專利名稱：鑒定f18大腸桿菌相關疾病遺傳抗性豬的方法和組合物的制作方法
本文提供了鑒定對大腸桿菌相關疾病，尤其是與具菌毛F18的大腸桿菌菌株相關的腸道疾病具有遺傳抗性的組合物和非侵害性方法。已鑒定出豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶(FUT1)基因中的DNA多態(tài)性，它可將抗性豬和易感豬區(qū)分開，從而H為豬養(yǎng)殖人員提供有用的診斷試驗。
養(yǎng)豬過程中的主要問題是使豬免患疾病，斷奶后的腸道紊亂是尤其嚴重的問題。有限數(shù)目的毒性大腸桿菌菌株血清型是豬水腫病和斷奶后腹瀉的致病原，它可導致全世界養(yǎng)豬業(yè)遭受嚴重的經濟損失，尤其是4至12周齡幼豬的損失。水腫病典型的臨床癥狀是神經學病征，如運動失調，驚厥和麻痹。在隨后的尸檢中發(fā)現(xiàn)，水腫一般存在于特征性位點，如眼瞼和前額，胃壁和結腸系膜。此疾病分別由定居于小腸表面但不影響腸細胞(腸中的細胞)主要形態(tài)變化的大腸桿菌產生的志賀樣毒素-Ⅱ變體和腸毒素LT,Sta,STb導致。在此方面，某些類型的大腸桿菌菌株F18,F4和K88是主要的致死性的villain?！柏i水腫病是腸毒素血癥，其特征在于延及全身的血管損傷，后者是由某些大腸桿菌菌株產生的毒素，志賀樣毒素-Ⅱ變體導致的”(Bertschinger等，1993)?？梢跃愋蛥^(qū)分大腸桿菌，相關的一組粘附菌毛被稱為例如K88或F18(Vogeli等，1997)。
不是所有的豬都易感大腸桿菌，定居依賴于細菌對腸細胞的粘附，這種粘附是由被稱為K88或F18的細菌菌毛介導的。已證實對粘附的易感性，即豬中結合菌毛的受體的表達受到宿主的遺傳控制，對F18而言，上述易感性作為顯性性狀被遺傳下來，B表示易感的等位基因，b表示抗性等位基因(Vogeli等，1996；Meijerink等，1997)。根據其與染色體6上鹵烷(HAL)連鎖群中的S基因座和其它基因座的緊密遺傳連鎖，將大腸桿菌F18-受體(ECF18R)的基因座作圖至豬染色體6(SSC6),K88大腸桿菌受體位于染色體13。
抗性機理可能是大腸桿菌未定居于抗性動物的腸表面，即細菌未粘附于抗性豬的腸壁上。某些大腸桿菌粘附和非粘附表型之間的區(qū)別取決于腸刷狀緣膜的糖蛋白受體，因此，宿主豬的基因型決定抗性。另外還研究了帶菌毛的細菌(WO9413811)。
鑒定F18大腸桿菌相關疾病的抗性豬的最新方法是1)收集剛被屠宰的豬的腸樣品，在顯微鏡下進行粘附試驗，2)用強毒性的大腸桿菌攻擊動物(“定居試驗”)，或3)進行AO(S)血型系統(tǒng)血液定型。前兩種方法對鑒定抗性動物以用作繁殖原種來說并不實用。盡管血液定型法能鑒定抗性動物，但此試驗不能確定易感動物的易感性是純合的還是雜合的。關于這些等位基因的動物基因型知識(基因狀況)是發(fā)展成功育種計劃所必需的。育種計劃的目的是繁殖對大批殺死斷奶后牲畜的F18大腸桿菌相關疾病具有抗性的豬。
在一篇文獻中，作者在談及豬水腫病時說到“正在尋找適當?shù)倪z傳標記”(Bertschinger等，1993,p.87)，并提到Walters和Sellwood,1982繁殖抗性豬是預防無法有效被預防的疾病的好方法，此方法的可行性取決于豬群體中編碼抗性的基因的大量存在，檢測抗性豬的改良方法，和用此抗性同時選擇的陰性遺傳性狀的缺乏。
遺傳“標記”基因座是靠近所需基因座的編碼或非編碼基因座，但基因座本身并不是必需的?？蓽y的表型包括連續(xù)的或不連續(xù)的性狀，如限制性長度片斷多態(tài)性，生產性狀，細菌粘附性狀，生色或酶促反應和抗生素抗性。S基因座控制著A和O血型抗原的表達。S基因座隱性純合的豬不表達A或O血型抗原。由于編碼人血型H的α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因中具有突變，類似的狀況也存在于人中(Kelly等，1994，也見于WO9628967中)。最近測定了豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因的序列(Cohney等，1996)，此基因與豬S基因座上存在的基因非常相似。
在遺傳和物理圖譜上，血型H和Se基因座位于人染色體19q13.3,此區(qū)域在進化中是保守的，含有與豬基因HAL連鎖群同源的基因。編碼血型H的基因是所謂的FUT1，而Se基因等同于FUT2基因。FUT1決定紅細胞譜系中的H抗原表達，而FUT2調節(jié)分泌上皮和唾液中H抗原的表達。在如大鼠和兔的低等哺乳動物中，F(xiàn)UT1基因是保守的，兔腦組織和大鼠結腸中顯示出mRNA的表達。在所有這些物種中，已報道了兩種類型的α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因，其結構非常類似于人FUT1和FUT2基因，但FUT1同源基因特別地顯示出物種特異性的表達模式。人FUT1基因負責紅細胞前體中H抗原的合成，然而，豬紅細胞被動地吸附血清中的H樣抗原，此時為人Lewis抗原。豬中所有的H樣抗原都與外分泌組織相關，在其它動物的分泌組織中也觀察到FUT2(secretor)基因的表達。因此，F(xiàn)UT2基因可能會影響到與抗人血型H和A抗體交叉反應的豬A-O血型決定簇的表達。
