拮抗性dr3配體的制作方法
【專利摘要】本公開內(nèi)容涉及炎性疾病的治療。具體地講，本公開內(nèi)容涉及可用于治療炎性疾病的拮抗性DR3配體。
【專利說明】拮抗性DR3配體
[0001]背景
TLlA是由內(nèi)皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞產(chǎn)生的TNF超家族成員。TLlA通過DR3 (—種由活化T細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞表達(dá)的TNF受體超家族成員)發(fā)出信號。通過TLlA的受體連接導(dǎo)致通過T輔助效應(yīng)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生增加。DR3和TLlA涉及RA和⑶，因此在治療炎性疾病例如RA (類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和⑶(克羅恩病(CrohnsDisease))時會需要拮抗DR3誘導(dǎo)的作用。
[0002]W02011106707公開了 DR3特異性抗體(11H08)及其包含插入不同抗體構(gòu)架的11H08 CDR序列(SEQ ID NO 14+15)的變體。11H08抗體以相對低的親和力結(jié)合DR3，并且它不與CRDl結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，本領(lǐng)域需要可用于治療炎性疾病的DR3拮抗劑。
[0003]概述
針對DR3產(chǎn)生的二價抗體具有激動作用。這些激動性DR3特異性抗體的幾個具有阻斷DR3與TLlA間的相互作用的能力。由于激動性抗體導(dǎo)致通過T輔助效應(yīng)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，因此在有關(guān)炎性病癥治療時不期望使用二價DR3抗體。
[0004]本發(fā)明提供拮抗性DR3配體，其中所述配體對DR3具有單價特異性，且其中所述配體阻斷TLlA與DR3結(jié)合。這類配體優(yōu)選來源于二價激動性抗體，并且任選與半壽期延長部分(例如親脂部分)綴合。這類配體優(yōu)選具有高親和力，和/或優(yōu)選與DR3的CRDl結(jié)構(gòu)域結(jié)合。本發(fā)明還涉及這類配體治療炎性疾病的用途。本文表明本發(fā)明的DR3配體能夠拮抗通過DR3誘導(dǎo)的作用。
[0005]附圖簡述
圖1:本文提及的序列。
[0006]圖2:通過FCM分析的CH0K1SV上的DR3表達(dá)。JD3是市售可獲得的DR3抗體。
[0007]圖3:用100 μΜ MSX培養(yǎng)的CH0K1SV上的穩(wěn)定DR3表達(dá)。通過FCM分析的表達(dá)。
[0008]圖4 =TNFRl和DR3胞外域的序列比對。每一行表示富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)，該結(jié)構(gòu)域可再被分成A和B亞結(jié)構(gòu)域。突出顯示了針對TNFRl測定的CRD中的保守二硫鍵模式。
[0009]圖5:針對阻斷人TLlA與過量表達(dá)DR3的CHO細(xì)胞結(jié)合的能力預(yù)篩選的各個小鼠血清。右邊條形柱(黑色)是抗TLlA對照(ΜΑΒ7441 RnD Biosystems)。
[0010]圖6:通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的阻斷TL1A:DR3相互作用的抗體的實例。圖6A顯示與6種陽性DR3抗體的DR3細(xì)胞的特異性結(jié)合。圖6B表示顯示4種封閉性抗體和2種非封阻劑(non-blocker)的抑制研究。Y軸表示平均強(qiáng)度熒光。
[0011]圖7:圖7A 3種封閉性抗體和作為對照的非封閉DR3特異性ab的滴定曲線——用完全抗體和用Fab表不。
[0012]圖8:在有或沒有抗DR3 Fab或mAb時用IL12/IL18 +TLlA刺激的CD4+ T細(xì)胞。T細(xì)胞增殖在第5天測量。
[0013]發(fā)明詳述
本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)識到DR3抗原——其可溶形式及細(xì)胞表面表達(dá)的形式——的產(chǎn)生被證實是困難的，因為傳統(tǒng)方法無一成功。人細(xì)胞系中DR3胞外域的重組表達(dá)通常導(dǎo)致含有大量寡聚體和高分子量復(fù)合物的可溶性蛋白質(zhì)分泌(另見實施例3)。據(jù)推測這些寡聚化蛋白質(zhì)批次對于免疫而已并不是最優(yōu)的。與可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)最優(yōu)化(如實施例3所述)的同時，小鼠用過量表達(dá)膜結(jié)合的DR3的細(xì)胞免疫。然而，過量表達(dá)DR3的穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生并不簡單。全長DR3中的死亡結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過量表達(dá)DR3的細(xì)胞系中導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此必須對全長DR3進(jìn)行修飾(參見實施例2和5)。已在不同的小鼠品系(BALB/C、RBF和NMRCF1)中進(jìn)行了免疫以提高抗體庫多樣性和產(chǎn)生中和性抗DR3 Ab的可能性。
[0014]鑒定出幾百個DR3結(jié)合抗體；這些中僅少數(shù)~2%)能夠阻斷/抑制DR3:TL1A結(jié)合。因此推斷具有阻斷DR3: TLlA結(jié)合的能力的DR3抗體具有拮抗DR3誘導(dǎo)作用的能力。然而，結(jié)果的確是所有DR3抗體——不論它們是否具有阻斷DR3:TL1A結(jié)合的能力——在TLlA存在和不存在時均是激動的(agonistic)，它們顯然的確在某種程度上模擬TLlA結(jié)合誘導(dǎo)的對DR3的作用。
