱷梨等；蔬菜，例如胡蘿卜、豌豆、萵苣、甘藍(lán)、蕪菁、馬鈴薯、花椰菜、蘆筍等；花，例如香石竹、玫瑰、菊花等；農(nóng)作物和森林物種，例如玉米、 水稻、大豆、苜蓿等；一般來說，包括可接受并表達(dá)本發(fā)明DNA分子的任何植物。可以包括各種倍性水平的植物，包括單倍體、二倍體、四倍體和多倍體。所述植物或者可以為單子葉植物，或者可以為雙子葉植物。本文將轉(zhuǎn)基因植物定義為以某種方式遺傳修飾的植物，包括但不限于將異源或同源衰老誘導(dǎo)性DHS DNA或所述DHS DNA的修飾DNA或某一部分摻入到其基因組中的植物。 或者，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中可摻入異源或同源衰老誘導(dǎo)性elF-5A DNA或所述 elF-5A DNA的修飾DNA或某一部分。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中可摻入異源或同源衰老誘導(dǎo)性DHS和elF-5A DNA或所述DNA的修飾DNA或某一部分或序列組合。改變的遺傳物質(zhì)可編碼蛋白，包含調(diào)節(jié)序列或控制序列，或者可以為反義序列或包括反義序列，或編碼與植物的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A DNA或其mRNA序列或其部分反義的反義RNA。 本文將“轉(zhuǎn)基因”或“轉(zhuǎn)基因序列”定義為已摻入到轉(zhuǎn)基因植物中的外部基因或部分序列。本文使用的術(shù)語“雜交”一般用于指在適宜的嚴(yán)格條件下的核酸雜交，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是非常容易的，嚴(yán)格條件取決于探針序列和靶序列的性質(zhì)。雜交和清洗條件是本領(lǐng)域眾所周知的，根據(jù)需要的嚴(yán)格性通過改變溫育時間、溫度和/或溶液離子強度很容易實現(xiàn)條件的調(diào)整。參見例如Sambrook，J.等，Molecular Cloning =A LaboratoryManual,第 2 版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY,1989。 要雜交序列的長度，特別是探針的長度、核酸的相對GC-含量以及允許錯配的量，決定了條件的選擇。當(dāng)需要在互補程度較小的鏈之間部分雜交時優(yōu)選低嚴(yán)格條件。當(dāng)需要完全或接近完全互補時，優(yōu)選高嚴(yán)格條件。對于典型的高嚴(yán)格條件，雜交溶液包含6X S. S. C.、0. OlM EDTAUX Denhardt溶液和0. 5% SDS0對于克隆DNA的片段，以約68°C進行3_4小時的雜交，對于全真核生物DNA，需要約12至約16小時。對于較低嚴(yán)格條件，雜交溫度降至約 42°C，在雙鏈體解鏈溫度(Tm)之下。已知Tm是G-C含量和雙鏈體長度以及溶液離子強度的函數(shù)。本文使用的術(shù)語“大致序列同一性”或“大致同源性”用于指一個核苷酸序列或氨基酸序列與另一個核苷酸或氨基酸序列具有大致的結(jié)構(gòu)或功能等同性。具有大致序列同一性或大致同源性的序列之間的任何結(jié)構(gòu)或功能差異將是最小的即它們不影響所述序列按目的應(yīng)用所示起作用的能力。差異可能緣于例如不同物種之間密碼子選擇的固有變化。如果兩個或多個不同序列之間具有顯著量的序列重疊或相似，或者如果不同序列具有相似的物理特性(即使所述序列在長度或結(jié)構(gòu)上有差異)，則認(rèn)為結(jié)構(gòu)差異最小。這樣的結(jié)構(gòu)包括例如在限定條件下雜交的能力，或在蛋白情況下的免疫交叉反應(yīng)性、相似酶活性等。這些特征的每一個都可由專業(yè)技術(shù)人員按照本領(lǐng)域已知方法輕易測定。另外，如果兩個核苷酸序列之間具有至少約70%、更優(yōu)選80%、最優(yōu)選約90%的序列相似性，則兩個核苷酸序列“大致互補”。如果兩個氨基酸序列在多肽的活性部位之間具有至少50%、優(yōu)選70%相似性，則兩個氨基酸序列大致互補。本文使用的短語與DNA或RNA分子的“對應(yīng)部分雜交”是指雜交分子(例如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(有義或反義方向))在合適的條件下識別并雜交另一個核酸分子的序列，該序列具有與其大約相同的大小和足夠的序列相似性，以實現(xiàn)雜交。例如， 得自番茄DHS 3'編碼區(qū)或非編碼區(qū)的100個核苷酸長度的反義分子分別識別并雜交香石竹DHS基因或任何其它植物DHS基因3'編碼區(qū)或非編碼區(qū)核苷酸序列的大約100個核苷酸的部分，只要兩個序列之間具有約70%或更高的序列相似性。應(yīng)當(dāng)理解的是，“對應(yīng)部分” 的大小允許在雜交中出現(xiàn)一定的錯配，使得“對應(yīng)部分”可比與其雜交的分子更小或更大， 例如大或小20-30%，優(yōu)選大或小不超過約12-15%。術(shù)語核酸(或多核苷酸或寡核苷酸)的“功能衍生物”在本文用于指編碼衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A的基因或核苷酸序列的片段、變異體、同源物或類似物。一種功能衍生物可保留衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A編碼DNA的至少功能部分，該部分提供其按照本發(fā)明的用途。這樣的功能可包括在低嚴(yán)格條件下與天然番茄、擬南芥或香石竹衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A或另一種植物的編碼衰老誘導(dǎo)性DHS或elF_5A的大致同源DNA或其mRNA 轉(zhuǎn)錄物雜交的能力，或以反義方向抑制植物衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A mRNA等轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力。 所述基因或DNA序列的“片段”是指所述分子的任何亞單位，例如較短的多核苷酸或寡核苷酸。“變異體”是指與完整基因或其片段基本相似的分子，例如具有1個或多個取代核苷酸但保留與特定基因雜交的能力或編碼與天然DNA雜交的mRNA轉(zhuǎn)錄物的能力的核苷酸取代變異體?！巴次铩笔侵覆煌参飳倩蛭锓N的片段或變異序列?！邦愃莆铩笔侵概c完整分子、其變異體或片段大致相似或起它們的作用的非天然分子。