有關血型和豬大腸桿菌疾病的其它信息包括血型抗原的碳水化合物結構介導一些病原體微生物與宿主組織的粘附，如幽門螺桿菌與Lewisb血型抗原的粘附，和導致尿道感染的大腸桿菌與血型P物質的粘附。因此，負責血型特異性碳水化合物結構形成的糖基轉移酶的編碼基因代表著宿主控制細菌定居的候選基因。這些基因與負責豬小腸中F18陽性大腸桿菌的粘附/非粘附的基因座定位于相同的染色體區(qū)域。豬直至斷奶后才表達血型抗原A和O，此時豬容易感染F18大腸桿菌所致的疾病。
迫切需要診斷和治療豬大腸桿菌相關腸疾病的新方法，有人建議將基因突變的檢測作為一些豬疾病(惡性過熱)的診斷試驗(Fujii等，1991；美國專利5,358,649)，但無人報道過用于診斷的多態(tài)性標記。對大腸桿菌定居產生抗性的疫苗已被描述(美國專利5,552,144；WO8604604)，但由于給新生豬口服活疫苗的困難和調節(jié)的限制性，使其不可能成為預防大腸桿菌疾病的優(yōu)選方法?？股乜梢杂糜谥委?，但無法成功地預防疾病。
發(fā)明簡述本發(fā)明的組合物和非侵害性的方法可以檢測和排除易感大腸桿菌相關疾病的豬。鑒定大腸桿菌F18腸定居的抗性豬的非侵害性方法包括下列步驟測定豬生物樣品中是否存在與定居抗性相關的遺傳多態(tài)性；如果豬的多態(tài)性1(1多態(tài)性是種群中存在的核苷酸序列因突變所致的變化)是純合的，則可推斷豬是抗性的。
更具體地說，此方法是測定豬生物樣品中豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因第307位的含氮堿基僅是腺嘌呤還是僅為鳥嘌呤；如果第307位的含氮堿基僅是腺嘌呤,即可將豬鑒定為抗性。
為了測定生物樣品中是否存在多態(tài)性，在通過分子量進行分離的凝膠上分析限制性片斷長度的多態(tài)性。限制性內切核酸酶是能在特異性位點再現(xiàn)地切割核酸分子的酶，根據切割的位置產生不同分子量的核酸片斷。
本發(fā)明還涉及繁殖對大腸桿菌相關疾病具有抗性的豬的方法，所述方法包括選擇α(1,2)巖藻糖基轉移酶1基因中具有遺傳多態(tài)性因而將其鑒定為對大腸桿菌相關腸疾病具有抗性的豬的繁殖豬；并繁殖所選擇的豬。
本發(fā)明的一個方面是豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶1基因具有多態(tài)性的DNA分子，尤其是根據

圖1的序列。本發(fā)明的另一方面是具有與圖1序列互補的核苷酸序列的分子。
本發(fā)明的一個方面是第307位的鳥嘌呤被腺嘌呤取代的分離的DNA分子，此分子第857位的鳥嘌呤也被腺嘌呤取代。本發(fā)明其它分離的DNA分子包括圖1序列第229位的核苷酸具有突變的分子，其中編碼亮氨酸的密碼子CTT被變?yōu)榫幋a苯丙氨酸的密碼子TTT。第714位核苷酸的突變是由GAT變?yōu)镚AC，但編碼的產物中沒有相伴隨的氨基酸取代。
由本發(fā)明的DNA分子編碼并具有α(1,2)巖藻糖基轉移酶活性的多肽也是本發(fā)明的內容。
檢測豬中大腸桿菌F18受體的分子測定法是(a)從豬成核細胞(nucleated cell)中分離DNA；(b)使用與豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因1的DNA序列互補的寡核苷酸作為引物，在聚合酶鏈反應(PCR)中擴增DNA；(c)用至少一種限制性酶，如CfoI進行限制性酶消化；(d)通過凝膠電泳分離所得片斷；和(e)測定凝膠上各片斷的數(shù)目和長度；和(f)由F18片斷的數(shù)目和長度確定豬細胞中存在哪一種受體。使用本文公開的較大的擴增片斷而不是較小的片斷進行限制性長度多態(tài)性分析(RFLP)較為便宜，因為DNA帶可在相對低濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳。另外，為了產生一些片斷，與可變診斷位點相鄰的恒定限制性位點僅需要一種限制性酶。
檢測與大腸桿菌F18受體相關的多態(tài)性的試劑盒在各個獨立的容器中使用了與豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因1的DNA序列互補的寡核苷酸，它能將抗性豬和敏感豬區(qū)分開來?？蓪θ魏文挲g的豬進行此試驗。
