一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其在培養(yǎng)巨核祖細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其在培養(yǎng)巨核祖細(xì)胞中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨核細(xì)胞祖細(xì)胞（megakaryo巧teprogenitorcell)是一種使人們產(chǎn)生巨核細(xì)胞 的細(xì)胞，它是從骨髓祖（CRJ-GEMM)而得，簡稱巨核祖細(xì)胞。巨核祖細(xì)胞存在于IL-6R-細(xì) 胞群中，而CD34+細(xì)胞可分為兩個(gè)細(xì)胞亞群，表達(dá)比-6R和不表達(dá)比-6R，比-6R+細(xì)胞能 被刺激形成粒-巨隧細(xì)胞、淋己細(xì)胞和粒細(xì)胞，而IL-6R-細(xì)胞當(dāng)被給予IL-6/SIL-6R時(shí)可 形成紅系及巨核系細(xì)胞。造血干細(xì)胞首先分化生成巨核系祖細(xì)胞，也稱巨核系集落形成單 位（colonyformingunit-megakaryo巧te,C即-Meg)。巨核系祖細(xì)胞分化成為成熟的巨核 細(xì)胞后，其邊緣部分破裂脫落，形成血小板，每個(gè)巨核細(xì)胞能生成1000-6000個(gè)左右的血小 板；巨核細(xì)胞雖然在骨髓的造血細(xì)胞中為數(shù)最少，僅占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0. 05%，但其 產(chǎn)生的血小板卻對(duì)機(jī)體的止血功能極為重要。
[0003] 如今惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，目前主要是通過手術(shù)治療并結(jié) 合放化療。當(dāng)患者在接受高劑量放化療后，骨髓造血功能低下，常會(huì)出現(xiàn)血小板減少，嚴(yán)重 時(shí)會(huì)造成患者出血死亡。臨床上常采用輸注血小板，但血小板來源有限，存活期短，體外易 失活，且反復(fù)輸注血小板易導(dǎo)致輸注無效并增加輸血傳播疾病的危險(xiǎn)。
[0004] 1997年，Bertolini等從外周血中分離CD34+，體外誘導(dǎo)擴(kuò)增巨核細(xì)胞7天，用于 患者血小板恢復(fù)。結(jié)果顯示，體外誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞可替代血小板輸入，或減少血小板輸入次 數(shù)。2000年，Paquette等將體外動(dòng)員的外周血細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增巨核細(xì)胞9天后，用于改 善大劑量化療的乳腺癌病人中性粒細(xì)胞減少、血小板減少和貧血癥狀。VandenOudenrijn 等對(duì)外周血、骨髓、廝血來源的CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)廝血來源的CD34+具有 更強(qiáng)的巨核細(xì)胞擴(kuò)增能力。由于廝血造血干細(xì)胞移植后血小板的恢復(fù)較外周血、骨髓慢，因 此采用體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞，然后輸注患者體內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)育成血小板， 縮短血小板的恢復(fù)期。將巨核祖細(xì)胞用于惡性腫瘤的治療是目前的研究熱點(diǎn)，
[0005] 但是，目前的體外培養(yǎng)巨核祖細(xì)胞的方法增殖速度較慢，且所得細(xì)胞中所包含的 巨核祖細(xì)胞的數(shù)量并不多，因此，研究開發(fā)產(chǎn)量高，純度大的巨核祖細(xì)胞的方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其在培養(yǎng)巨核祖 細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液能夠用于巨核祖細(xì)胞的培養(yǎng)，且將其用于巨核祖 細(xì)胞的培養(yǎng)所得細(xì)胞數(shù)量大，其中巨核祖細(xì)胞的含量較高。
[0007] 本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、WNT3a蛋白、膜島素、Flt-3L白蛋白、 非必需氨基酸、血小板生成素、干細(xì)胞生長因子，白介素3和白介素6。
[0008] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，WNT3a蛋白、膜島素、Flt-3L白蛋白、非必需氨基酸、血 小板生成素、干細(xì)胞生長因子，白介素3和白介素6的質(zhì)量比為（12~35):(12XIO3~ 35X103):(20 ~45):(30X103~ 100X103):(30X103~80X103):(15 ~50):(10~40): (10 ~40) :(10 ~50)。
[0009]Wnt信號(hào)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要的作用，控制著細(xì)胞的生長和發(fā)育， WNT3a蛋白是Wnt家族的成員之一，實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化喲一定的調(diào)控 作用。
[0010] 膜島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。細(xì)胞培 養(yǎng)基中添加膜島素能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，保持細(xì)胞活性。
[0011]FMS樣酪氨酸激酶 3 配體（fetallivertyrosinekinaserec巧torligand, Flt-3L)是W中強(qiáng)大的造血細(xì)胞生長因子，在干細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育過程中起著重 要的作用。