基因(例如衰老誘導(dǎo)性DHS基因或衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因)的“改變表達(dá)”或“修飾表達(dá)”是指通過其以某種方式改變所述基因正常表達(dá)(例如發(fā)生在未修飾的結(jié)果植物、開花植物或其它植物中的表達(dá))的任何過程或結(jié)果。按照本發(fā)明的設(shè)想，基因表達(dá)改變完全或部分降低了衰老誘導(dǎo)性DHS基因或衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因或二者的表達(dá)，但還可以包括表達(dá)時間的改變，或另一種狀態(tài)，在該狀態(tài)中衰老誘導(dǎo)性DHS基因或衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因或二者的表達(dá)與在未修飾植物或栽培品種中最可能天然發(fā)生的表達(dá)不同。優(yōu)選的改變是與未修飾植物相比，導(dǎo)致修飾植物中衰老誘導(dǎo)性DHS的產(chǎn)生、衰老誘導(dǎo)性elF-5A的產(chǎn)生或這二者降低。 在按照本發(fā)明生產(chǎn)遺傳改變植物時，優(yōu)選根據(jù)目標(biāo)特性選擇個體秧苗或植株，一般是衰老誘導(dǎo)性DHS表達(dá)或產(chǎn)生降低，或者衰老誘導(dǎo)性elF-5A表達(dá)降低，或二者都降低。例如可通過觀測轉(zhuǎn)基因植物衰老的延遲或減輕測定衰老誘導(dǎo)性DHS和衰老誘導(dǎo)性elF-5A的表達(dá)。還可以用已知測定法與對照(正常、非轉(zhuǎn)基因)植株相比，定量轉(zhuǎn)基因植物中DHS和 /或elF-5A的活性。為表達(dá)新插入的基因或DNA序列以生產(chǎn)其編碼蛋白，或在反義DNA情況下為轉(zhuǎn)錄新插入的基因或DNA序列以獲得反義RNA分子，在所述基因或DNA序列的合適位置和方向應(yīng)存在合適的調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)區(qū)可包括啟動子、5'-非翻譯前導(dǎo)序列和3'-多聚腺苷酸序列以及增強子和其它調(diào)節(jié)序列。與衰老誘導(dǎo)性DHS基因聯(lián)合用于產(chǎn)生所述基因的有義或反義轉(zhuǎn)錄物的啟動子調(diào)節(jié)元件一般包括任何植物啟動子，更具體地說包括組成型啟動子，例如玄參花葉病毒35S 啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子、CaMV35S啟動子或MAS啟動子；或組織特異性或衰老誘導(dǎo)性啟動子，例如香石竹花瓣GSTl啟動子或擬南芥SAG12啟動子(參見例如J. C. Palaqui
Plant Physiol. ,112 1447-1456 (1996) ；Morton MolecularBreeding, 1 123-132(1995) ；Fobert 等，Plant Journal, 6 567-577 (1994)；和Gan等，Plant Physiol., 113:313(1997)，通過引用結(jié)合到本文中)。用于本發(fā)明的啟動子優(yōu)選是組成型啟動子，最優(yōu)選使用雙35S啟動子。可使用常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)測試用于本發(fā)明的啟動子的表達(dá)水平，例如通過檢測報告基因產(chǎn)物的水平，例如所述啟動子/報告基因?qū)肫渲械霓D(zhuǎn)基因植物的葉、花、果實或其它組織提取物中的蛋白或mRNA。本發(fā)明提供與番茄衰老誘導(dǎo)性DHS、香石竹衰老誘導(dǎo)性DHS、擬南芥衰老誘導(dǎo)性 DHS編碼基因互補的反義寡核苷酸和多核苷酸，或者與在低至高嚴(yán)格條件下與番茄、香石竹或擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS基因雜交的另一種植物的基因或基因片段互補的反義寡核苷酸和多核苷酸。本發(fā)明還提供與番茄衰老誘導(dǎo)性elF-5A、香石竹衰老誘導(dǎo)性elF-5A、擬南芥衰老誘導(dǎo)性elF-5A編碼基因互補的反義寡核苷酸和多核苷酸，或者與在低至高嚴(yán)格條件下與番茄、香石竹或擬南芥衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因雜交的另一種植物的基因或基因片段互補的反義寡核苷酸和多核苷酸。這樣的反義寡核苷酸應(yīng)當(dāng)至少長約6個核苷酸，以提供最小的雜交特異性，并可與編碼衰老誘導(dǎo)性基因或其部分的DNA或mRNA的一條鏈互補，或者與參與調(diào)節(jié)衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A基因表達(dá)的基因組DNA的側(cè)翼序列互補。所述反義寡核苷酸可大至100個核苷酸或以上，并可在長度上延伸至并超過其反義全編碼序列。所述反義寡核苷酸可為單鏈或雙鏈的DNA或RNA，或其嵌合混合物或衍生物或修飾形式。反義寡核苷酸的作用可導(dǎo)致細(xì)胞中衰老誘導(dǎo)性DHS表達(dá)、衰老誘導(dǎo)性elF_5A表達(dá)或二者的改變，主要是抑制。關(guān)于反義的綜述參見=Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第 2 版，Garland Publishing, Inc. New York,New York，1989 (尤其是 195-196 頁，通過引用結(jié)合到 本文中)。所述反義寡核苷酸可與衰老誘導(dǎo)性DHS或elF_5A基因的任意對應(yīng)部分互補。在一個實施方案中，所述反義寡核苷酸長度可在6-100個核苷酸之間，并可與例如衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A序列的5'非編碼區(qū)或3'末端中的序列互補。已知主要與5'非編碼區(qū)序列互補的反義寡核苷酸為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)的有效抑制劑。Branch，Μ. Α.，Molec. Cell Biol. ，13 :4284-4290(1993)。優(yōu)選的反義寡核苷酸與衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF_5A的編碼mRNA的一部分互補，所述mRNA部分的大小大約和所述反義寡核苷酸相同。