多態(tài)性也可用于開發(fā)治療患大腸桿菌相關疾病的豬的藥物。突變形式的豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶可以干擾正常的酶，防止其產生F18的腸受體。
附圖簡述圖1顯示了本發(fā)明的豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶多態(tài)性的核苷酸序列(FUT1)(下)，并使用單字母氨基酸密碼顯示了推定的氨基酸序列(上)。氨基酸序列下方的雙實線(=)是推定的跨膜區(qū)；氨基酸序列下方的點線表示3個潛在的N聯(lián)糖基化位點(…)。
□是抗性豬中鳥嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代的位置。
*表示終止密碼子。
氨基酸殘基的縮寫如下A,Ala；C,Cys；D,Asp；E,Glu；F,Phe；G,Gly；H,His；I,Ile；K,Lys；L,Leu；M,Met；N,Asn；P,Pro；Q,Gln；R,Arg；S,Ser；T,Thr；V,Val；W,Trp；和Y,Tyr。
優(yōu)選實施方案的描述與豬對大腸桿菌相關疾病的抗性有關的DNA多態(tài)性分子分析便于進行選擇繁殖所用抗性豬的診斷試驗。通過本發(fā)明的多態(tài)性標記鑒定出抗性豬與敏感豬的大腸桿菌F18受體基因座不同。
本發(fā)明提供了以高水平的敏感性和特異性將在遺傳上對F18大腸桿菌感染的相關疾病敏感的豬與抗性豬區(qū)分開來的非侵害性方法和組合物。鑒定出豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶(FUT1)基因的DNA多態(tài)性，籍此區(qū)分抗性豬和易感豬。多態(tài)性由核苷酸序列中導致新等位基因的突變(變化)引起。等位基因是基因的一種狀況，在一個種群中，一個基因有很多等位基因，其通過含氮堿基的取代而有所不同，所述取代可能是由親代DNA分子中的突變引起的。一個種群中共存有一個以上的等位基因(有時稱之為“變體”)被稱為基因的多態(tài)性。在種群中，一個以上的等位基因作為明顯穩(wěn)定的成分存在的基因座是多態(tài)性基因座。通常，其中一個多態(tài)性基因座在種群中是低頻的。
由生物樣品，優(yōu)選為血液中測得抗性豬的基因組具有多態(tài)性，其中在核苷酸序列第307位(見圖1)測定的唯一堿基是腺嘌呤，而純合易感豬的相同位置的堿基是鳥嘌呤。雜合豬會顯示出兩種類型的DNA，并且會是易感的。多態(tài)性是Cohney等，1996所報道的豬基因序列的變異。
對豬家族進行遺傳連鎖分析，測定FUT1的多態(tài)性和遠系繁殖豬的疾病抗性之間的遺傳聯(lián)系。根據本發(fā)明，已在α(1,2)巖藻糖基轉移酶1基因(FUT1)中發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。第307位具有單個核苷酸堿基取代的多態(tài)性被用于確定巖藻糖基轉移酶基因和S-系統(tǒng)，ECF18R基因座和HAL連鎖群的其它基因座之間的緊密連鎖。
檢測FUT1和ECF18R的突變的緊密連鎖使得分子試驗發(fā)展成為可鑒定大腸桿菌F18粘附抗性，雜合(載體)和純合的易感豬。此診斷試驗以高敏感性和特異性鑒定出易感水腫病和斷奶后腹瀉的豬。在豬群中，本發(fā)明多態(tài)性的發(fā)生率有差異。據Vogeli等(1997)報道，豬群中5只豬的M307等位基因頻率互不相關。本發(fā)明多態(tài)性診斷試驗的可用性為養(yǎng)豬者提供了從豬群中有效消除ECF18R易感等位基因，從而消除導致水腫病和斷奶后腹瀉的必要條件大腸桿菌F18細菌粘附。
本發(fā)明還包括核苷酸序列，其為α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因1的序列的變體，代表bp307處的多種多態(tài)性，本發(fā)明還包括基于診斷分子試驗的試劑盒，可用于鑒定α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因中的多態(tài)性。
