專利名稱：大腸桿菌在魚類疫苗中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及免疫學及分子生物學領域，具體地說是無毒性大腸桿菌在魚類疫苗中 的應用，即大腸桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害免疫防治中的應用。
背景技術(shù)：
由細菌侵染導致的微生物病害為阻礙我國及世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。嗜 水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種常見的養(yǎng)殖水產(chǎn)生物病原菌，能夠感染多種魚 類，同時還可感染人類、動物以及鳥類等，因而是一種典型的人/畜/魚共患性病原菌。哈 維氏弧菌是一種重要的魚、蝦、貝等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原，其所誘發(fā)的弧菌病每年對養(yǎng)殖業(yè)造 成嚴重的經(jīng)濟損失。目前對于這些細菌病的免疫防治主要是運用單一性的滅活疫苗，即每 種疫苗針對一種病原；同時針對不同種病原的交叉保護疫苗尚未有應用性報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供大腸桿菌在魚類疫苗中的應用，大腸桿菌的免疫以及交叉保 護免疫應用方法。本發(fā)明所得疫苗能同時對兩種不同的病原菌有高效交叉保護作用，而且 制備及免疫操作簡單，無需任何純化過程。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
大腸桿菌在魚類疫苗中的應用，疫苗以大腸桿菌為有效成份，作為對嗜水氣單胞 菌感染具有免疫保護效應的嗜水氣單胞菌疫苗。
其免疫應用方法為將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌直接腹腔注射魚類。
所述大腸桿菌為非致病性、無毒大腸桿菌，即工程用大腸桿菌。
其制備過程為將所述大腸桿菌DH5 α，于37°C在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為 1-1. 2后，離心收集菌體，在經(jīng)PBS洗滌后獲得可用于直接注射魚類的疫苗。
所述大腸桿菌作為疫苗載體菌用于傳遞針對魚類其它細菌的疫苗抗原，所得疫苗 能同時對兩種不同的病原菌(嗜水氣單胞菌及除嗜水氣單胞菌外的魚類其它細菌)有高效 交叉保護作用，因而能夠保護魚類抵御多種不同病原的感染。
所述大腸桿菌作為哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)疫苗抗原表達載體，從而對嗜水 氣單胞菌和哈維氏弧菌侵染起到交叉免疫保護作用；即將質(zhì)粒PAQl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后 得到的菌株DH5 α /pAQl。其制備過程為將質(zhì)粒pAQl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得菌株DH5 α / pAQl ；將DH5 α /pAQl在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為1-1. 2，離心收集菌體，將菌體懸浮于PBS 中至終濃度為2-6xl08cfU/ml，得可用于直接注射魚類的疫苗，可作為哈維氏弧菌、嗜水氣 單胞菌、或哈維氏弧菌和嗜水氣單胞菌交叉保護疫苗。
所述魚類疫苗以大腸桿菌為有效成份，其中可添加有藥物學上可接受的載體或助 劑。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1.高保護率。本發(fā)明的疫苗對嗜水氣單胞菌和哈維氏弧菌的相對免疫保護效率可達89%或以上。
2.具交叉免疫保護效應。本發(fā)明的大腸桿菌除了自身即具有針對嗜水氣單胞菌的 免疫保護性以外，還可作為疫苗載體菌用于傳遞針對其它細菌的疫苗抗原，因而能夠保護 魚類抵御多種不同病原的感染。
3.應用簡單。本發(fā)明的疫苗制備過程簡單，只需常規(guī)的細菌培養(yǎng)，不涉及蛋白質(zhì)提 取、純化等。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
實施例1
大腸桿菌DH5ci作為嗜水氣單胞菌疫苗的應用
步驟1)疫苗制備。將大腸桿菌DH5 α (購于美國New England Biolabs公司)在 LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取0. Iml過夜后的培養(yǎng)液，將其加入IOml新鮮的LB液體培養(yǎng)基 中，于37°C下轉(zhuǎn)速160rpm搖動培養(yǎng)至OD6tltl為1-1. 2，而后將細菌培養(yǎng)液離心(5000g，4°C， IOmin)，收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為^108cfu/ml，即為疫苗制備液。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97. 5%蒸餾水；所述PBS組成成分按重量百分比計0.8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12H20,0. 024% NaH2P04。
步驟2~)疫苗的免疫注射。將40條牙鲆(每條重約12g)隨機分為2組，每組20 條。將這2組分別命名為A和B。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟1)的疫苗 制備液。將B組的每條魚分別腹腔注射lOOulPBS。20天后，再次將A組的每條魚分別腹腔 注射IOOul上述步驟1)的疫苗制備液，將B組的每條魚分別腹腔注射IOOul PBS0
步驟幻嗜水氣單胞菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)嗜水氣單胞菌AHl. 927 至OD6tltl為0.6，然后離心(5000g，4°C )10min。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為 5xl07cfu/ml即為嗜水氣單胞菌懸液。
所述嗜水氣單胞菌AHl. 927購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心 CGMCC (編號 1. 927)。
步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在步驟幻第一次免疫注射后的第30天，用上 述步驟幻的嗜水氣單胞菌懸液腹腔注射步驟幻的A和B組魚，每條魚的注射量為lOOul。 在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目 A組，2條；B組，19條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)