例如，預(yù)期將編碼衰老誘導(dǎo)性DHS或elF-5A的全長cDNA克隆以反義方向引入到植物中會導(dǎo)致衰老誘導(dǎo)性DHS和/或 elF-5A基因表達(dá)成功改變。而且，如圖21-35所示，引入靶向衰老誘導(dǎo)性DHS基因或衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因或二者的特定部分的部分序列可具等同效果。本發(fā)明需要的最小同源性是足以獲得足夠的互補性，以識別特異性靶RNA或DNA， 并抑制或降低其翻譯或功能，同時不影響其它RNA或DNA分子的功能和其它基因的表達(dá)。盡管本發(fā)明的反義寡核苷酸包含與衰老誘導(dǎo)性DHS基因或衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的對應(yīng)部分互補的序列，但并不需要絕對互補，盡管優(yōu)選這樣。雜交能力可能取決于反義寡核苷酸長度和互補度。一般來說，雜交的核酸越長，其可能包含的與衰老誘導(dǎo)性DHS靶序列的堿基錯配就越多，但仍形成穩(wěn)定雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用標(biāo)準(zhǔn)方法確定容許的錯配度，以測定例如雜交復(fù)合體的解鏈溫度。可通過轉(zhuǎn)錄外源導(dǎo)入的核酸序列胞內(nèi)產(chǎn)生所述反義RNA寡核苷酸。所述反義分子可通過用載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或感染傳遞至細(xì)胞，所述載體例如為將反義衰老誘導(dǎo)性DHS序列編碼DNA摻入其中的質(zhì)?；虿《?，其中所述DHS序列與合適的調(diào)節(jié)元件(包括啟動子)有效連接。在細(xì)胞中表達(dá)外源DNA序列，產(chǎn)生衰老誘導(dǎo)性DHS基因的反義RNA。載體可以優(yōu)選是質(zhì)粒，或者可以是病毒或本領(lǐng)域已知在植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)其上編碼的基因的其它載體。所述載體變?yōu)槿旧w整合形式，使得其可以轉(zhuǎn)錄， 以產(chǎn)生需要的反義衰老誘導(dǎo)性DHS RNA。這樣的質(zhì)粒或病毒載體可通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組 DNA技術(shù)方法構(gòu)建。例如，所述載體可以是含在原核宿主中有功能的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質(zhì)粒載體?；蛘?，所述載體可以是含在農(nóng)桿菌(Agrobacterium) 中有功能的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質(zhì)粒載體。能夠在農(nóng)桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒本領(lǐng)域眾所周知。參見Miki等，將外源DNA導(dǎo)入植物的方法，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick 禾口 J. Ε· Thompson 主編，CRC Press (1993) ,67-83 頁。按以下的方式將番茄DHS基因以反義方向克隆入質(zhì)粒載體。使用pCD質(zhì)?？寺》袲HS基因，pCD質(zhì)粒構(gòu)建自pUC18骨架，并包含花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子，其后有多個克隆位點和章魚堿合酶終止序列。利用XhoI和ScaI限制位點將全長番茄DHS基因以反義方向亞克隆入P⑶質(zhì)粒，由此構(gòu)建pCd-DHS(反義)質(zhì)粒。寡核苷酸優(yōu)選長度為約6至約100個核苷酸，并與衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的靶序列互補，這些寡核苷酸可通過重組核苷酸技術(shù)制備，或可由例如單核苷酸或較短的寡核苷酸合成。自動化合成儀可用于化學(xué)合成本發(fā)明的寡核苷酸和多核苷酸。構(gòu)建本發(fā)明重組核苷酸分子的方法公開于Sambrook等，載于-MolecularCloning =ALaboratory Manual，第2片反，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY，(1989)， 該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法制備編碼與衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶序列互補的反義RNA的寡核苷酸。上述方法詳見 Maniatis,T.等，Molecular mechanisms in the Control of Gene expression,Nierlich 等主編，Acad. Press, N. Y. (1976)。在本發(fā)明的一個替代性實施方案中，抑制內(nèi)源植物衰老誘導(dǎo)性DHS、衰老誘導(dǎo)性 elF-5A或二者的表達(dá)是通過過表達(dá)引入到植物細(xì)胞中的外源衰老誘導(dǎo)性DHS或elF_5A基因或基因片段或二者而共同抑制的結(jié)果。在本發(fā)明的該實施方案中，以本文描述的用于反義分子的相似方式，將編碼衰老誘導(dǎo)性DHS、衰老誘導(dǎo)性elF-5A或二者的載體以有義方向引入到細(xì)胞中。衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A最好有效連接至強組成型啟動子，例如玄參花葉病毒啟動子或CaMV35S啟動子或雙35S啟動子。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過使用核酶實現(xiàn)對內(nèi)源植物衰老誘導(dǎo)性DHS、衰老誘導(dǎo)性elF-5A或二者表達(dá)的抑制。核酶是具有序列特異性內(nèi)切核酸酶活性的RNA分子。 一個實例是切割靶RNA中UH(其中H是A、C或U殘基)識別位點的錘頭核酶，它包含使核酶的催化結(jié)構(gòu)域定向于底物RNA的靶位點的堿基配對區(qū)。核酶是高度靶特異性的，并可用來使多基因家族的一個成員失活，或靶向相關(guān)mRNA的保守區(qū)。