為了得到大腸桿菌F18受體基因座(ECF18R)的候選基因，從豬基因組文庫中分離出含基因的5個粘粒和1個基因組克隆，其含有α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因FUT1和FUT2(Meijerink等，1997)。通過熒光原位雜交作圖將所有這些克隆定位于豬染色體6的q11帶上(SSC6q11)。對粘粒的序列分析鑒定出(a)開放閱讀框(ORF)，其長度為1098個堿基對，與人FUT1序列82.3％相同，和(b)第二個ORF，其長度為1023個堿基對，與人FUT2序列85％相同。因此，F(xiàn)UT1和FUT2基因座似乎是人血型H和Secretor基因座的豬等同物。對易感或抗具有F18菌毛的大腸桿菌(ECF18R)的粘附和定居的豬中的兩個ORF進行直接測序，揭示出FUT1 ORF的堿基對307(M307)和堿基對857(M857)處的兩個多態(tài)性。核苷酸位置是從ATG(編碼甲硫氨酸)開始計數(shù)的。在具有221個后代的Landrace家族34次交配中分析這些突變，結果表明與控制對大腸桿菌F18粘附和定居于小腸的抗性和易感性的基因座(ECF18R)和血型抑制劑S的基因座緊密連鎖。因此，M307突變是標記-輔助選擇大腸桿菌F18粘附抗性動物的良好標記。發(fā)現(xiàn)第229位核苷酸的另一突變也導致多態(tài)性，其中編碼亮氨酸的密碼子(CTT)變?yōu)門TT(編碼苯丙氨酸)。第714位(編碼天冬氨酸)的突變(GAT變?yōu)镚AC)不產生氨基酸取代。在FUT2中未鑒定出可以區(qū)分易感豬和抗性豬的多態(tài)性。
實施例下列實施例提供了本發(fā)明的實施方案。
實施例1抗性豬試驗使用PCR-RFLP試驗可輕易地鑒定本發(fā)明的多態(tài)性，試驗的一個實施方案使用了下列引物5’CCAACGCCTCCGATTCCTGT3’和5’GTGCATGGCAGGCTGGATGA3’。此實施方案的優(yōu)選PCR條件是在下列時間和溫度下進行25輪循環(huán)94℃,30秒；60℃,45秒；72℃,90秒。通過限制性酶HgaⅠ消化抗性豬的擴增DNA，但不用限制性酶HinPI消化此DNA。用限制性酶HinPI消化純合易感豬的擴增DNA，用上述兩種酶部分消化雜合易感豬的擴增DNA。
或者，根據標準方法從豬成核細胞中分離DNA，對不同ECF18R基因型(Bb,bb)動物的豬FUT1和FUT2序列及其側翼區(qū)直接測序，結果鑒定出FUT1 ORF的第307和857位(分別稱之為M307和M857)有兩個G→A的轉換。M307轉換消除了CfoI限制性位點，根據標準方法，用引物P6和P11擴增分離自豬成核細胞的DNA(95℃3分鐘，然后是95℃,30秒；56℃,30秒；72℃,30秒共30輪循環(huán)，接著是72℃最后延伸7分鐘)，接著進行CfoI消化，在3％瓊脂糖凝膠上分離，產生限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)。純合M307AA動物顯示出2條帶，純合M307GG動物顯示出93-，241-和87bp的片斷，雜合動物顯示出所有4個片斷。
實施例2使用α(1,2)巖藻糖基轉移酶檢測F18大腸桿菌抗性豬的試驗的敏感性和特異性研究測定疾病抗性和FUT1基因第307位多態(tài)性之間的聯(lián)系。183頭斷奶的豬(年齡為2至6個月)得自6個不同的豬群。研究開始前只知道其中一個豬群含有抗性動物，已知該豬群壓力綜合征的發(fā)病率高，其它5個豬群沒有豬壓力綜合征的跡象，疾病抗性的發(fā)生率是未知的。從各豬群中隨機選擇豬，人為地使其安樂死，取出脾臟和小腸樣品。從脾組織中提取DNA，并用于實施例1所述的PCR-RFLP試驗。通過從小腸上刮下粘膜表層，在低滲EDTA溶液中裂解細胞并通過離心洗滌以純化腸細胞。將純化的腸細胞刷狀緣與F18大腸桿菌一起保溫，通過相差顯微鏡檢查此混合物，此試驗可測定豬是易感的(腸樣品粘附有細菌)還是抗性的(腸樣品未粘附細菌)。在所有53個抗性豬和130頭易感豬的128頭中，多態(tài)性的PCR-RFLP試驗與細菌-腸細胞結合試驗相關。使用細菌-腸細胞結合試驗測定為易感豬的兩頭豬被PCR-RFLP試驗不正確地測定為抗性豬。被檢查的6個豬群中有2個含有抗性豬，而只有1個豬群具有豬壓力綜合征，這表明PCR-RFLP試驗可鑒定不具有豬壓力綜合征的動物中的疾病抗性動物。
實施例3將FUT1定位于染色體6(SSC6)用得自豬基因組DNA的FUT1核苷酸探針篩選粘粒文庫之后，用引物P7和P11鑒定粘粒ETHsl,-s2,-s3,-s4和-s6，并通過FISH和DISH-PCR將其作圖至染色體6的q11帶上。
實施例4鑒定豬FUT1 ORF將KspI,EcoRI和KspI/EcoRI粘粒消化物與經放射性標記的豬FUT1片斷P6-P11和P7-P10進行雜交以進行Southern印跡分析，結果表明ETHs2,-s4和-s6的放射自顯影信號相同,而得自粘粒ETHs1和-s3的信號不同。從粘粒ETHs2 KspI中分離出長度為940bp和6.2kb的亞克隆，相當于Southern印跡上雜交KspI片斷的估計長度。結合兩個亞克隆的序列結果，產生1501 bp序列，這與基因組PCR產物直接測序結果一致。1501bp序列含有1098bp的開放閱讀框(ORF)，相當于人FUT1 ORF，與其具有82.3％的核苷酸和80.8％的氨基酸同一性。ORF編碼多肽。
