免疫應答的魚類啟動子及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于魚類基因工程技術領域，特別涉及一種免疫應答的魚類啟動子及其應 用，所述魚類啟動子能夠在多種魚類細胞內(nèi)啟始下游基因轉(zhuǎn)錄，魚類啟動子活性在免疫誘 導下顯著增強，可應用于抗病轉(zhuǎn)基因載體構建。
【背景技術】
[0002] 伴隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的興起，多種傳染性疾病在高密度養(yǎng)殖群體中時有爆 發(fā)，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。病害頻發(fā)已成為當前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的嚴峻考驗。利用基因 工程技術，將特異或非特異性免疫基因（如免疫球蛋白或抗菌肽等）轉(zhuǎn)入養(yǎng)殖魚類體內(nèi)，培 育疾病抗性品種，是防控養(yǎng)殖病害的有效途徑之一。
[0003]啟動子是所有轉(zhuǎn)基因策略中必備的轉(zhuǎn)基因元件，轉(zhuǎn)基因載體中負載的外源目的基 因必須置于有效的啟動子介導之下，才能夠在宿主細胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄表達。早期的魚類轉(zhuǎn)基 因模型使用來自哺乳動物的啟動子，可能引起生物倫理爭議，消費者食用時也會有顧慮，因 此"全魚"轉(zhuǎn)基因模型的概念應運而生，即所有轉(zhuǎn)基因元件均來源于魚類基因組。
[0004] 用于基因工程的啟動子常根據(jù)作用方式及功能分為三類：組成型啟動子（在全部 或多數(shù)組織中保持持續(xù)的轉(zhuǎn)錄活性），特異型啟動子（在特定的組織或發(fā)育時期具有轉(zhuǎn)錄 活性），和誘導型啟動子（受特定物理或化學信號調(diào)控）。目前已報道用作轉(zhuǎn)基因元件的魚 類啟動子多為組成型，如鯉β-肌動蛋白、大馬哈魚金屬硫蛋白、美洲大綿躕抗凍蛋白啟動 子等。就抗病轉(zhuǎn)基因魚而言，使用組成型啟動子并不是最優(yōu)方案，在未接觸病原的魚體內(nèi)長 期大量表達外源免疫基因并無必要，還可能因消耗能量而造成生長負擔。使用免疫誘導型 啟動子，則可介導外源基因僅在魚體遭受免疫脅迫時出現(xiàn)高表達。
[0005] 綜上所示，亟待有一種免疫誘導型啟動子獲得應用，以保證魚體遭受免疫脅迫時 才出現(xiàn)外源免疫基因的高表達，在未接觸病原的魚體內(nèi)，外源免疫基因不發(fā)生表達或僅維 持低水平表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種免疫應答的魚類啟動子及其應用，通過將本發(fā)明 提供的魚類啟動子構建出真核表達載體，并將該真核表達載體顯微注射入宿主細胞內(nèi)，以 保證魚體在遭受免疫脅迫時才出現(xiàn)外源免疫基因的高表達，在未接觸病原的魚體內(nèi)，外源 免疫基因不發(fā)生表達。
[0008] 為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種免疫應答的魚類啟動 子，其特征在于，所述魚類啟動子的多核苷酸序列為（a)或（b)所示：
[0009] (a)SEQIDNo.1所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)與（a)中多核苷酸序列根據(jù)堿基互補配對原則互補的多核苷酸序列；以及
[0011] (c)在高等嚴緊條件下能夠與上述（a)或（b)的多核苷酸序列雜交的核苷酸序 列；
[0012] (d)對上述（a)或（b)所示多核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加 修飾
[0013] 的核苷酸序列；
[0014] (e)與上述（a)或（b)所示多核苷酸序列具有至少90%同一性的多核苷酸序列。
[0015] 優(yōu)選的是，其中，所述魚類啟動子來源于鯉魚。
[0016] 免疫應答的魚類啟動子在構建真核表達載體中的應用。
[0017] -種應用免疫應答的魚類啟動子構建真核表達載體的方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0018] 步驟一、應用特異引物I對篩選獲得包含目的基因的文庫克??；
[0019] 步驟二、將包含目的基因的文庫克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA;
[0020] 步驟三、以質(zhì)粒DNA為模板應用特異引物II進行引物步移法測序獲得目的基因的 上游調(diào)控基因；
[0021] 步驟四、應用特異引物III以上游調(diào)控基因為模板擴增魚類啟動子；以及
[0022] 步驟五、應用所述魚類啟動子構建真核表達載體。
[0023] 優(yōu)選的是，其中，所述特異引物I的多核苷酸序列如SEQIDN0. 2和SEQIDN0. 3 所示。
[0024] 優(yōu)選的是，其中，所述上游調(diào)控基因的多核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0025] 優(yōu)選的是，其中，所述特異引物II的多核苷酸序列如SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6和 SEQIDNO. 7 所示。