(參見Merlo等，The Plant CeliaO :1603-1621，1998)。可通過用載體(例如質(zhì)?；虿《?轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染將所述核酶分子傳遞至細(xì)胞，其中摻入到載體中的核酶有效連接至合適的調(diào)節(jié)元件(包括啟動子)。 這樣的核酶構(gòu)建物包含堿基配對臂，配對臂使構(gòu)建物定向于衰老誘導(dǎo)性DHS mRNA或衰老誘導(dǎo)性elF-5A mRNA的切割位點，導(dǎo)致切割DHS或elF_5A mRNA,并抑制衰老誘導(dǎo)性DHS和/ 或elF-5A表達(dá)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何植物轉(zhuǎn)化方法通過DNA轉(zhuǎn)化制備按照本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。植物轉(zhuǎn)化方法包括用根癌農(nóng)桿菌直接共培養(yǎng)植物、組織或細(xì)胞，或直接感染 (Miki 等，Meth. in Plant Mol. Biol. AndBiotechnology，(1993)，67-88 頁)；基因直接轉(zhuǎn)移入原生質(zhì)體或原生質(zhì)吸收(Paszkowski等，EMBO J. ,12 =2717(1984))；電穿孔(Fromm等， Nature, 319 :719 (1986))；微粒轟擊(Klein 等，BioTechnology, 6 559-563 (1988))；注射入秧苗和植株的分生組織(De LaPena等，Nature, 325 274-276 (1987))；注射入培養(yǎng)細(xì)胞和組織的原生質(zhì)(Reich 等，BioTechnology, 4 1001-1004 (1986))。一般由轉(zhuǎn)化過程獲得完整植株。植株由原生質(zhì)體、愈傷組織、組織部分或外植體等再生。植物部分得自其中衰老誘導(dǎo)性DHS、衰老誘導(dǎo)性elF-5A或二者表達(dá)改變的再生植株， 例如葉、花、果實、種子等包括在本文使用的“植物”定義中。再生植株的子代、變異體和突變體也包括在“植物”定義中。優(yōu)選通過重組技術(shù)，可選地組合化學(xué)合成方法，生產(chǎn)番茄、香石竹或擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS蛋白或其功能衍生物以及番茄、香石竹或擬南芥衰老誘導(dǎo)性elF-5A蛋白或其功能衍生物。在本發(fā)明的一個實施方案中，衰老誘導(dǎo)性DHS表達(dá)為功能蛋白，優(yōu)選包含與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的衰老誘導(dǎo)性DHS。本文描述的衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF_5A蛋白的“功能衍生物”分別是衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A的片段、變異體、類似物或化學(xué)衍生物，它們分別保留了至少部分的衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A活性或與衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A特異性抗體的免疫交叉反應(yīng)性。衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF_5A蛋白片段是指所述分子的任何亞單位。變異體肽可使用例如本領(lǐng)域眾所周知的方法通過直接化學(xué)合成制備。衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A類似物是指與完整蛋白或其片段大致相似的非天然蛋白。衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A的化學(xué)衍生物包含通常不是所述肽或肽片段的一部分的其它化學(xué)部分?？赏ㄟ^使肽的靶氨基酸殘基與能夠和選定的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機衍生劑反應(yīng)，將修飾引入所述肽或其片段中。可通過培養(yǎng)用本 發(fā)明的核苷酸序列(以有義方向)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、使細(xì)胞合成所述蛋白，然后由培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中分離或者為游離蛋白或者為融合蛋白(取決于使用的克隆方法)的蛋白，生產(chǎn)本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)性DHS或衰老誘導(dǎo)性elF-5A蛋白或肽。或者， 可用無細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)所述蛋白。Ranu等，Meth. Enzymol. ,60 :459_484 (1979)?，F(xiàn)在已經(jīng)有了本發(fā)明的一般性描述，通過參閱以下的實施例更容易理解本發(fā)明， 提供所述實施例僅為了闡述，無意限制本發(fā)明。實施例1信使RNA (mRNA)分離由各種發(fā)育階段的番茄花和番茄果實以及葉(未處理或冷凍或山梨糖醇處理后) 分離總RNA。簡單地說，在液氮中研磨組織(5g)。將研磨粉末與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍，2. 5mM NaOAc pH8. 5,0.8% β-巰基乙醇)混合?；旌衔锿ㄟ^4層粗棉布過濾，并以 10，OOOXg于4°C離心30分鐘。然后以26，OOOXg對上清液進行氯化銫密度梯度離心20小時。沉淀RNA用75%乙醇清洗，重懸浮在600 μ 1 DEPC-處理的水中，并用0. 75ml 95%乙醇和30 μ 1 3Μ NaOAc于_70°C沉淀RNA。在1. 2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10 μ g RNA, 并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用隨機引物32P-dCTP標(biāo)記的全長DHS cDNA(SEQ ID NO 1)于42°C過夜探測膜。