實施例5鑒定豬FUT2和假基因FUTPETHs1具有1個與FUT1序列雜交的DNA片斷(2.7kb)，而ETHs3具有兩個上述片斷(2.7kb和8.2kb)。對ETHs1和-s3的2.7kb EcoRI片斷進行亞克隆和部分測序，證實了這兩個片斷是相同的。此序列與人FUT2非常相似，但在NH2和-COOH末端區(qū)域顯示出幾個變化。這些變化導致與保守ORF不相容的移碼，因此，假定得自2.7kb片斷的序列表示假基因(FUT2P)。亞克隆ETHs3 BamHI消化物之后，鑒定8.2kb EcoRI片斷中所含的雜交序列。所得亞克隆序列表示1023bp ORF，它與人FUT2序列在核苷酸水平上85％相同，氨基酸水平上83％相同。在豬FUT2序列和衍生自2.7kb片斷的FUT2P序列之間觀察到NH2和-COOH末端區(qū)域的很多差異。推測的氨基酸序列相當于豬Secretor酶部分測定的氨基酸序列(Thurin和Blaszcyk-Thurin,1995)。將所得豬FUT1,FUT2和FUTP序列登記于GenBank，登記號分別為U70883,U70881和U70882。FUT1和FUT2基因具有高度同源性序列。在例如引物開發(fā)中已考慮到這一點。另外，在進一步的研究中需要區(qū)分FUT1和FUT2酶活性。
實施例6鑒定M307和M857突變和表征M307根據標準方法從豬成核細胞中分離DNA，對不同ECF18R基因型(Bb,bb)的動物的豬FUT1和FUT2序列及其側翼區(qū)直接測序，結果鑒定出FUT1ORF的第307和857位(分別稱之為M307和M857)有兩個G→A的轉換。M307轉換消除了CfoI限制性位點，根據標準方法，用引物P6和P11擴增分離自豬成核細胞的DNA(95℃3分鐘，然后是95℃,30秒；56℃，30秒；72℃,30秒共30輪循環(huán)，接著是72℃最后延伸7分鐘)，接著進行CfoI消化，在3％瓊脂糖凝膠上分離，產生限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)。純合M307AA動物顯示出2條帶(93-和328-bp片斷)，純合M307GG動物顯示出93-,241-和87bp的片斷，雜合動物顯示出所有4個片斷。
實施例7鑒定突變M857M857突變是消除AciⅠ位點的轉換。設計引物PBEST以錯配第866和872位兩個多余的AciⅠ位點。用引物P7和PBEST進行PCR(95℃3分鐘，然后是95℃,30秒；56℃,30秒；72℃,30秒共30輪循環(huán)，接著是72℃最后延伸7分鐘)，接著進行AciⅠ消化，在3％瓊脂糖凝膠上進行PCR-RFLP分析。純合M857AA動物顯示出174bp的片斷，而M857GG動物的擴增產物顯示出136-和38-bp片斷。
實施例8繪制FUT1基因的遺傳圖譜在Landrace豬家族中，M307和HAL連鎖群(S,ECF18R,RYR1,GPI,PGD)基因座之間的重組事件揭示出重組分數(shù)θ＜0.04(表2)。全部重組分數(shù)的優(yōu)勢對數(shù)評分Z為24.5至50.6之間，這可以充分證明這些基因座之間的連鎖。這些數(shù)據可將FUT1基因作圖于HAL連鎖群中與皆受FUT1影響的S和ECR18R緊鄰的位置。在實驗性Landrace豬家族中，發(fā)現(xiàn)了ECF18R和RYR1之間的等位基因聯(lián)合。在水腫病和斷奶后腹瀉的抗性豬(基因型ECF18Rb/b(表3))中觀察到RYR1第1843位有過量的基因型RYR1TT(鹵烷易感基因型)。這種等位基因聯(lián)合是連鎖不平衡的結果，即在獨立分類等位基因時，所觀察到的單元型頻率與預期的單元型頻率有偏差的結果。因此，連鎖不平衡設計了屬于相連基因座的等位基因的非隨機聯(lián)合。然而由于低重組率的緣故，無法確定某種基因座順序顯著優(yōu)于另一種基因座順序。
實施例9:M307A與ECF18b和M307G與ECF18RB的聯(lián)合在Landrace(SL)豬和親代Large White(LW)豬中，ECF18Rb(水腫病和斷奶后腹瀉抗性等位基因)與M307A100％聯(lián)合，而ECF18RB(水腫病和斷奶后腹瀉易感等位基因)與M307G100％聯(lián)合(其中A=腺嘌呤；G=鳥嘌呤)。在SL豬中，88％(30/34)的Ss分別是ECF18Rb和M307A單元型。在Large White豬中，Ss-ECF18Rb和Ss-M307A單元型的相應值為82％(9/11)。在實驗性SL家族中，F(xiàn)UT1基因座的M857A等位基因的發(fā)生率低，在LW豬中甚至為零。因此，未觀察到M857等位基因和側翼基因的等位基因之間的顯著配子聯(lián)合。在Duroc,Hampshire和Pietrain豬中發(fā)現(xiàn)FUT1307和FUT1857位的G→A轉換具有可變的頻率，使其它豬群中也出現(xiàn)這種轉換成為可能。