[0015]根據(jù)這些出人意料的觀察結(jié)果，本發(fā)明人假設(shè)，對通過所有DR3抗體發(fā)揮的激動作用的解釋可能是任何二價DR3抗體可導(dǎo)致DR3群聚，和DR3群聚可能具有誘導(dǎo)胞內(nèi)DR3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛力。這種設(shè)想還在有關(guān)TNFR家族成員Fas (⑶95)和TNFR2的最新出版物(Wang等(2010) Nature Struc.Mol.Biol.17，1324-1328 ;Mukai 等(2010) Sc1.Signal.3，ra83)中得到支持。Wang等人提供了結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和解析數(shù)據(jù)兩者，表明了胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物具有高級次，并含有至少5-7拷貝的受體。類似地，Mukai等人表明受體胞外部分的群聚由配體結(jié)合誘導(dǎo)。因此，兩種出版物指出，這些TNFR家族成員的高級次群聚可能是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的先決條件。
[0016]為了檢驗該假設(shè)，在功能測定法中測定了用木瓜蛋白酶裂解mAb所產(chǎn)生的Fab片段(單價DR3抗體)。來自這些測定法的出人意料的結(jié)果是，單價DR3抗體(根據(jù)具有阻斷/抑制DR3:TL1A結(jié)合的能力的DR3抗體制備)在功能測定法中是拮抗性的，即它們具有抑制DR3誘導(dǎo)的作用的能力。因此單價DR3配體/抗體不促進(jìn)DR3群聚，因此它們不具有激動作用。
[0017]不阻止TL1A:DR3相互作用的抗體被用作陰性對照。這種抗體類型在不存在TLlA時在極高濃度下是激動性的，但僅作為mAb。來自這些抗體的相應(yīng)的Fab不能夠阻止TLlA誘導(dǎo)的作用。
[0018]定義:
“炎癥”是血管組織對有害刺激(例如病原體、受損細(xì)胞或刺激物)的復(fù)雜的生物反應(yīng)。炎癥是生物消除有害刺激以及啟動組織愈合過程的保護(hù)性嘗試。炎癥不是感染的同義詞——感染是由外源病原體引起的，而炎癥是生物的免疫系統(tǒng)對病原體的反應(yīng)。
[0019]通常，免疫系統(tǒng)能夠區(qū)分機(jī)體正常細(xì)胞或“自身”和外來病原體或異常細(xì)胞或“異物”。免疫系統(tǒng)喪失識別“自身”為正常的能力并且針對組織或細(xì)胞的后續(xù)反應(yīng)的過程，導(dǎo)致耐受性喪失(一種“自身免疫”的狀態(tài))。由自身免疫所致病理常常具有嚴(yán)重的臨床后果，并且是全世界，尤其是發(fā)達(dá)國家的主要健康問題之一。
[0020]目前可獲得生物治療劑用于治療某些自身免疫病和/或癌癥。例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者可用利妥昔單抗(抗⑶20)治療,克羅恩病(Crohn’ s disease)患者可用英利昔單抗或那他珠單抗治療。遺憾的是，接受這些生物制劑任一種的治療的患者，還會遇到各種副作用和/或是無應(yīng)答者和/或形成抑制劑。仍然需要特異性靶向病理組織和/或不影響健康組織和/或產(chǎn)生較不嚴(yán)重的副作用和/或產(chǎn)生較少副作用和/或可長期使用和/或不會導(dǎo)致抑制劑形成的備選生物藥物。本發(fā)明涉及自身免疫病患者和慢性炎性疾病患者中的這些未被滿足的需要。
[0021]本發(fā)明的配體因此適用于治療炎性疾病和病況例如銀屑病、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’ s disease)、炎性腸病(IBD)、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠狀動脈疾病、慢性阻塞性肺病、間質(zhì)性肺疾病、自身免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮病、全身性硬皮病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、白斑、移植物抗宿主病、斯耶格倫綜合征(Sj5ogrens’ s syndrome)、自身免疫性腎炎、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture’ssyndrome)、慢性炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘和其它自身免疫病。
[0022]克羅恩病(CD/肉芽腫性/結(jié)腸炎)是腸的炎性疾病，可影響胃腸道從口到肛門的任何部位，引起各種癥狀。其主要引起腹痛、腹瀉(其可有血)、嘔吐或體重減輕，但還可引起胃腸道以外的并發(fā)癥例如皮疹、關(guān)節(jié)炎、眼部炎癥、疲勞和注意力缺乏。對于克羅恩病尚無已知的藥物或手術(shù)療法。治療選擇局限于控制癥狀、保持緩解和防止復(fù)發(fā)。
[0023]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA):RA是累及整個身體的全身性疾病，并且是最普通的關(guān)節(jié)炎形式之一。其特征在于內(nèi)襯關(guān)節(jié)的膜的炎癥，它引起疼痛、僵硬、發(fā)熱、發(fā)紅和腫脹。炎性細(xì)胞釋放可消化骨和軟骨的酶。由于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，發(fā)炎的關(guān)節(jié)內(nèi)襯滑膜可侵入和損害骨和軟骨，導(dǎo)致除其它生理作用以外的關(guān)節(jié)退化和嚴(yán)重疼痛。受累關(guān)節(jié)可能失去其形狀和排列，導(dǎo)致疼痛和運(yùn)動喪失。