[001引白蛋白（又稱清蛋白，a化umin，A化）是血漿中含量最多、分子最小、溶解度大、功 能較多的一種蛋白質(zhì)，具有保護(hù)血細(xì)胞保護(hù)和調(diào)節(jié)凝血的功能，有利于防止細(xì)胞成團(tuán)。
[0013]非必需氨基酸（non-essentialaminoacid,NEAA)，包含7種細(xì)胞培養(yǎng)所需非必 需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酷胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、徑脯氨酸。非必需氨基 酸的添加能夠增加細(xì)胞的繁殖力，延長細(xì)胞的生存時(shí)間。
[0014] 血小板生成素?zé)艉鏾mboietinTP0)又名巨核細(xì)胞生長因子，能夠調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞 演化成成熟巨核細(xì)胞增殖和分化；
[0015] 干細(xì)胞生長因子（SC巧是由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白，它 是一種重要的造血細(xì)胞因子，主要作用于早期的造血干細(xì)胞和原始造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增 殖和分化，在維持造血細(xì)胞存活，促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長發(fā)育 中起著重要作用。
[0016] 白細(xì)胞介素-3,是白細(xì)胞介素家族重要成員之一，簡稱白介素3 (IL-3)，又名多向 性集落刺激因子（multi-CSF)，是一種細(xì)胞因子，屬于白細(xì)胞介素的一種。它是由T淋己細(xì) 胞所產(chǎn)生，能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。
[0017] 白細(xì)胞介素-6,簡稱白介素6(IL-6)，屬于白細(xì)胞介素的一種。它是由纖維母細(xì) 胞、單核/巨隧細(xì)胞、T淋己細(xì)胞、B淋己細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、W及多種瘤細(xì)胞所產(chǎn)生。 白介素6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。
[0018]本發(fā)明將上述組分復(fù)配，能夠給細(xì)胞提供更加豐富的營養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提 供的培養(yǎng)液用于巨核祖細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠選擇性的促進(jìn)巨核祖細(xì)胞的生長和增殖。W本發(fā) 明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)巨核祖細(xì)胞20天，細(xì)胞數(shù)量增殖400倍~450倍，所得細(xì)胞中CD34+、 CD41+雙陽性表達(dá)率不低于35%。該效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基（p<0. 01)。
[0019] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，膜島素為人膜島素。
[0020] 在一些實(shí)施例中，人膜島素為重組人膜島素。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，白蛋白為牛血清白蛋白。
[0022] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中不含有牛血清，降低了異源血清所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。
[0023] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，培養(yǎng)液中各組分的濃度分別為：
[0024]
[00 巧]
[0026] 在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)液中各組分的濃度分別為：
[0027]
[002引在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)液中各組分的濃度分別為： [0029] WNT3a蛋.白' 20ng/ml 膚島素 200?ml 巧t-3L 35ng/ml 食蕾# 60mg/ml 非必需氨基酸 60mg/ml 血小板生成素 40ng/ml 干細(xì)胞生長因子 2 5ng/ml 白介素3 25ng/ml 白介素6 30ng/ml
[0030] 在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)液中各組分的濃度分別為：
[0031] WNT3a蛋白 35ng/nil 腺島素 35mg/inl Flt-3L 45ng/ml
[0032] 白蛋白 lOOrng/ml 非必需氨基酸 8 0mg/ml 血小板生成素 50iig/ml 干細(xì)胞生長巧子 40ng/ml 白介素3 40ng/ml 自奔薰6 SOng/ml
[0033] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMEM培養(yǎng)基。
[0034] 利用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)白膜層細(xì)胞，20天后細(xì)胞數(shù)量增殖400~450倍，其 中CD34+XD41+雙陽性表達(dá)率不低于35%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠選 擇性的促進(jìn)巨核祖細(xì)胞的生長，從而提高所得細(xì)胞中巨核祖細(xì)胞的含量。
[0035] 本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液在巨核祖細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0036] 本發(fā)明還提供了巨核祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0037]