實施例10:FUT1基因型的分布表4顯示出ECF18R型中的FUT1基因型分布于核苷酸第307位，這與這兩者為獨立的假說中預期的比例顯著不同。在119頭水腫病和斷奶后腹瀉的抗性ECF18Rbb動物中，在基于DNA的試驗中測定其中的118頭具有基因型M307AA,1頭抗性動物的基因型為M307A/G。在131頭易感豬中，130頭為M307A/G或M307G/G。通過DNA試驗顯示出1頭對大腸桿菌粘附易感的動物為純合的M307A/A。本實施例和實施例2的數(shù)據與過去的研究結果一起表明FUT1基因是存在于豬S基因座和ECF18基因座上的基因。盡管本實施例和實施例2中有4頭動物同此假說相矛盾，但這可能是因為這些動物在疾病抗性/易感性方面被錯誤地劃定表型的緣故。
實施例11:α(1,2)巖藻糖基轉移酶中的氨基酸交換α(1,2)巖藻糖基轉移酶1中bp+307和bp+857處的G→變化導致推測的氨基酸取代，即蘇氨酸(中性-極性)取代丙氨酸(中性-非極性)和谷氨酰胺(中性-極性)取代精氨酸(堿性)，其分別對編碼產物產生功能上的影響。bp229處的C→T變化導致的氨基酸取代為亮氨酸(中性-非極性)取代苯并氨酸(中性-非極性)。
表1正向(F)和反向(R)引物的序列及其相對于豬FUT1和FUT2起始密碼子2的位置引物名稱引物序列 位置FUT1 P6 (R) 5＇-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3＇ +489FUT1 P7 (F) 5＇-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC-3＇ +720FUT1 P10 (R) 5＇-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC-3＇ +1082FUT1 P11 (F) 5＇-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3＇ +69FUT1 P16 (F) 5＇-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG-3＇ -90FUT1 P18 (R) 5＇-CTGCTACAGGACCACCAGCATC-3＇ +1203FUT1 PBEST (R) 5＇-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGACGGGCACGGCCTC-3＇+893FUT2 P16 (R) 5＇-CTCCCTGTGCCTTGGA AGTGAT-3＇ +1094FUT2 P17 (F) 5＇-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC-3＇ -832引物FUT1 P10和FUT1 P11衍生自FUT1基因表2在Landrace實驗群體中，M307和HAL連鎖群基因座的全部重組分數(shù)(θ)，優(yōu)勢對數(shù)評分(Z)和提供數(shù)據的動物數(shù)(N)基因座對 NθzS-ECF18R183 0.01 50.6M307-S 183 0.01 50.6M307-ECF18R 216 0.01 57.1M307-RYRl 198 0.02 47.2M307-GPI147 0.03 34.2M307-PGD147 0.04 24.5
表3在Landrace(SL)實驗群體和隨機選擇的Large White(LW)豬中，4個基因座[S-FUT1(M307,M857)-ECF18R-RYR1]處的單元型頻率品系 S,FUT1(M307,M857)，頻率4(數(shù)目)ECF18R,RYR1處的單元型3SL sAGbT 70(28)sAGbC 5(2)sGGBC 15(6)sGABC 10(4)LW sAGbC 56(9)sGGBC 31(5)sGGBC 13(2)3S:A和O血型抑制基因(S和s)的基因座。
FUT1(M307):α(1,2)巖藻糖基轉移酶(FUT1)基因中核苷酸307處的腺嘌呤(A)改變?yōu)轼B嘌呤(G)。FUT1(M857):FUT1基因中核苷酸857處的腺嘌呤(A)改變?yōu)轼B嘌呤(G)。ECF18R大腸桿菌F18受體。B表示顯性易感等位基因，b表示抗性等位基因。RYR1骨骼肌ryanodine受體。C(胞嘧啶)是惡性過熱的顯性抗性等位基因而T(胸腺嘧啶)是易感等位基因。
4單元型頻率以％表示，括號中為單元型的絕對數(shù)目。