然后用含0.1% SDS的IX SSC于室溫清洗膜1次，一次15分鐘，并用含0.1% SDS的0.2X SSC于65°C清洗膜3次，每次15分鐘。于_70°C使膜對X-射線膠片過夜曝光。使用得自Promega的PolyA+片段mRNA分離系統(tǒng)由總RNA分離PolyA+ mRNA。 PolyA+ mRNA用作cDNA合成的模板，合成使用得自Stratagene (La Jolla, Calif.)的 ZAP Express cDNA 合成系統(tǒng)。番茄葉cDNA文庫篩選使用分離自Match Fl雜種番茄葉(已接觸2M山梨糖醇6小時)的mRNA制備cDNA 文庫，將該文庫稀釋至大約5 X 106PFU/ml。使用32P-標(biāo)記的600bp RT-PCR片段篩選cDNA 文庫。切除3個陽性cDNA克隆，并使用生產(chǎn)商說明書中的方法將其再環(huán)化入pBK-CMV (Stratagene)噬菌粒中。將全長cDNA插入到pBK-CMV載體中。質(zhì)粒DNA分離、DNA測序使用Sambrook等(同上)描述的堿裂解法分離質(zhì)粒DNA。使用雙脫氧測序法對全長陽性 cDNA 克隆測序。Sanger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 :5463_5467。使用 BLAST 搜索(GenBank，Bethesda, MD)匯編和分析可讀框，并使用BCM搜索引擎產(chǎn)生多序列比對圖的多元比對法(參見 F. Corpet，Nuc. Acids Res. , 16 10881-10890, (1987))實現(xiàn) 5 個最同源蛋白和編碼基因衍生氨基酸序列的比對。通過MultiFinder鑒定存在于導(dǎo)出氨基酸序列中的功能基序。番茄RNA的RNA印跡雜交
在變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10 μ g總RNA，并固定在尼龍膜上，其中所述總 RNA分離自不同階段(芽和開花以及完全開放或干枯的衰老花瓣)的番茄花、番茄葉以及不同成熟階段的番茄果實(花端著色果，即紅色低于10%的綠果；粉紅果，即整個果實是橙色或粉紅色；以及紅果，或軟或硬)。使用隨機引物試劑盒(BoehringerMarmheim)，使用 32P-dCTP標(biāo)記的全長番茄cDNA探測濾膜(7 X 107cpm)。用IX SSC、0. 1% SDS于室溫清洗濾膜1次，并用0. 2X SSC、0. 1% SDS于65°C清洗濾膜3次。干燥濾膜并于-70°C使濾膜對 X-射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖6、7、8和9。擬南芥RNA的RNA印跡雜交如上在變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離總RNA，并固定在尼龍膜上，其中所述總 RNA得自5周齡(泳道1)、6周齡(泳道2)和7周齡(泳道3)的擬南芥植株葉。使用隨機引物試劑盒(Boehringer Mannheim)，用32P_dCTP標(biāo)記的全長擬南芥衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA 探測濾膜(7 X 107cpm)。用IX SSC、0. 1% SDS于室溫清洗濾膜1次，并用0. 2X SSC、0. 1% SDS于65°C清洗濾膜3次。干燥濾膜并于-70°C使濾膜對X-射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖11。香石竹RNA的RNA印跡雜交如上分離各個花發(fā)育階段(即緊結(jié)芽花(泳道1)、開始開花(泳道2)、完全開花 (泳道3)、花瓣內(nèi)卷的花(泳道4))的香石竹植株花瓣的總RNA，將其在變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離，并固定在尼龍膜上。使用隨機引物試劑盒(Boehringer Mannheim)用32P_dCTP 標(biāo)記全長香石竹衰老誘導(dǎo)性DHS cDNA，用該cDNA探測濾膜(7X107cpm)。用1XSSC、0.1% SDS于室溫清洗濾膜1次，并用0. 2X SSC、0. 1% SDS于65°C清洗濾膜3次。干燥濾膜，并于-70°C對X射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖12。實施例2山梨糖醇誘導(dǎo)番茄衰老誘導(dǎo)性DHS基因在密封箱中用2M山梨糖醇處理番茄葉6小時。如下由山梨糖醇處理的葉中提取 RNA。在液氮中研磨葉(5g)。將研磨粉末與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍，2. 5mM NaOAc pH 8.5,0.8% β-巰基乙醇)混合?；旌衔锿ㄟ^4層粗棉布過濾，并以10，OOOXg于 4°C離心30分鐘。然后以26，OOOXg對上清液進行氯化銫密度梯度離心20小時。沉淀RNA 用75%乙醇清洗，重懸浮在600 μ 1 DEPC-處理的水中，并用0. 75ml 95%乙醇和30μ13Μ NaOAc于-70°C沉淀RNA。在1. 2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10 μ g RNA,并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用隨機引物32P-dCTP標(biāo)記的全長DHScDNA(SEQ ID NO 1)于42°C過夜探測膜。然后用含0. 1 % SDS的IXSSC于室溫清洗膜1次，一次15分鐘，并用含0. 1 % SDS的0. 2X SSC 于65°C清洗膜3次，每次15分鐘。于_70°C使膜對X-射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖8。由圖可見，山梨糖醇誘導(dǎo)葉中的DHS轉(zhuǎn)錄。實施例3誘導(dǎo)衰老花中的番茄DHS基因收獲番茄植株中的緊結(jié)花芽和開放衰老花，并如實施例2分離RNA。在1. 2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離IOyg RNA，并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用隨機引物32P-dCTP標(biāo)記的全長 DHS cDNA(SEQ ID NO 1)于42°C過夜探測膜。然后用含0. 1 % SDS的IX SSC于室溫清洗膜1次，15分鐘，并用含0. SDS的0. 