[0024]有若干本領(lǐng)域已知的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型。例如，在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中，小鼠出現(xiàn)十分類似于人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性炎性關(guān)節(jié)炎。由于CIA與RA共享類似的免疫學(xué)和病理學(xué)特征，因此這使之成為篩選潛在人抗炎化合物的理想模型。
[0025]“DR3 ”有時稱為死亡受體 3、TRAMP、TNFRSF12、TNFR25、TNFRS25、AP0-3、DDR3、LARD、TR3、WSL-1或WSL-LR。人DR3是TNF受體(TNFR)超家族的成員，在胞外域包含4個富含半胱氨酸的基序，在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含“死亡結(jié)構(gòu)域”。人DR3包含SEQ ID I中規(guī)定的氨基酸序列。DR3的胞外域(殘基25-199)包含4個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD1、CRD2、CRD3和CRD4)。各CRD通常含有形成3個二硫鍵的6個半胱氨酸殘基。另外，每個CRD可再分為組件Al和B2，其通常在TNFR超家族的常見成員中觀察到。
[0026]“阻斷/抑制/減少DR3與TLlA結(jié)合”。本發(fā)明的單價配體/抗體具有抑制/阻斷/減少DR3:TLlA結(jié)合的能力。其可在基于高通量成像的測定法中進(jìn)行測定。這通過篩選結(jié)合DR3轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的能力和針對野生型細(xì)胞的反篩選而在FMAT系統(tǒng)中進(jìn)行(更多詳情描述于實施例4)。如該測定法中測量的一樣，如果DR3:TL1A結(jié)合降低至少10%、優(yōu)選至少20%、優(yōu)選至少25%、優(yōu)選至少30%、優(yōu)選至少40%、優(yōu)選至少50%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選約100%，則本發(fā)明的單價配體/抗體具有阻斷或抑制或減少DR3:TL1A結(jié)合的能力。
[0027]“延長基團(tuán)(protractive group) ”/ “半壽期延長部分”在本文理解為這樣的一個或多個化學(xué)基團(tuán)，其與一個或多個氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)(例如-SH、-OH、-C00H、-CONH2, -NH2)或者一個或多個N-和/或O-聚糖結(jié)構(gòu)連接并且當(dāng)與多種治療性蛋白質(zhì)/肽綴合時，可延長這些蛋白質(zhì)/肽的體內(nèi)循環(huán)半壽期。延長基團(tuán)/半壽期延長部分的實例包括但不限于:生物相容性脂肪酸及其衍生物、羥基烷基淀粉(HAS)例如羥乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PolyEthylen Glycol,PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明質(zhì)酸(HA)、Heparosan 聚合物(HEP)、基于磷酰膽堿的聚合物(PC聚合物)、Fleximer、葡聚糖、多聚唾液酸(PSA)、Fe結(jié)構(gòu)域、運(yùn)鐵蛋白、白蛋白、彈性蛋白樣肽、XTEN聚合物、白蛋白結(jié)合肽、CTP肽及其任何組合。
[0028]本發(fā)明的“聚二乙醇化DR3配體變體”可具有與DR3配體多肽的任何部分(包括DR3配體多肽的任何氨基酸殘基或糖部分)連接的一個或多個PEG分子?？刹捎没瘜W(xué)和/或酶促方法使PEG或其它延長基團(tuán)與本發(fā)明的單價DR3配體上的聚糖綴合。酶促綴合方法的實例描述于例如W003031464。聚糖可以是天然存在的，或可通過采用本領(lǐng)域眾所周知的方法例如插入N聯(lián)糖基化位點而被插入。本發(fā)明“半胱氨酸-聚二乙醇化DR3配體變體”具有與存在于DR3配體中的半胱氨酸的巰基綴合的一個或多個PEG分子。本發(fā)明的“半胱氨酸-?；疍R3配體變體”或“半胱氨酸-烷基化DR3配體變體”具有與引入DR3配體的半胱氨酸的巰基綴合的一個或多個疏水半壽期延長部分。此外，有可能使延長性半壽期延長部分與其它氨基酸殘基連接 。
[0029]哺乳動物物種循環(huán)血中最豐富的蛋白質(zhì)組分是血清白蛋白，通常以約3-4.5克/100毫升全血的濃度存在。血清白蛋白是約65，000道爾頓的血液蛋白質(zhì)，在循環(huán)系統(tǒng)中具有若干重要功能。它起血液中存在的各種有機(jī)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用、起整個血液中各種代謝物(例如脂肪酸和膽紅素)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，并且由于其豐度而起循環(huán)血的滲透調(diào)節(jié)劑的作用。血清白蛋白具有一周以上的半壽期，延長蛋白質(zhì)的血漿半壽期的一種方法是使蛋白質(zhì)與結(jié)合血清白蛋白的部分綴合?？砂?.Med.Chem., 43，1986，(2000)(其通過引用結(jié)合到本文中)所述來測定白蛋白結(jié)合性質(zhì)。
[0030]疏水/親脂半壽期延長部分:本發(fā)明的配體優(yōu)選與性質(zhì)上主要是親脂/疏水的半壽期延長部分綴合。在一個優(yōu)選的實施方案中，疏水半壽期延長部分能夠與白蛋白形成非共價復(fù)合物(“白蛋白結(jié)合劑”)，因此促進(jìn)衍生物隨血流循環(huán)，還具有延長衍生物的作用時間的作用。因此，整體來看，優(yōu)選的取代基或部分可稱為白蛋白結(jié)合部分。
[0031 ] 與其與本發(fā)明的DR3配體的連接點相比，半壽期延長部分優(yōu)選位于白蛋白結(jié)合部分的相對端或接近白蛋白結(jié)合部分的相對端。白蛋白結(jié)合部分的其它部分，即半壽期延長部分與肽連接點中間的部分，可稱為接頭部分、接頭、間隔基等。然而，接頭的存在是任選的，因此白蛋白結(jié)合部分可與半壽期延長部分相同。
