一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備丁二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本專利設(shè)及一種使用甘草渣作為生物發(fā)酵的碳源制備下二酸的方法，屬于生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘草又名蜜草，豆科植物，自古就有"靈草"，"國老"等美名。為多年生草本植物， 可入藥。
[0003] 甘草渣是甘草中有用物質(zhì)被提取后剩余的殘渣，它含有豐富的纖維素、半纖維素、 多糖類物質(zhì)。隨著甘草的大面積開發(fā)，甘草渣也逐漸成為危害生態(tài)環(huán)境的又一物質(zhì)。對甘 草渣的合理利用越來越引起人們的重視。
[0004] 甘草渣中含有豐富的纖維素、半纖維素，可W經(jīng)過一定的處理，并使用纖維素酶水 解后可作為發(fā)酵原料，運樣既可W解決廢棄甘草渣對生態(tài)的破壞問題，同時又可W最大程 度提高甘草的利用價值。
[0005] 下二酸（succinicacid)又名班巧酸，廣泛存在于生物體中，是一種重要的二元有 機簇酸，也是微生物Ξ簇酸循環(huán)糖酵解途徑的重要代謝產(chǎn)物。下二酸在很多領(lǐng)域有著廣泛 的應(yīng)用，可用于合成可降解塑料，醫(yī)藥領(lǐng)域的鎮(zhèn)定劑，食品工業(yè)的食品添加劑，表面活性劑 等。因此，下二酸的高效、低成本的生產(chǎn)方法也成為近年來研究的熱點，其中采用生物發(fā)酵 的方法制備下二酸是重中之重。
[0006] 降低生物發(fā)酵法下二酸制備成本的一個主要方向是使用低廉的碳源，如何有效的 利用自然界的生物資源，既能滿足人們正常的生活需求，又能降低對環(huán)境的污染是一個非 常有意義的課題。無疑，綜合利用甘草渣將對企業(yè)和社會具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了克服W上不足，提供一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備下二 酸的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的運樣實現(xiàn)： 一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備下二酸的方法，其制備方法如下： (1)本發(fā)明甘草渣的預處理： ① 按1:10的質(zhì)量比稱取干燥的甘草渣和摩爾濃度為1~5%的稀硫酸水溶液； ② 將甘草渣在50~70°C的的稀硫酸水溶液中浸泡1-3小時； ③ 浸泡結(jié)束后，將固體濾出，使用摩爾濃度為Imol/L的氨氧化鋼水溶液調(diào)整PH值為 4. 0-4. 5,溫度調(diào)整至38-40度。
[0009] ④加入纖維素酶進行水解，水解時間為24小時，得甘草渣水解液，所述甘草渣水 解液固液比為3-5% ;將甘草渣水解液進行濃縮，濃縮至總糖含量達到350g/l，得甘草渣水 解糖液。
[0010] (2)配置發(fā)酵培養(yǎng)基 采用去離子水配制發(fā)酵培養(yǎng)基lOOmU發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分按質(zhì)量濃度計為：蛋白 腺5g/l，玉米漿lOg/l，總還原糖含量lOOg/l，憐酸二氨鐘2. 5g/l，憐酸氨二鋼2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸鋼1邑/1，用去離子水配制，其中總還原糖取自甘草渣水解糖液。
[0011] (3)一級培養(yǎng) 將菌種放入種子培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為14h; (4)二級培養(yǎng) 一級培養(yǎng)后接種子培養(yǎng)基，接種量為4%，培養(yǎng)時間達到化后得培養(yǎng)液。
[001引 （5)S級培養(yǎng) 將培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中二氧化碳的通入量為0. 5~化/min,發(fā)酵過程中 流加摩爾濃度為Imol/L的氨氧化鋼溶液維持發(fā)酵系統(tǒng)的抑值在5. 5~6. 5之間，溫度為 37~39°C，發(fā)酵時間為4她，發(fā)酵結(jié)束時鋼離子濃度達到1. 5%，發(fā)酵結(jié)束后得下二酸。
[0013] 上述一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備下二酸的方法，其中，優(yōu)選地，所述發(fā)酵過 程中流加摩爾濃度為Imol/L的氨氧化鋼溶液維持發(fā)酵系統(tǒng)的抑值為6.0~6.2。
[0014] 上述一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備下二酸的方法，其中，所述使用的纖維素 酶為諾維信纖維素酶Carezyme?4500L。