表4:Landrace(SL)實驗群體和隨機選擇的Large White(LW)豬中相關多態(tài)性的FUT1(M307)和ECF18R基因座的基因型分布，tetrachoric相關性(R)和聯(lián)合的顯著性(X2和w×X2)5FUTI/M307品系基因座 基因型A/GA/ArX2X2xw5SL ECF18R6b/b 1 113 0.98 213.1 42.6***B/b 106 1基因型 A/G,G/G A/ALW ECF18R6b/b 0 51.00 29.0 11.6***B/b,B/B 24 05根據Cotterman(1947)，將重量因子w=0.2(SL)和0.4(LW)用于校正因數(shù)據中包括相關動物而失去的精確性，***p＜0.001。
6ECF18R基因座處的基因型為b/b的動物對F18ab大腸桿菌細菌的粘附具有抗性，而基因型為B/b和B/B的動物對上述粘附是易感的。
方法1．引物使用衍生自人FUT1基因的引物從基因組DNA中擴增其豬對應物。由所得豬序列設計特異性引物，將該引物用于進一步的擴增和測序反應中(表1)。
2．篩選豬基因組文庫用引物P7和P10得到豬FUT1探針，用該探針或豬FUT1 cDNA篩選豬基因組文庫。用引物P7和P10從豬基因組DNA中得到FUT1探針，用經α32P dATP標記的(Prime ItⅡ,Stratagene)該探針篩選構建于SuperCos 1(Stragene,La Jolla,Ca,USA)中的豬基因組文庫。于42℃將復本濾膜雜交15小時(50％甲酰胺，6×SSC,5×Denhardt’s,0.5％SDS,0.1mg/ml鮭精DNA),65℃洗滌兩次達30分鐘(1×SSC,0.1％SDS)之后，暴露于(15h,-80℃)X射線膠片后鑒定陽性菌落。
3．豬中期染色體原位雜交對粘粒克隆ETHs1,ETHs2,ETHs3,ETHs4和ETHs6進行熒光原位雜交(FISH)(Solinas Toldo等，1993)或對豬中期染色體進行直接原位染色體PCT(DISC PCR)。雜交前對中期染色體進行Q-顯帶和照相。使用生物素-16-dUTP通過隨機引物法標記探針。使用親和素-FITC和生物素化的抗親和素進行信號檢測和擴增。用4,6-diamidino-2-phenylindole負染染色體，按Solinas Toldo,1993所述測定粘粒的相對位置。
4．亞克隆在瓊脂糖凝膠上分離探針陽性基因組菌落的酶消化物，轉移至尼龍膜上，將探針陽性帶亞克隆至質粒中以進行FUT1測序。由此方法得到的FUT1序列示于圖1。
在0.8％瓊脂糖凝膠上分離所有粘粒的KspI-,EcoRI-和KspI/EcoRI消化物，轉移至Hybond N尼龍膜上(Meijerink等，1997)。將此印跡與經α32P dATP標記的豬FUT1 PCR產物(引物P6-P11和P7-P10)雜交。根據放射自顯影信號，將ETHs1,-s2和-s3進一步亞克隆至pBluescriptSK-(Stratagene)，由亞克隆測定FUT序列。通過直接測序PCR產物，比較ECF18R陽性(BB/Bb)和陰性(bb)動物得自粘粒ETHs2和-s3的兩個FUT-樣開放閱讀框(ORF)(FUT1和FUT2)的序列。
5．聚合酶鏈反應和直接測序使用Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminator試劑盒(PerkinElmer Cetus,Norwalk,CT,USA)和10pmol引物，用由95℃起始變性5分鐘，接著95℃30秒，50℃15秒和60℃4分鐘進行25輪循環(huán)組成的熱程序進行循環(huán)測序。用于豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因擴增和測序的引物示于表1。考慮到因FUT1,FUT2和FUT2假基因的高度相似性所致的引物交叉退火的可能性，設計了其它的引物。在373A ABI測序儀(Applied Biosystems公司)上分析樣品，用GCG程序包(Devereux,1984)進行序列分析。
6．產生可提供資料的后代在由4頭公豬和16頭母豬產生的221頭Landrace豬和由不相關的豬之間9次交配產生的29頭Large White豬中分析單個核苷酸的多態(tài)性。為了產生大量可提供資料的后代以檢查編碼ECF18受體的豬基因和選定多態(tài)性基因座之間的連鎖，僅進行了B/b×b/b型可提供資料的Landrace交配。
7．定居試驗在Bertschinger等，1993的研究中，也在定居試驗中檢測了上述Landrace豬的ECF18易感性。為此，斷奶后立即用血清型為0139:K12(B):H1:F18的大腸桿菌菌株124/76接種豬(Rippinger等，1995)。每天監(jiān)測豬糞便中排出的細菌。將定居的程度計算為兩個最高糞便評分的平均值。平均糞便評分為3.5，相當于菌落形成單位(CFU)/g的對數(shù)為6.7或更高被認為是對定居敏感。此界限的根據是低于此值即無死亡率和得自完全抗性小豬的評分。