[0032]在具體的實施方案中，白蛋白結(jié)合部分和/或半壽期延長部分是親脂的，和/或在生理pH (7.4)下帶負(fù)電荷。
[0033]白蛋白結(jié)合部分和/或半壽期延長部分可通過綴合化學(xué)法例如通過烷基化、?；蝓０沸纬膳c肽的氨基共價連接；或者例如通過酯化、烷基化與羥基共價連接；或通過肟化與其它基團(tuán)共價連接。
[0034]在一個優(yōu)選的實施方案中，白蛋白結(jié)合部分和/或半壽期延長部分的活性親硫衍生物與抗DR3 Fab的半胱氨酸殘基的巰基共價連接。這類親硫基團(tuán)包括但不限于馬來酰亞胺、鹵代-馬來酰亞胺、鹵化物(尤其α -鹵代乙?；?、丙烯酰-衍生物(例如丙烯酸酯和丙烯酰胺)、乙烯基砜、反應(yīng)性二硫基(例如2-吡啶基)。因此，本發(fā)明的抗DR3 Fab’優(yōu)選通過硫醚或二硫鍵與白蛋白結(jié)合部分連接。[0035]可設(shè)計本發(fā)明的單價抗體，例如Fab’片段，以含有來自構(gòu)成完整抗體重鏈硫橋之一的部分的重鏈的天然存在半胱氨酸殘基。該半胱氨酸殘基稱為C239 (Kabat編號)。半胱氨酸殘基還可通過遺傳工程插入，但是通過使用天然存在的半胱氨酸殘基用于綴合目的，可能有相關(guān)安全優(yōu)勢。
[0036]在一個優(yōu)選的實施方案中，在酰胺鍵形成(該過程稱為?；?的情況下，白蛋白結(jié)合部分和/或疏水半壽期延長部分的活性酯與唾液酸殘基或唾液酸衍生物的氨基共價連接。
[0037]按照本發(fā)明十分優(yōu)選的實施方案，采用酶促方法(例如包括使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法)，使白蛋白結(jié)合部分通過聚糖與配體連接。
[0038]對于本發(fā)明的目的，術(shù)語 “白蛋白結(jié)合部分”、“半壽期延長部分”和“接頭”包括這些分子的未反應(yīng)以及反應(yīng)形式。不論是指一種形式還是另一種形式，從使用該術(shù)語的上下文來看都是清楚的。
[0039]術(shù)語“脂肪酸”是指具有4-28個碳原子的脂族一元羧酸，它優(yōu)選是無支鏈的，和/或是偶數(shù)的，且它可以是飽和的或不飽和的。
[0040]術(shù)語“脂肪二酸”是指上述定義的但在ω位具有額外羧酸基的脂肪酸。因此，脂
肪二酸是二羧酸。
[0041 ] 命名法是本領(lǐng)域常用的，例如-COOH和HOOC-是指羧基；-C6H4_是指亞苯基；-C0_和-OC-是指擬基(O=C < ) ；C6H5-O-是指苯氧基；鹵化物是指鹵素-F、_Cl、-Br、_I和-At。
[0042]在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的白蛋白結(jié)合部分包含通過接頭和唾液酸殘基或唾液酸衍生物與肽或蛋白質(zhì)連接的脂肪?；?-(CH2)n-CO-,其中η= 1,2,3,...40)或ω-羧基脂肪?；?HO2C-(CH2)n-CO-,其中 η= 1,2,3,...40)。
[0043]在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的白蛋白結(jié)合部分包含通過接頭和半胱氨酸殘基與肽或蛋白質(zhì)連接的脂肪?；?_(CH2)n-C0-，其中η= 1,2,3,...40)或ω-羧基脂肪酰基(H02C-(CH2)n-C0-，其中η= 1,2,3,...40)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，η為16或18。
[0044]在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的白蛋白結(jié)合部分包含通過接頭和半胱氨酸殘基與肽或蛋白質(zhì)連接的R-(CH2)n-C0-類型的脂肪?；?，其中η= 1，2，3，...40。R是包含酸性基團(tuán)的基團(tuán)，例如四唑-5-基或-0-C6H4-C00H。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，η為14或15。
[0045]在本發(fā)明的情況下，具有-(CH2) 12-部分的化合物是可能的白蛋白結(jié)合劑。如果這類化合物與蛋白質(zhì)或肽連接，并導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)或肽的血漿半壽期延長，則要了解白蛋白結(jié)合劑可促使血漿半壽期的總體延長。
[0046]在一個優(yōu)選的實施方案中，接頭部分如果存在，則具有2-80個C原子，優(yōu)選5-70個C原子。在其它優(yōu)選的實施方案中，接頭部分如果存在，則具有4-20個雜原子，優(yōu)選2-40個雜原子，更優(yōu)選3-30個雜原子。雜原子特別優(yōu)選的實例為N和O原子。H原子不是雜原子。
[0047]在另一個實施方案中，接頭包含至少一個OEG分子，和/或至少一個谷氨酸殘基，更確切地說相應(yīng)基團(tuán)(0EG稱為8-氨基-3，6-二氧雜辛酸，即該基團(tuán):-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-0-CH2-C0-)。
[0048]在一個優(yōu)選的實施方案中，接頭部分包含二羧酰胺部分，接頭通過硫醚鍵與半胱氨酸殘基連接。在優(yōu)選的實例中，二羧酰胺部分含有2-30個C原子，優(yōu)選4-20個C原子，更優(yōu)選4-10個C原子。
[0049]在一個優(yōu)選的實施方案中，接頭部分包含通過酰胺鍵與唾液酸殘基連接的二羧酰胺部分。在優(yōu)選的實例中，二羧基殘基具有2-30個C原子，優(yōu)選4-20個C原子，更優(yōu)選4-10個C原子。在其它優(yōu)選的實例中，二羧基殘基具有0-10個雜原子，優(yōu)選0-5個雜原子。