[0015] 上述一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備下二酸的方法，其中，所述使用的菌株為 班巧酸放線桿菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593。
[0016] 上述一種使用甘草渣作為發(fā)酵原料制備下二酸的方法，其中，發(fā)酵使用的碳源為 甘草廢渣經(jīng)過處理得到的纖維素、半纖維素水解后的產(chǎn)物。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為： 通過對甘草渣的預處理，將甘草渣內(nèi)的木質(zhì)素去除，采用酸解和酶解將半纖維素和纖 維素轉(zhuǎn)化為發(fā)酵下二酸所需的糖源，運對于降低生物法制備下二酸的原料成本和降低甘草 廢渣對于環(huán)境的污染有極大的作用。
【具體實施方式】
[0018] 實施例中所用到的甘草渣購自于甘肅寧縣恒瑞康藥業(yè)有限責任公司。對甘草渣進 行檢測，其檢測主要項目包括纖維(包括半纖維素）含量，蛋白含量，灰分含量，水含量。
[0019] 蛋白含量的測定，采用微量凱氏定氮法，參考GB/T5009. 5-1985。
[0020] 纖維的測定，是通過將干燥后的定量的甘草渣在濃硫酸和重銘酸鐘的混合液中進 行氧化分解，并使用硫代硫酸鋼反滴過量的高儘酸鐘的方法。
[0021] 水分的測定，采用直接干燥法，參考GB/T-14769-93。
[0022] 灰分的測定，參考GB5009. 4-85 根據(jù)W上方法的檢測，甘草渣（干）含有纖維及半纖維素23.6%，蛋白含量為7.5%，灰 分24. 2%，其他含量(包括木質(zhì)素）為44. 7%。
[0023] 實驗中發(fā)現(xiàn)，甘草渣纖維素與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)較為致密，預處理使用19?^5%稀硫酸比 較適合。
[0024] 本發(fā)明實施例中所使用的TSB培養(yǎng)液為膜蛋白腺大豆肉湯。
[00巧]本發(fā)明所用菌株班巧酸放線桿菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593， 已在中國專利化200610038113. 6中公開，公開號CN1814747A，公開日2006年8月9日。
[0026] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0027] 實施例1 (1)本發(fā)明甘草渣的預處理： ① 按稱取1.2kg干燥無水的甘草渣和12kg摩爾濃度為5%的稀硫酸水溶液； ② 將甘草渣在70°C的的稀硫酸水溶液中浸泡2小時； ③ 浸泡結(jié)束后，將固體濾出，使用摩爾濃度為Imol/L的氨氧化鋼水溶液調(diào)整PH值為 4.0,溫度調(diào)整至40度。
[0028] ④加入纖維素酶進行水解，水解時間為24小時，得甘草渣水解液，所述甘草渣水 解液固液比為5%;使用液相色譜檢測纖維素酶水解液中葡萄糖含量為1. 9%，木糖含量約 為0. 2%，纖維素糖化率達到了 50%W上；將甘草渣水解液進行濃縮，濃縮至總糖含量達到 350g/L〇
[0029] (2)配置種子培養(yǎng)基 采用去離子水配制種子培養(yǎng)基lOmU種子培養(yǎng)基的組成成分按質(zhì)量濃度計為：蛋白腺 5邑/1，玉米漿20g/l，葡萄糖20g/l，憐酸二氨鐘1. 5g/l，憐酸氨二鋼1. 5g/l，酵母膏5g/L。
[0030] (3)配置發(fā)酵培養(yǎng)基 采用去離子水配制發(fā)酵培養(yǎng)基lOOmU發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分按質(zhì)量濃度計為：蛋白 腺5g/l，玉米漿lOg/l，總還原糖含量lOOg/l，憐酸二氨鐘2. 5g/l，憐酸氨二鋼2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸鋼1邑/1，用去離子水配制，其中總還原糖取自甘草渣水解糖液。
[0031] (4)將種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基分別放入滅菌鍋中，在12rC的條件下滅菌 20min，將菌種放入TSB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，接種子培養(yǎng)基，接種量為4%，培養(yǎng)時間達到化后 得培養(yǎng)液。
[0032] (5 )將培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中二氧化碳的通入量為化/min，發(fā)酵過程 中流加摩爾濃度為Imol/L的氨氧化鋼溶液維持發(fā)酵系統(tǒng)的抑值在6. 0~6. 1之間，溫度為 37~39°C，發(fā)酵時間為4她，發(fā)酵結(jié)束時鋼離子濃度達到1. 5%，發(fā)酵結(jié)束后得下二酸。
[003引實施例2 (1)本發(fā)明甘草渣的預處理： ① 按稱取1kg干燥無水的甘草渣和10kg摩爾濃度為2%的稀硫酸水溶液； ② 將甘