RPS = 100x(l-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)由此得出 大腸桿菌DH5ci針對嗜水氣單胞菌感染的免疫保護效率為90%。
實施例2
大腸桿菌DH5ci作為哈維氏弧菌和嗜水氣單胞菌交叉保護疫苗的應用步驟1) 疫苗制備。將表達哈維氏弧菌免疫保護原DegQ的的質(zhì)粒pAQl (見參考文獻1 Jhang W, Sun S, Cheng S, and Sun L. 2008. Characterization OfDegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrioharveyi strain. Appl EnvironMicrobiol. 74,6254-6262.) ■ Hanahan Tj (Sambrook and Russell:Molecular Cloning :A Laboratory Mannua 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)轉(zhuǎn)U人大 腸桿菌DH5 α，得菌株DH5 α /pAQl。將DH5 α /pAQl在含有50ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取0. Iml過夜后的培養(yǎng)液，將其加入IOml新鮮的含Ap (50ug/ml) 的LB液體培養(yǎng)基中，于下轉(zhuǎn)速160rpm搖動培養(yǎng)至0D_為1-1. 2，而后將細菌培養(yǎng)液 離心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為^108cfu/ml，即為疫苗 制備液。
步驟2~)疫苗的免疫注射。將80條牙鲆(每條重約12g)隨機分為4組，每組20 條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟 1)疫苗制備液。將B和D組的每條魚分別腹腔注射IOOul PBS0 20天后，再次將A和C組 的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟1)疫苗制備液，將B和D組的每條魚分別腹腔注射 IOOul PBS0
步驟幻哈維氏弧菌和嗜水氣單胞菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)哈維氏 弧菌T4和嗜水氣單胞菌AHl. 927至OD600為0. 6，然后離心(5000g, 4°C ) IOmin0收集菌體， 將其懸浮于PBS中至終濃度分別為8xl07cfu/ml和hl07cfu/ml，即為哈維氏弧菌和嗜水氣 單胞菌懸液。
所述哈維氏弧菌T4保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 1985 ；
步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在步驟幻第一次免疫注射后的第30天，用上 述步驟幻的哈維氏弧菌懸液腹腔注射步驟幻的A和B組魚，每條魚的注射量為IOOul ；用 上述步驟幻的嗜水氣單胞菌懸液腹腔注射步驟幻的C和D組魚，每條魚的注射量為lOOul。 在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目 A組，1條；B組，16條；C組，2條；D組，18條。故DH5 α /pAQl針對哈維氏弧菌和嗜水氣單 胞菌的免疫保護效率為分別為94%和89%。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌在魚類疫苗中的應用，其特征在于所述魚類疫苗以大腸桿菌為有效成 份，作為對嗜水氣單胞菌感染具有免疫保護效應的嗜水氣單胞菌疫苗。
2.按權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述大腸桿菌為非致病性、無毒大腸桿菌。
3.按權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于將所述大腸桿菌DH5α，于37°C在LB培養(yǎng) 基中培養(yǎng)至OD6tltl為1-1. 2后，離心收集菌體，在經(jīng)PBS洗滌后獲得可用于直接注射魚類的 疫苗。
4.按權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述大腸桿菌作為疫苗載體菌用于傳遞針 對魚類其它細菌的疫苗抗原，所得疫苗能同時對兩種不同的病原菌有高效交叉保護作用， 因而能夠保護魚類抵御多種不同病原的感染。
5.按權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述大腸桿菌作為哈維氏弧菌疫苗抗原表 達載體，從而對嗜水氣單胞菌和哈維氏弧菌侵染起到交叉免疫保護作用；即將質(zhì)粒PAQl轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5 α后得到的菌株DH5 α /pAQl，作為對哈維氏弧菌具有免疫保護性的哈維氏 弧菌疫苗、或哈維氏弧菌和嗜水氣單胞菌交叉保護疫苗。
6.按權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于將質(zhì)粒pAQl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得菌株 DH5 α /pAQl ；將DH5 α /pAQl在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_為1_1. 2，離心收集菌體，將菌體懸 浮于PBS中至終濃度為2-6X108cfu/ml，得可用于直接注射魚類的疫苗。
7.按權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的應用，其特征在于所述魚類疫苗以大腸桿菌為 有效成份，其中添加有藥物學上可接受的載體或助劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學及分子生物學領域，具體地說是無毒性大腸桿菌在魚類疫苗中的應用，所述魚類疫苗以大腸桿菌為有效成份，作為對嗜水氣單胞菌感染具有免疫保護效應的嗜水氣單胞菌疫苗；或者所述大腸桿菌作為疫苗載體菌用于傳遞針對魚類其它細菌的疫苗抗原，因而能夠保護魚類抵御多種不同病原的感染。本發(fā)明所得疫苗能同時對兩種不同的病原菌有高效交叉保護作用，而且制備及免疫操作簡單，無需任何純化過程。
文檔編號A61P31/04GK102028942SQ20091001952
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者孫黎, 程爽 申請人:中國科學院海洋研究所