[0050]在另一個優(yōu)選的實例中，接頭部分/間隔基包含含有氨基和通過其遠(yuǎn)端羧基經(jīng)由酰胺鍵與唾液酸殘基連接的遠(yuǎn)端羧基兩者的基團(tuán)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該基團(tuán)是OEG基團(tuán)。本文所用術(shù)語“親水間隔基”意指這樣的間隔基，其將本發(fā)明的單價DR3抗體/配體與白蛋白結(jié)合殘基用包含至少5個非氫原子(其中30-50%既非N也非O)的化學(xué)部分分隔開。優(yōu)選白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與Cys殘基連接。[0051]氨基酸谷氨酸(Glu)包含2個羧酸基。其Y-羧基優(yōu)選用于與唾液酸殘基或唾液酸衍生物的氨基，或與OEG分子的氨基(如存在的話)，或與另一 Glu殘基的氨基(如存在的話)形成酰胺鍵。Glu的氨基進(jìn)而與半壽期延長部分的羧基，或與OEG分子的羧基(如存在的話)，或與另一 Glu的Y -羧基(如存在的話)形成酰胺鍵。加入Glu的這種方法偶爾簡稱為“ Y -Glu”。
[0052]具有突變的Fe結(jié)構(gòu)域的“Fe融合衍生物”或“Fe融合蛋白”或DR3抗體在本文意指包括與可來源于任何抗體同種型的Fe結(jié)構(gòu)域融合的本發(fā)明的DR3配體，但是IgG Fe結(jié)構(gòu)域通常將是優(yōu)選的，因為IgG抗體的循環(huán)半壽期相對較長，優(yōu)選IgGl和IgG4同種型。此外可對Fe結(jié)構(gòu)域進(jìn)行修飾以調(diào)節(jié)某些效應(yīng)子功能，例如補(bǔ)體結(jié)合和/或與某些Fe受體的結(jié)合。此外可調(diào)節(jié)Fe結(jié)構(gòu)域以提高對新生兒Fe受體的親和力。本發(fā)明的DR3配體與具有結(jié)合FcRn受體的能力的Fe結(jié)構(gòu)域融合，一般將導(dǎo)致融合蛋白的循環(huán)半壽期延長。IgGl Fe結(jié)構(gòu)域第234、235和237位上的突變一般可導(dǎo)致與Fe Y RI受體的結(jié)合減弱，與Fe Y RIIa和Fe Y RIII受體的結(jié)合也可能減弱。這些突變不改變與FcRn受體的結(jié)合，F(xiàn)cRn受體通過胞吞再循環(huán)途徑促進(jìn)長的循環(huán)半壽期。優(yōu)選本發(fā)明融合蛋白的修飾IgGl Fe結(jié)構(gòu)域包含一個或多個下列突變，其分別可導(dǎo)致對某些Fe受體的親和力降低(L234A、L235E和G237A)，和導(dǎo)致Clq介導(dǎo)的補(bǔ)體結(jié)合減弱(A330S和P331S)?；蛘撸現(xiàn)e結(jié)構(gòu)域可以是任選包含S241P/S228P突變的IgG4 Fe結(jié)構(gòu)域。
[0053]本文所用術(shù)語“抗體”、“單克隆抗體”和“mAb”欲指免疫球蛋白分子及其具有與抗原特異性結(jié)合的能力的片段。全長抗體包含4條多肽鏈，即通過二硫鍵相互連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文簡稱為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文簡稱為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)還可再分成超變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其散布在更保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域內(nèi)。每個VH和VL由3個⑶R和4個FR組成，按以下順序從氨基端到羧基端排列:FRUDRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4?？贵w可呈不同同種型的形式；例如IgG (例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4)、IgGAU IgA2、IgD和IgE。全長抗體通常是二價的(b1-valent/d1-valent),即它具有以兩個“臂”與抗原結(jié)合的能力。相比之下，本發(fā)明的單價抗體只包含一個對抗原/DR3有特異性的結(jié)合部位。[0054]“Fab區(qū)”/ “Fab結(jié)構(gòu)域”/ “Fab片段”/ “Fab”含有界定抗體可結(jié)合的特定靶的可變部分。Fab片段是本發(fā)明的單特異性/單價DR3配體/DR3抗體的實例。
[0055]本發(fā)明的單價DR3配體/抗體的實例包括:Fab片段，由VL、VH、CL和CH I結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；二價片段，其包含例如通過鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個Fab片段，其中這些Fab片段中僅一個對DR3有特異性；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的 VL和 VH 結(jié)構(gòu)域組成的 Fv 片段，(V) dAb 片段(Ward 等(1989) Nature 341:544-546),其由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);和(V)對DR3是單價的雙特異性抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由不同的基因編碼，但可采用重組方法通過使之能夠作為單一蛋白質(zhì)鏈制備的合成接頭將它們連接，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈 Fv (scFv);參見例如 Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;以及 Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。單鏈抗體的其它形式(例如雙抗體)也包括在術(shù)語“單價DR3配體/抗體”內(nèi)。
