管中，-80°C 冰箱或液氮罐中保存，備用。細胞冷凍保存和復(fù)蘇的方法，參考各種臨床使用細胞的操作流 程；
[0134] 回輸部分細胞或冷凍保存復(fù)蘇的細胞，用生理鹽水離屯、洗涂3-4次，用祀細胞與 所述的雙特異性抗體活化的T細胞進行細胞凝集反應(yīng)檢測雙特異性抗體是否洗涂干凈， 當凝集反應(yīng)為陰性時，表示制備的所述的雙特異性抗體活化的T細胞中不含有雙特異性抗 體。檢測結(jié)果顯示本實施例制備的所述的雙特異性抗體活化的T細胞中不含有雙特異性抗 體。
[0135] 所述的雙特異性抗體活化的T細胞安全性檢測和細胞表型參考CIK相應(yīng)的內(nèi)容和 方法，檢測結(jié)果表示，本實施例制備的所述的雙特異性抗體活化的T細胞安全性同實施例 1，細胞表型為CD3+97 %，CD8+85 %，CD56+38 %，CD19W%。
[0136] 本實施例提供了所述的雙特異性抗體活化的T細胞制備用于免疫治療、預(yù)防或治 療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，具體如下：將所述的雙特異性抗體活化 的T細胞加入生理鹽水中，并加入適量的白蛋白和IL-2等添加劑，制成細胞懸液，即得。
[0137] 本實施例還提供了所述的雙特異性抗體活化的T細胞聯(lián)合不同類型的雙特異性 抗體制備用于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，具體 如下：采用生理鹽水洗涂所述的雙特異性抗體活化的T細胞，然后向其中加入適量的具有 CD3高親和力的特定祀標的雙特異性抗體，解育5分鐘W上，然后再用生理鹽水洗涂，收集 細胞，加入生理鹽水中，并加入適量的白蛋白和IL-2等添加劑，制成細胞懸液，即得。 陽13引效果例
[0139] W實施例5制備的雙特異性抗體活化的T細胞為檢測對象，W用經(jīng)典的培養(yǎng)方法 制備的CIK細胞做對照。制備對照組CIK細胞的方法，具體包括如下步驟：
[0140] Sl、采集外周血50ml，在離屯、機于2000rpm下離屯、10分鐘將細胞和血漿分離，取出 所述血漿于56°C下水浴30分鐘滅活補體，收集所述細胞和血漿，備用； 陽141] S2、將所述步驟Sl中獲得的細胞用生理鹽水稀釋成細胞懸液，備用，然后取50ml 離屯、管2支，每只試管加入15-20ml淋己細胞分層液（比重1. 077-1. 078 ;奧地利PAA公 司生產(chǎn)），將上述細胞懸液緩慢地加到所述淋己細胞分層液上面，并保證兩種液體之間的界 面清晰，然后在2500rpm下離屯、分離20分鐘，然后吸取界面的細胞層，采用生理鹽水洗涂3 次，獲得的單個核細胞，備用；
[0142] S3、將所述步驟S2中獲得的單個核細胞加入適合淋己細胞生長的無血清培養(yǎng)液 中，調(diào)整所述細胞終濃度為2XlOVml，加入CD3單克隆抗體的終濃度為20ng/ml，加入的所 述血漿的終濃度為2%，加入的所述細胞因子為IL-2和IFN-丫，所述IL-2終濃度為200U/ ml,所述IFN-丫的終濃度為500U/ml，在37°C，5%C〇2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16天，在 此期間，補充所述IL-2、所述IFN-丫和所述步驟Sl中收集的血漿，維持所述血漿的終濃度 為2%，所述比-2終濃度為200U/ml，所述IFN-丫的終濃度為500U/ml，每間隔1-3天補充 5-200ml所述無血清培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)細胞，采用生理鹽水離屯、洗涂3次，獲得所述的CIK細 胞，即得。 陽143] -、上述的雙特異性抗體活化的T細胞和CIK對照的效應(yīng)T細胞的增殖能力的檢 測方法，包括如下步驟：
[0144] (1)將上述細胞分別培養(yǎng)72h，即可見細胞沉于培養(yǎng)瓶的底部，呈較為密集的集落 狀態(tài)，培養(yǎng)9化后集落變大。對培養(yǎng)12-14天的細胞進行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞體 積增大，呈楠圓形或不規(guī)則形，細胞核大多為楠圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突 起，每個細胞可見1個小核仁，呈深藍色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核 處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形。取培養(yǎng)12-14天的細胞100y1，加入100yI的0. 4%臺 吩藍染色液，活細胞不染色，死細胞染成藍色，顯微鏡下計數(shù)。結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的細胞 活力大于98%。