2X SSC于65°C清洗膜3次，每次15分鐘。于_70°C 使膜對χ-射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖6。由圖可見，誘導(dǎo)衰老花中的DHS轉(zhuǎn)錄。實施例4誘導(dǎo)成熟果實中的番茄DHS基因如實施例2分離花端著色果、粉紅果和熟果的RNA。在1. 2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離IOyg RNA，并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用隨機引物32P-dCTP標(biāo)記的全長DHS cDNA(SEQ ID N0:1)(圖1)于42°C過夜探測膜。然后用含0.1% SDS的IX SSC于室溫清洗膜1次，15 分鐘，然后用含0. 1 % SDS的0. 2X SSC于65°C清洗膜3次，每次15分鐘。于_70°C使膜對 X-射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖7。由圖可見，剛好在導(dǎo)致腐敗的衰老發(fā)生之前的成熟紅果中的DHS轉(zhuǎn)
錄最強。實施例5誦i寸冷7東■輸衰·別牛DHS■在培育箱中使盆中的番茄植株(7-8周齡)處于6°C達(dá)2天、3天或6天。光周期設(shè)定為8小時黑暗和16小時光照。通過將植株移回到溫室使植株復(fù)溫。在由溫室移出后立即收獲未復(fù)溫的植株。如下提取葉中的RNA。在液氮中研磨葉(5g)。將研磨粉末與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍、2. 5mM NaOAc pH 8.5,0.8% β-巰基乙醇)混合?；旌衔锿ㄟ^4層粗棉布過濾，并以10，OOOXg于 4°C離心30分鐘。然后以26，OOOXg對上清液進行20小時的氯化銫密度梯度離心。沉淀 RNA用75%乙醇清洗，重懸浮在600 μ 1 DEPC-處理的水中，并用0. 75ml 95%乙醇和30 μ 1 3Μ NaOAc于_70°C沉淀RNA。在1. 2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10 μ g RNA,并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用隨機引物32P-dCTP標(biāo)記的全長DHS cDNA(SEQ ID NO 1)于42°C過夜探測膜。然后用含0. 1 % SDS的IX SSC于室溫清洗膜1次，15分鐘，并用含0. 1 % SDS的0. 2X SSC于 65°C清洗膜3次，每次15分鐘。于_70°C使膜對X-射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖9。由圖可見，通過暴露于冷凍溫度并隨后復(fù)溫，誘導(dǎo)葉中的DHS轉(zhuǎn)錄， 轉(zhuǎn)錄增強與根據(jù)膜滲漏檢測的冷凍損傷相關(guān)。實施例6使用基于未鑒定的擬南芥基因組序列的引物產(chǎn)生擬南芥PCR產(chǎn)物使用一對設(shè)計自擬南芥基因組序列的寡核苷酸引物，通過PCR由擬南芥cDNA模板產(chǎn)生部分長度的衰老誘導(dǎo)性DHS序列。5'引物是一個19聚體，序列為 5 ‘ -GGTGGTGT5TGAGGAAGATC (SEQ ID NO 7) ；3 ‘引物是一個 20 聚體，序列為 GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3 ‘ (SEQ ID NO 8)。使用擴展高保真 PCR 系統(tǒng)(Boehringer Mannhei m)，以擬南芥衰老葉cDNA文庫作為模板，如下進行聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)組分cDNA1 μ (5 χ IO7 pfu)
dNTP (每種 IOmM)1 μl
MgCl2 (5 mM)+10 χ 緩沖液5 μl
引物1和2(每種100 μΜ)2μ1
擴展高保真DNA聚合酶1.75 U
反應(yīng)體積50 μl反應(yīng)參數(shù)94°C，3 分鐘94°C /1 分鐘、58°C /1 分鐘、72°C /2 分鐘，45 個循環(huán)72"C、15 分鐘實施例7分離基因組DNA和DNA印跡分析通過在液氮中將IOg番茄葉組織研磨成精細(xì)粉末，由番茄葉中提取基因組DNA。將 37. 5ml含25ml 勻漿緩沖液[IOOmM Tris-HCl pH8. OUOOmm EDTA、250mM NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、1 % 2-巰基乙醇、10 μ g/ml RNA酶和12. 5ml苯酚]的混合物預(yù)溫至60°C，將其加入到研磨組織中。振搖所述混合物15分鐘。將另外的12.5ml氯仿/異戊醇(24 1)加入到混合物中，再振搖15分鐘。離心混合物，用25ml苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 1) 和氯仿/異戊醇(24 1)再提取水相。通過用15ml異丙醇于室溫沉淀回收核酸。將沉淀物重懸浮在Iml水中。如下對基因組DNA進行限制酶消化在400 μ 1總反應(yīng)體積中使10 μ g基因組DNA、 40 μ 1 IOX反應(yīng)緩沖液和100U限制酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HindIII)反應(yīng)5-6小時。然后苯酚提取混合物，并進行乙醇沉淀。在0.8%瓊脂糖凝膠上以15V對消化的DNA進行大約15小時的瓊脂糖凝膠電泳。在溫和攪拌下將凝膠浸沒在變性緩沖液[87. 66g NaCl和 20g NaOH/L]中30分鐘，用蒸餾水清洗，并在溫和攪拌下浸沒在中性緩沖液[87. 66g NaCl 和60. 55g tris-HCl pH 7. 5/L]中30分鐘。通過毛細(xì)管印跡將所述DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N+ 尼龍膜。 使用1 X 106cpm/ml的32P_dCTP標(biāo)記的全長DHS cDNA或DHScDNA克隆的3 ‘非編碼區(qū)，于42°C進行過夜雜交。用含50%甲酰胺、6X SSC、5X Denhardt溶液、0. 1 % SDS和 100mg/ml變性鮭精DNA的緩沖液進行預(yù)雜交和雜交。膜預(yù)雜交2_3小時；雜交過夜進行。雜交完成后，用2X SSC和0. 