[0056]“雙抗體”是二價雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單一多肽鏈上表達(dá)，但使用太短以致于不允許同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域間配對的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位(參見例如Hol-1iger, P.等(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。
[0057]本文所用術(shù)語“人抗體”意指具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的本發(fā)明的單價DR3抗體。本發(fā)明的人抗體可例如在CDR中，特別在CDR3中包括非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)誘變或位點專一誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。
[0058]然而，本文所用術(shù)語“人抗體”無意包括這樣的抗體，其中來源于另一種哺乳動物物種(例如小鼠)種系的CDR序列被移植到人構(gòu)架序列中，例如所謂的“人源化抗體”或人/小鼠嵌合抗體。人源化單價DR3抗體也是本發(fā)明的組成部分。
[0059]術(shù)語“嵌合單價抗體”是指本發(fā)明的單價DR3抗體，其輕鏈和重鏈基因通常通過遺傳工程從屬于不同物種的免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因構(gòu)建。例如，可將來自小鼠單克隆抗體的基因的可變區(qū)段與人恒定區(qū)段連接。
[0060]本文所用術(shù)語“表位”意指單價抗體與之結(jié)合的抗原上的任何抗原決定簇。表位決定簇通常由分子(例如氨基酸或糖部分)的化學(xué)活性表面群聚組成，常常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。用于表征表位的方法的實例包括HX-MS、NMR, X射線、肽步查(peptide walking)、測定法等。術(shù)語“抗原互補(bǔ)位”是指識別抗原的抗體的部分。
[0061]可根據(jù)它們識別或特異性結(jié)合的DR3的一個或多個表位或部分，來描述或指定本發(fā)明的單價DR3抗體。例如可通過N端和C端位置，或通過連續(xù)氨基酸殘基的大小來指定一個或多個表位或多肽部分。還可根據(jù)其交叉反應(yīng)性來描述或指定本發(fā)明的單價DR3抗體。本文包括不結(jié)合多肽的任何其它類似物、直向同源物(ortholog)或同源物的抗體。
[0062]“表位框并法Gpitope binning) ”/”競爭結(jié)合測定法”是指利用競爭結(jié)合測定法鑒定能夠或不能夠同時結(jié)合DR3的配體/抗體對，從而鑒定結(jié)合DR3蛋白上的相同表位或重疊表位(參見實施例10)，或因位阻所致不能同時結(jié)合的本發(fā)明的配體/抗體?？虿⒎?Binning)實驗提供存在抗原上完全不同的表位的證據(jù)。然而，靠它們自身，它們無法鑒定表位或?qū)Ρ砦弧白鲌D”至DR3蛋白的特定氨基酸序列或位置?？舍槍θ魏闻潴w/抗體或片段對，對結(jié)合的競爭進(jìn)行評價。通常，配體/抗體家族(或框(bin))的有利性質(zhì)可與由抗體框/競爭基團(tuán)界定的特定表位的結(jié)合相關(guān)聯(lián)。
[0063]本文所用術(shù)語“免疫反應(yīng)”或“免疫反應(yīng)性”意指解離常數(shù)Kd低于10_4 M的配體/抗體與其表位的任何結(jié)合。適當(dāng)時，術(shù)語“免疫反應(yīng)”或“免疫反應(yīng)性”與術(shù)語“特異性結(jié)合”互換使用。
[0064]本文所用術(shù)語“親和力”意指本發(fā)明的配體/抗體與表位結(jié)合的強(qiáng)度?？贵w/配體的親和力用解離常數(shù)Kd測量，解離常數(shù)定義為[Ab] X [Ag] / [Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度，[Ab]是未結(jié)合抗體的摩爾濃度，[Ag]是未結(jié)合抗原的摩爾濃度。親和常數(shù)Ka用Ι/Kd定義。通過競爭抑制確定抗體特異性和親和力的優(yōu)選方法可^jAL Harlow Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988) ；Colligan 等主編，Current Protocolsin Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992,1993);以及 Muller, Meth.Enzymo1.92:589-601 (1983)。
[0065]可按本文所述，測量“降低RA患者滑液細(xì)胞中的IFN-Y釋放”。要了解，在約0.1、0.5、1或5 μg單價抗體/ml的濃度下，采用本文描述的測定條件，RA患者滑液T細(xì)胞中的IFN- Y釋放降低達(dá)至少15%、更優(yōu)選達(dá)至少20%、更優(yōu)選達(dá)至少25%、更優(yōu)選達(dá)至少30%、更優(yōu)選達(dá)至少35%、更優(yōu)選達(dá)至少40%、更優(yōu)選達(dá)至少45%、更優(yōu)選達(dá)至少50%、最優(yōu)選達(dá)至少60%、更優(yōu)選達(dá)至少70%、更優(yōu)選達(dá)至少75%、更優(yōu)選達(dá)至少80%，最優(yōu)選達(dá)至少95%。在反應(yīng)性患者材料中，本發(fā)明的抗體降低RA以及CD患者材料中的干擾素釋放(例如IFN- Y )。
[0066]可按本文所述，測量“降低來自CD患者腸活檢樣品的固有層單核細(xì)胞(LPMC)中一種或多種細(xì)胞因子的釋放”。要了解，在約0.1、0.5、1或5 Pg單價抗體/ml的濃度下，采用本文描述的測定條件，CD患者LPMC中的細(xì)胞因子釋放降低達(dá)至少15%、更優(yōu)選達(dá)至少20%、更優(yōu)選達(dá)至少25%、更優(yōu)選達(dá)至少30%、更優(yōu)選達(dá)至少35%、更優(yōu)選達(dá)至少40%、更優(yōu)選達(dá)至少45%、更優(yōu)選達(dá)至少50%、最優(yōu)選達(dá)至少60%、更優(yōu)選達(dá)至少70%、更優(yōu)選達(dá)至少75%、更優(yōu)選達(dá)至少80%、最優(yōu)選達(dá)至少95%。在反應(yīng)性患者材料中，本發(fā)明的抗體降低RA以及⑶患者材料中的干擾素釋放(例如IFN- Y )。