[0145] (2)在第0、3、6、9、12、15、18、21天分別用細胞計數(shù)板和細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。選 用抗CD3-FITC和CD19-陽對細胞進行標記，然后進行流式細胞儀檢測，最后分析CD3陽性 等陽性細胞的比例，并結(jié)合細胞計數(shù)算出所占比例，結(jié)果如表1所示，結(jié)果說明本發(fā)明制備 的T細胞是安全無毒的，同時也是高效擴增的T細胞。 陽146] 二、上述的雙特異性抗體活化的T細胞和CIK對照的免疫表型檢測方法，包括如下 步驟：
[0147] 取第14天的細胞，用PBS緩沖液洗涂2次，調(diào)整細胞密度為1XioVml,每個 檢測管內(nèi)分別加入100y1細胞懸液，實驗管分為2管，其中一管加入巧光標記抗體為抗 CD3-陽CY5. 5、CD4-門TC、和CD19-PE，另一管加入抗CD3-陽CY5. 5、CD8-FITC和CD56-PE，室 溫避光解育30min，用PBS緩沖液洗涂3次后，再用200yIPBS緩沖液重懸細胞，最后用流式 細胞儀進行檢測并分析，結(jié)果如表1所示，說明本發(fā)明制備的T細胞是WCD3陽性CTL為主 要細胞的異質(zhì)性細胞群體。
[0148] 表1所述的雙特異性抗體活化的T細胞和陽性對照的表型和增殖
[0150] S、上述的雙特異性抗體活化的T細胞和陽性對照對腫瘤細胞殺傷能力檢測方 法，包括如下步驟： 陽151] (1)取所述雙特異性抗體活化的T細胞度AAT)和CIK對照，檢測對K562腫瘤細胞 的殺傷活性。 陽巧2] 似調(diào)整K562(所述K562由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供）的細胞密度為IXioVml，每孔 500 ^1，24孔板，按效祀比度441'(或(：11(對照）：祀細胞）1:10、1:3、1:1、3:1、10:1、30:1、 100 :1的比例與BAAT(或CIK對照）細胞混合，同時設(shè)置單獨祀細胞（腫瘤細胞）對照、單 獨BAAT細胞（效應(yīng)細胞）對照、單獨CIK對照和單獨培養(yǎng)基做空白對照。 陽153] (3)置于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時后，收集細胞，離屯、，棄 上清，重新懸浮細胞，每孔加入50y1的PI溶液（所述PI溶液美國CIGMA公司生產(chǎn)）巧Oug/ml),再解育15分鐘，然后用流式細胞檢測祀細胞的巧光細胞數(shù)量，計算出比例，即為殺傷 細胞比例 陽154]表2雙特異性抗體活化的T細胞和CIK對照對腫瘤細胞化562)的殺傷效率陽1巧]

陽156] 由上述表1-2的結(jié)果可知，實施例5制備的殺傷性T細胞的活性、增殖能力和殺傷 活性都顯著，并且為非特異性的殺傷細胞，起著殺滅血IC分子低表達的腫瘤細胞，并長期對 腫瘤產(chǎn)生細胞免疫監(jiān)視作用，防止腫瘤再次復(fù)發(fā)，有希望根除腫瘤。 陽157] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可W做出其它不同形式的變化或 變動。運里無需也無法對所有的實施方式予W窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權(quán)項】
1. 一種雙特異性抗體活化的T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 取外周全血進行離心，分離所述外周血中的細胞和血漿，然后滅活所述血漿中的補 體，收集所述細胞和血漿，備用； 52、 將所述步驟S1中獲得的細胞稀釋成懸液，分離出單個核細胞，然后洗滌，備用； 53、 將所述步驟S2中獲得的單個核細胞加入無血清培養(yǎng)液中，向所述無血清培養(yǎng)液中 加入雙特異性抗體、靶細胞、能夠維持細胞生長、增殖和分化的細胞因子和所述步驟S1中 收集的血漿，隨后按照常規(guī)方法進行孵育培養(yǎng)，收集培養(yǎng)細胞，采用生理鹽水離心洗滌，即 得所述的雙特異性抗體活化的Τ細胞； 其中，所述雙特異性抗體具備活化Τ細胞的功能，包含至少一個靶向Τ細胞抗原表位的 結(jié)合位點和至少一個靶向靶細胞表面抗原表位的結(jié)合位點；所述雙特異性抗體與所述Τ細 胞抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù)大于1X10 7,與所述靶細胞表面抗原表位的結(jié)合的解離系數(shù) 小于5X10 9;所述雙特異性抗體分子量為小于50KD。