1 % SDS于室溫清洗膜，然后用2XSSC和0. 1 % SDS 清洗15分鐘，再用0.2X SSC和0.1% SDS清洗15分鐘。然后于_80°C使膜對X射線膠片過夜曝光。結(jié)果示于圖5。實施例8分離擬南芥的衰老誘導(dǎo)性elF_5A基因使用擬南芥衰老葉cDNA文庫作為模板，通過PCR獲得在擬南芥葉中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的全長cDNA克隆。首先，使用和載體T7引物<MTACGACTCACTATAG> (SEQ ID NO :18)配對的簡并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO 17)以及和載體T3引物<ATTAACCCTCACTAAAG> (SEQ ID NO 20)配對的簡并下游引物 <TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC> (SEQ ID NO: 19)，制備對應(yīng)于所述基因5'-和3'-末端的PCR產(chǎn)物。將所述PCR產(chǎn)物亞克隆入pBluescript進行測序。然后使用與3 ‘-特異性引物<AGAAGAAGTATAAAAACCATC> (SEQ ID NO 22)配對的 5'特異性引物 <CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQ ID NO :21)獲得全長 cDNA,并將其亞克隆入pBluescript進行測序。實施例9分離番茄果鹿的衰老i秀導(dǎo)+牛elF-5A某因使用番茄果實cDNA文庫作為模板，通過PCR獲得在番茄果實中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的全長cDNA克隆。首先，使用和載體T7引物(SEQ ID NO 18)配對的簡并上游引物(SEQ ID NO 17)以及和載體T3引物(SEQ ID NO 20)配對的簡并下游引物 (SEQ ID NO 19)，制備對應(yīng)于所述基因5'-和3'-末端的PCR產(chǎn)物。將所述PCR產(chǎn)物亞克隆入pBluescript進行測序。然后使用與載體T7引物(SEQ IDNO 18)配對的5 ‘特異性引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQ ID NO 23)獲得全長cDNA，并將其亞克隆入 pBluescript進行測序。實施例10分離呑石竹的衰老i秀導(dǎo)t牛elF-5A某因 使用香石竹衰老花cDNA文庫作為模板，通過PCR獲得在香石竹花中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)性elF-5A基因的全長cDNA克隆。首先，使用和載體T7引物(SEQ ID NO 18)配對的簡并上游引物(SEQ ID NO 17)以及和載體T3引物(SEQ ID NO 20)配對的簡并下游引物(SEQ IDNO 19)，制備對應(yīng)于所述基因5'-和3'-末端的PCR產(chǎn)物。將所述PCR產(chǎn)物亞克隆入 pBluescript 進行測序。然后使用與 3'特異性引物 <ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC> (SEQ ID NO 25)配對的 5'特異性引物 <TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO 24)獲得全長 cDNA，并將其亞克隆入pBluescript進行測序。實施例11分離擬南芥的衰老誘導(dǎo)性DHS基因通過篩選擬南芥衰老葉cDNA文庫獲得在擬南芥葉中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)性DHS基因的全長cDNA克隆。用于篩選的探針序列(SEQ IDNO 26)示于圖38。使用衰老葉cDNA文庫作為模板，使用設(shè)計自GenBank中未鑒定的基因組序列(AB017060)的引物，通過PCR獲得所述探針。將PCR產(chǎn)物亞克隆入pBluescript進行測序。實施例12分離香石竹的衰老誘導(dǎo)性DHS基因通過篩選香石竹衰老花瓣cDNA文庫獲得在香石竹花瓣中表達(dá)的衰老誘導(dǎo)性DHS 基因的全長cDNA克隆。用于篩選的探針序列(SEQID NO ,21)示于圖39。使用衰老花瓣 cDNA文庫作為模板，使用簡并引物(上游5' TTG ARG MG ATY CAT MAA RTG CCT 3' (SEQ IDNO 28)；下游5' CCA TCA AAY TCY TGK GCR GTG TT 3' (SEQ IDNO 29))，通過PCR獲得所述探針。將PCR產(chǎn)物亞克隆入pBluescript進行測序。實施例13用擬南芥DHSΦ長序歹I丨或3' R IU反義方向轉(zhuǎn)化擬南芥用雙元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，pKYLX71包含全長衰老誘導(dǎo)性擬南芥DHS cDNA序列或DHS基因的3'末端(SEQ ID NO :30)(圖36)，它們在雙35S啟動子調(diào)節(jié)下都以反義構(gòu)型表達(dá)。通過真空浸潤用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥植株，并在氨芐青霉素上選擇獲得的 Ttl植株轉(zhuǎn)化種子。圖21-24是轉(zhuǎn)化擬南芥植株 的照片，照片顯示DHS基因或其3'末端以反義方向在轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)導(dǎo)致生物量增加，例如葉較大和植株大小增加。圖25表明轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子產(chǎn)量增加。實施例14用番茄DHS的Φ長序歹Il或3' K以/i義方向轉(zhuǎn)化番茄棺株用雙元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，pKYLX71包含全長衰老誘導(dǎo)性番茄DHS cDNA序列或DHS基因的3'末端(SEQ ID NO :31)(圖37)，它們在雙35S啟動子調(diào)節(jié)下都以反義構(gòu)型表達(dá)。用這些農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄葉外植體，通過標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)和選定轉(zhuǎn)化的愈傷組織和秧苗。