[0067]可按本文所述，測量“降低⑶4+ T細(xì)胞中一種或多種細(xì)胞因子的釋放”。要了解，在約0.1、0.16、0.5、1或5 Pg單價抗體/ml的濃度下，采用本文描述的測定條件，⑶4+ T細(xì)胞中的細(xì)胞因子釋放降低達(dá)至少15%、更優(yōu)選達(dá)至少20%、更優(yōu)選達(dá)至少25%、更優(yōu)選達(dá)至少30%、更優(yōu)選達(dá)至少35%、更優(yōu)選達(dá)至少40%、更優(yōu)選達(dá)至少45%、更優(yōu)選達(dá)至少50%、最優(yōu)選達(dá)至少60%、更優(yōu)選達(dá)至少70%、更優(yōu)選達(dá)至少75%、更優(yōu)選達(dá)至少80%、最優(yōu)選達(dá)至少95%。
[0068]包含本發(fā)明的DR3配體的“藥物組合物”可以藥盒提供，藥盒裝有包括本發(fā)明的配體的容器。治療性多肽可以用于單劑量或多劑量的注射溶液的形式提供，或作為可在注射前復(fù)溶的無菌粉針劑提供。包含本發(fā)明配體的藥物組合物適于皮下和/或IV給藥。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
[0069]本文所用術(shù)語“治療”是指有需要的任何人或其它動物受試者的藥物療法。預(yù)期醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已對所述受試者進(jìn)行了身體檢查，所述從業(yè)人員給出了表明采用所述具體治療有益于所述人或其它動物受試者的健康的試驗性或決定性診斷。根據(jù)受試者的健康現(xiàn)狀，所述治療的時機(jī)和目的可在一個個體與另一個間變化。因此，所述治療可以是預(yù)防性的、治標(biāo)性的、針對癥狀的和/或治療性的。
[0070]就本發(fā)明而言，預(yù)防性、治標(biāo)性、針對癥狀的和/或治療性治療可代表本發(fā)明的各個方面。
[0071]本發(fā)明的配體可連同其它藥物(例如甲氨蝶呤、地塞米松和潑尼松)和/或其它生物藥物一起給予。
[0072]單價DR3抗體/配體可用重組技術(shù)產(chǎn)生。通常將編碼本發(fā)明的單價DR3抗體/配體的DNA序列插入重組載體。載體優(yōu)選為表達(dá)載體,其中DNA序列與DNA轉(zhuǎn)錄所需要的額外區(qū)段以及能夠指導(dǎo)克隆基因或cDNA在所需宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子有效連接。
[0073]在細(xì)胞攝取DNA后，使它們在合適的生長培養(yǎng)基中生長，通常為1-2天，以開始表達(dá)目標(biāo)基因。向其中導(dǎo)入編碼單價DR3抗體/配體的DNA序列的宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，包括酵母、真菌、細(xì)菌和高級真核細(xì)胞。用于本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞系的實例為C0S-1、幼倉鼠腎(BHK)和293。優(yōu)選的BHK細(xì)胞系為tk-tsl3 BHK細(xì)胞系，其可稱為BHK 570細(xì)胞。另外，本發(fā)明內(nèi)可使用多種其它細(xì)胞系，包括大鼠H印1、大鼠H印II> TCMK, NCTC 1469、CHO和DUKX細(xì)胞。
[0074]然后在允許單價DR3抗體/配體表達(dá)的條件下，將上述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后可從培養(yǎng)物中回收所得肽的全部或部分。然后可通過常規(guī)方法(包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞；通過鹽(例如硫酸銨)沉淀上清液或濾液的蛋白質(zhì)性組分；根據(jù)所述多肽的類型，通過多種層析法(例如離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析法等)純化)，從培養(yǎng)基中回收由細(xì)胞產(chǎn)生的單價DR3抗體/配體。
[0075]可采用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)以產(chǎn)生本發(fā)明的單價DR3抗體/配體。優(yōu)選在宿主雌性哺乳動物(優(yōu)選綿羊、山羊或牛)乳腺內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。也可采用在轉(zhuǎn)基因植物中的產(chǎn)生。表達(dá)可定向于特定器官，例如結(jié)節(jié)。
[0076]還可在上述產(chǎn)生的二價抗體的基礎(chǔ)上獲得單價DR3抗體，隨后進(jìn)行肽酶消化和所得Fab片段的分離。
[0077]隨后可對單價DR3抗體/配體進(jìn)行翻譯后修飾以獲得體內(nèi)循環(huán)半壽期延長的蛋白質(zhì)。
[0078]實施方案列表:
以下是本發(fā)明實施方案的列表。該實施方案列表并非限制性的，要了解本發(fā)明包括下列實施方案的任何組合。
[0079]實施方案1:一種單價拮抗性DR3抗體，其中所述單價抗體阻斷DR3與TLlA結(jié)合，其中呈其二價形式的所述單價抗體是阻斷DR3與TLlA結(jié)合的激動性抗體。
[0080]實施方案2:實施方案I的單價抗體，其中所述單價抗體不是具有W02011106707所示11H08抗體的⑶R序列(SEQ ID NO 14-15)的抗體。
[0081]實施方案3:實施方案1-2中任一個的單價抗體,其中所述單價抗體與親脂部分綴合。[0082]實施方案4:實施方案3的單價抗體，其中所述親脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪?；?，其中η為16-18。