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Τ細胞抗原為CD3和/或CD28 ;所述 靶細胞抗原為CD19、CD20和/或腫瘤、微生物的特異性抗原靶點。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶細胞為滅活的Β細胞、癌細胞 或病原體細胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中，所述單個核細 胞的終濃度為（0. 5-2)X106/ml，加入的所述雙特異性抗體的終濃度為0.lng/ml-1000ng/ ml，加入的所述靶細胞的終濃度為（0. 001-50)X106/ml，加入的所述血漿的終濃度為 0· 1% -10%〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中，加入的所述 細胞因子為IL-2和IFN-γ，所述IL-2終濃度為50-2000U/ml，所述IFN-γ的終濃度為 50-3000U/ml〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中，所述孵育培養(yǎng) 的步驟中還包括補充培養(yǎng)液的步驟，所述培養(yǎng)液包括所述IL-2、所述IFN-γ和所述步驟S1 中收集的滅活血漿。7. -種根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法制備得到的雙特異性抗體活化的Τ細胞。8. -種根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的雙特異性抗體活化的Τ細胞或其聯(lián)合雙特異性 抗體在制備用于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物中的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的雙特異性抗體活化的Τ細胞制備用 于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，包括如下步驟：將 所述的雙特異性抗體活化的Τ細胞加入生理鹽水中，并加入添加劑，制成細胞懸液，即得。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的雙特異性抗體活化的Τ細胞聯(lián)合 不同抗原靶點的雙特異性抗體制備用于免疫治療、預(yù)防或治療癌癥或治療微生物感染所致 疾病的藥物的方法，包括如下步驟：取所述的雙特異性抗體活化的Τ細胞進行洗滌，然后向 其中加入與Τ細胞抗原具有高親和力的特定靶標的雙特異性抗體，孵育培養(yǎng)，然后洗滌，收 集細胞，加入生理鹽水中，并加入添加劑，制成細胞懸液，即得。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙特異性抗體活化的T細胞及制備方法與應(yīng)用，包括如下步驟：S1、取外周血進行離心，分離細胞和血漿，然后滅活血漿中的補體，收集細胞和血漿，備用；S2、將獲得的細胞稀釋成懸液，分離出單個核細胞，洗滌，備用；S3、將獲得的單個核細胞加入無血清培養(yǎng)液中，加入雙特異性抗體、靶細胞、細胞因子和血漿，隨后按照常規(guī)方法進行孵育培養(yǎng)，收集培養(yǎng)的細胞，采用生理鹽水離心洗滌，獲得所述的雙特異性抗體活化的T細胞；所述雙特異性抗體具備活化T細胞的功能，雙特異性抗體與T細胞表面抗原的解離系數(shù)大于1×10-7，與靶細胞表面抗原的解離系數(shù)小于1×10-9；雙特異性抗體分子量為小于50KD；通過上述方法制備得到雙特異性抗體活化的T細胞。
【IPC分類】A61K39/395, C12N5/0783, A61P35/00, A61K35/17, A61P31/00
【公開號】CN105296421
【申請?zhí)枴緾N201510828606
【發(fā)明人】高岱清, 朱化星, 楊兆勇, 高天一, 孫偉紅, 朱丹妮, 魏曉芳, 郭慶明, 汪康游
【申請人】高岱清, 高天一
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月24日