[0026] 優(yōu)選的是，其中，所述特異引物III的多核苷酸序列如SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9 所示。
[0027] 本發(fā)明鯉基因啟動子為一種免疫誘導型啟動子。Ras-associated binding-GTPases(Rab)基因?qū)儆赗as超家族，編碼單體GTP結(jié)合蛋白，以分子開關的形式參 與膜泡轉(zhuǎn)運，是細胞內(nèi)的一種信號分子。Rab家族多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)出免疫應答特征，在病 原菌脅迫處理后基因轉(zhuǎn)錄水平大幅度上調(diào)。這一現(xiàn)象在多個物種，包括水產(chǎn)物種中得到實 驗證實，如鯉、溝鯰、美國紅魚、日本囊對蝦等。Rab基因家族成員間在組織分布、細胞定位、 免疫應答強度方面存在差異，其中鯉Rabla-3基因的轉(zhuǎn)錄模式較適宜抗病轉(zhuǎn)基因魚對外源 免疫基因轉(zhuǎn)錄的需求。
[0028] 在健康鯉魚體內(nèi)，Rab1a-3基因在腦、皮膚、鰓、血液、頭腎、肌肉、肝、脾、腸、心臟組 織內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)錄，但普遍轉(zhuǎn)錄水平較低，而鰓、頭腎中的表達量顯著高于其他組織。當魚體遭 受免疫脅迫時，皮膚、鰓、血液、頭腎、肌肉、肝、腸、心臟組織內(nèi)Rabla-3基因轉(zhuǎn)錄水平都大 幅度上升，其中鰓、頭腎組織Rabla-3mRNA含量上調(diào)50倍以上。鰓是魚類的呼吸器官，比表 面積大，表面密布毛細血管，隨時與外界水流接觸，因而易受環(huán)境中的病原菌侵襲。頭腎是 硬骨魚類特有的淋巴器官，在魚體內(nèi)發(fā)揮重要的免疫功能。外源免疫基因，尤其是非特異性 免疫基因在鰓和頭腎組織高表達，將有利于轉(zhuǎn)基因魚及時抵御外界病原感染，同時避免其 他組織過多表達外源基因形成生長負擔。因此，Rabla-3基因啟動子適宜作為抗病轉(zhuǎn)基因 載體構建的啟動子元件。
[0029] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0030] 本發(fā)明通過應用魚類啟動子構建出真核表達載體，并將該真核表達載體顯微注射 入宿主細胞內(nèi)，以介導魚類啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄具有免疫應答特征，以使得魚體在受到免 疫刺激后啟動子活性顯著增強，適用于抗病轉(zhuǎn)基因載體構建，避免外源免疫基因在健康狀 態(tài)下的宿主細胞過量表達，形成能量浪費和生長負擔。
[0031] 本發(fā)明所述魚類啟動子還可應用于魚類抗病轉(zhuǎn)基因育種，介導外源目的基因在免 疫誘導下大量集中表達，而在未接觸外界免疫原時僅維持低水平表達，避免外源基因廣泛 大量表達給轉(zhuǎn)基因魚個體帶來能量消耗和生長負擔。
[0032] 本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本 發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【附圖說明】
[0033]圖1、為本發(fā)明中魚類啟動子擴增引物和特異引物I的擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0034] 圖2、為本發(fā)明中應用綠色熒光蛋白實驗檢測魚類啟動子活性及免疫應答，其中， 圖2a和2b為無免疫刺激的細胞影像，圖2c和2d為免疫刺激后的細胞影像，其中，圖2a和 2b為明場顯微鏡照片，圖2c和2d為熒光顯微鏡照片；
[0035] 圖3、為本發(fā)明中應用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灦繖z測魚類啟動子活性及免疫 應答。
【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0037] 應當理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0038] -種免疫應答的魚類啟動子，其特征在于，所述魚類啟動子的多核苷酸序列為如
[0039]SEQIDNo. 1 所示。
[0040] 優(yōu)選方案是，所述魚類啟動子來源于鯉魚。
[0041] 免疫應答的魚類啟動子在構建真核表達載體中的應用。
[0042] 一種應用免疫應答的魚類啟動子構建真核表達載體的方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0043] 步驟一、應用特異引物I對篩選獲得包含目的基因的文庫克隆；
[0044] 步驟二、將包含目的基因的文庫克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA;
[0045] 步驟三、以質(zhì)粒DNA為模板應用特異引物II進行引物步移法測序獲得目的基因的 上游調(diào)控基因；
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