[0083]實施方案5:實施方案3的單價抗體，其中所述親脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪酰基，其中η為15。
[0084]實施方案6:實施方案3-5中任一個的單價抗體，其中所述抗體與選自以下式(I)、
(II)> (III) > (IV)、(V)和(VI)的親脂部分綴合:
【權(quán)利要求】
1.一種單價拮抗性DR3抗體，其中所述單價抗體阻斷DR3與TLlA結(jié)合，且其中呈其二價形式的所述單價抗體是阻斷DR3與TLlA結(jié)合的激動性抗體。
2.權(quán)利要求1的單價抗體，其中所述單價抗體不是具有W02011106707所示11H08抗體的CDR序列(SEQ ID NO 14+15)的抗體。
3.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述單價抗體與親脂部分綴合。
4.權(quán)利要求3的單價抗體，其中所述親脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪?；?，其中η為16-18。
5.權(quán)利要求3的單價抗體，其中所述親脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪?；?，其中η為15。
6.權(quán)利要求3-5中任一項的單價抗體，其中所述抗體與選自以下式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的親脂部分綴合:
7.權(quán)利要求3-6中任一項的單價抗體，其中所述親脂部分通過親水間隔基與抗體重鏈中的天然存在的C239 (Kabat編號)半胱氨酸殘基連接。
8.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體與DR3上的表位結(jié)合，其中所述表位包含SEQ ID NO I的143和/或L45。
9.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體與DR3上的表位結(jié)合，其中所述表位包含SEQ ID NO I所示氨基酸G37-L45的至少一個和氨基酸L57-A59的至少一個。
10.權(quán)利要求9的單價抗體，其中所述表位包含SEQID NO I所示的氨基酸G37-L45和氨基酸L57-A59。
11.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述配體是Fab片段。
12.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述單價抗體以低于InM的解離常數(shù)結(jié)合 DR3。
13.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體與人DR3的CRDl結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
14.一種單價抗體，其包含SEQ ID NO 10所示的3個⑶R序列和SEQ ID NO 11所示的3個⑶R序列。
15.一種單價抗體，其中所述抗體包含人構(gòu)架、SEQ ID NO 16所示⑶R3序列和SEQ IDNO 17所示CDR3序列以及重鏈的“S49A”回復(fù)突變。
16.權(quán)利要求15的單價抗體，其中所述抗體包含SEQID NO 16所示的3個⑶R序列和SEQ ID NO 17所示的3個⑶R序列。
17.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體與“0228”單價抗體競爭結(jié)合人DR3，其中0228重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示，0228輕鏈的氨基酸序列如SEQ IDNO 17所示。
18.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體降低RA患者滑液細(xì)胞中的IFN- Y釋放，其中所述滑液細(xì)胞用TLlA共刺激。
19.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體降低CD患者腸活檢樣品固有層單核細(xì)胞(LPMC)的一種或多種細(xì)胞因子的釋放，其中所述細(xì)胞因子選自:TNF-a、IL-6、GM-CSF和IFN- Y，且其中所述LPMC用TL1A、IL-12和IL-18共刺激。
20.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體降低CD4+T細(xì)胞中一種或多種細(xì)胞因子的釋放，其中所述細(xì)胞因子選自:TNF-a、11^-6、61^5?和正^￥，且其中所述1'細(xì)胞用TLlA共刺激。
21.前述權(quán)利要求中任一項的單價抗體，其中所述抗體是IgG4型抗體。
22.一種藥物組合物`，其包含權(quán)利要求1-21中任一項的抗體。
23.用于治療炎性疾病的權(quán)利要求1-21中任一項的單價抗體或權(quán)利要求22的藥物組合物的用途。
24.用于治療克羅恩病(CD)的權(quán)利要求1-21中任一項的單價抗體或權(quán)利要求22的藥物組合物的用途。
25.用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的權(quán)利要求1-21中任一項的單價抗體或權(quán)利要求22的藥物組合物的用途。
【文檔編號】C07K14/705GK103517918SQ201280011136
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月1日
【發(fā)明者】M.D.安德森, P.L.諾爾德拜, K.克賈爾加爾德, S.N.格雷爾, A.格魯勒, J.布查爾特, H.S.安德森, S.帕德賈爾, J.卡斯特魯普, K.哈亞坎斯森, L.霍努姆, B.弗里伊德里奇森, D.鮑恩斯加爾德 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司