在溫室條件下將轉(zhuǎn)化的秧苗培育至生產(chǎn)成熟果實的T1植株。圖26-35是照片，顯示衰老誘導(dǎo)性番茄DHS基因在轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)降低導(dǎo)致生物量增加，例如如同轉(zhuǎn)化擬南芥植株一樣可見葉和植株較大，以及番茄果實的軟化和腐爛延遲。實施例15用番茄DHS的3'區(qū)以反義方向轉(zhuǎn)化番茄棺株用雙元載體pKYLX71轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，pKYLX71包含在雙35S啟動子調(diào)節(jié)下以反義構(gòu)型表達(dá)的DHS基因3'末端(圖37)。用這些農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄葉外植體，通過標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)和選定轉(zhuǎn)化的愈傷組織和秧苗。在溫室條件下將轉(zhuǎn)化的秧苗培育成生產(chǎn)成熟果實的T1植株。在約33%的對照植株果實發(fā)生蒂腐病的情況下，這些DHS表達(dá)降低的轉(zhuǎn)基因植株的果實完全沒有蒂腐病病。蒂腐病是一種由使果實底部(花蒂)衰老和腐敗的營養(yǎng)壓力引起的生理疾病。圖40 (a)和40(b)是照片，顯示了對照果實表現(xiàn)出蒂腐病，而轉(zhuǎn)基因果實沒有蒂腐病。結(jié)果表明，降低DHS表達(dá)防止發(fā)生由生理疾病引起的組織和細(xì)胞死亡。
權(quán)利要求
1.一種控制植物中程序性細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括(1)使一種載體整合入所述植物基因組，所述載體包含(A)反義核苷酸序列，其(i)與SEQID NO :31表示的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2， 7，10-三氨基癸酸合酶基因的3'末端核苷酸序列互補；或(ii)與SEQ ID N0:31表示的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3 ‘末端核苷酸序列編碼的RNA序列互補；(B)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與所述反義核苷酸序列有效連接使得表達(dá)所述反義寡核苷酸序列；和(2)培育所述植株，由此轉(zhuǎn)錄所述反義核苷酸序列并結(jié)合所述RNA序列，因而抑制所述衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述程序性細(xì)胞死亡的控制導(dǎo)致蒂腐病的控制改善。
3.—種生產(chǎn)植物的方法，其中所述植物衍生自衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶表達(dá)受到抑制或降低的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞通過以下步驟獲得(1)使一種載體整合入所述細(xì)胞基因組，所述載體包含(A)反義核苷酸序列，其(i)與SEQID NO :31表示的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2， 7，10-三氨基癸酸合酶基因的3'末端核苷酸序列互補；或(ii)與SEQ ID N0:31表示的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3 ‘末端核苷酸序列編碼的RNA序列互補；(B)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與所述反義核苷酸序列有效連接使得表達(dá)所述反義寡核苷酸序列；和(2)培養(yǎng)所述細(xì)胞，由此轉(zhuǎn)錄所述反義核苷酸序列并結(jié)合所述RNA序列，因而抑制所述衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因表達(dá)。
4.一種植物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞通過以下步驟獲得(1)使一種載體整合入所述細(xì)胞基因組，所述載體包含(A)反義核苷酸序列，其(i)與SEQID NO :31表示的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2， 7，10-三氨基癸酸合酶基因的3'末端核苷酸序列互補；或(ii)與SEQ ID N0:31表示的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3 ‘末端核苷酸序列編碼的RNA序列互補；(B)調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與所述反義核苷酸序列有效連接使得表達(dá)所述反義寡核苷酸序列；和(2)培養(yǎng)所述細(xì)胞，由此轉(zhuǎn)錄所述反義核苷酸序列并結(jié)合所述RNA序列，因而抑制所述衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞為番茄細(xì)胞。
全文摘要
通過將編碼衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶、衰老誘導(dǎo)性elF-5A或二者的基因或基因片段以反義方向整合入植物基因組，可在所述植物中實現(xiàn)調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡(包括衰老)表達(dá)。鑒定編碼衰老誘導(dǎo)性脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶和衰老誘導(dǎo)性elF-5A的植物基因，在轉(zhuǎn)基因植物中單獨或組合使用每種所述核苷酸序列減緩衰老。
文檔編號C12N15/09GK102344936SQ20111029137
公開日2012年2月8日 申請日期2001年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月29日
發(fā)明者D·L·盧, J·E·湯普森, T·-W·王 申請人:森尼斯科技術(shù)公司