8．核苷酸多態(tài)性的連鎖分析將單個核苷酸多態(tài)性的結果與Vgeli等(1996)所述的體外粘附試驗中鑒定的ECF18R定型數(shù)據和Vogeli等(1996)所述的GPI-,PGD-,α-1-B-糖蛋白-(AIBG),ryanodine受體(RYR1),EAH-和S-基因座的定型數(shù)據比較。使用CRI-MAP 2.4版本的程序(Green等，1990)進行成對連鎖分析并計算重組分數(shù)。通過將上述基因座依次插入圖譜中以進行多點連鎖分析。計算Landrace家族的親代動物和8頭親代Large White豬的單元型頻率，所述動物的ECF18R單元型是由得自后代的資料確定的。計算所有Landrace和Large White豬后代的ECF18R和FUT1(FUT1/M307)中的突變(多態(tài)性)的四氯相關性。
9．Southern印跡分析用KspI(1,4,7),EcoRI(2,5,8)和KspI/EcoRI(3,6,9)消化并在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離之后，對粘粒ETHs1(1-3),ETHs2(4-6)和ETHs3(7-9)進行Southern印跡分析。與經α32P dATP標記的5’FUT1片斷(引物P6-P11)的雜交導致KspI消化物(泳道4)和KspI/EcoRI消化物(泳道6)中有相同的940bp雜交帶。然而，與3’FUT1片斷(引物P7-P10)(表1)的雜交在泳道4顯示出6.2kb KspI片斷和在泳道6顯示出1.1kb KspI/EcoRI帶。5’和3’FUT1片斷都與泳道5中相同的4.6kb EcoRI片斷雜交。這表明粘粒ETHs2中含有的FUT1基因中存在KspⅠ位點。3’FUT1片斷的交叉雜交檢測到2.7kb(泳道2,3,8和9)和8.2kb(泳道8和9)的帶，分別鑒定出FUT2假基因(不完全的ORF)和FUT2基因序列。
10．限制性片斷的多態(tài)性使用多種限制性酶通過限制性長度多態(tài)性分析檢測到豬FUT1基因中的(A)M307 G至A和(B)M857 G至A的突變。用CfoI(A)和AciI(B)消化擴增的FUT1片斷導致限制性片斷的多態(tài)性。第一泳道是100bp的標記物，片斷長度以堿基對表示。(A)M307A/A基因型(泳道2)產生了328和93bp的限制性片斷，而M307G/G基因型(泳道4)產生了93,241和87bp的片斷，雜合的M307A/G基因型(泳道3)顯示出所有4個片斷。
(B)M857A/A基因型(泳道2)的消化產生了174bp的片斷，而M857G/G基因型(泳道4)產生了136和38bp的片斷，M857A/G基因型(泳道3)產生了所有3個片斷。
11．豬的來源Swiss Landrace實驗群體的數(shù)據得自兩個種，這兩個種是蘇黎世大學獸醫(yī)細菌學研究所建立的。Large White,Swiss Landrace,Duroc,Hampshire和Pietrain豬群的其它豬得自瑞士的不同豬群。其它豬隨機得自美國中西部的農場。
參考文獻Bertschinger等(1993)，獸醫(yī)微生物學35:79-89Cohney等(1996)免疫遺傳學44:76-79Devereux等(1984)核酸研究1:387-395Fujii等(1991)科學253:448-451Green等(1990)CRI-MAP,2.4版本的文獻，St.Louis:華盛頓大學醫(yī)學院Kelly等(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5843-5847Meijerink等(1997)動物遺傳學第25次國際研討會P44Rippinger(1995)獸醫(yī)微生物學，45:281-295Solinas Toldo等(1993)Mamm.Genome 4:720-727Thurin和Blaszczyk-Thurin(1995)生物化學雜志270(44):26577-26580Vogeli等(1996)動物遺傳學27:321-328Vogeli等(1997)Schweiz Arch.Tierheilk 139:479-484美國專利5,358,648,Maclennon等美國專利5,552,144,Valery等WO 8604604 987P，發(fā)明人PetersonWO 9628967，發(fā)明人Koike,CWO 9413811，發(fā)明人Imberechts和LintermansTW 266264，發(fā)明人Jeng和Liou
權利要求
1．鑒定大腸桿菌腸定居的抗性豬的方法，所述方法包括a．測定豬生物樣品中是否存在與定居抗性相關的遺傳多態(tài)性；和b．如果豬的多態(tài)性是純合的，則可推斷豬是抗性的。
2．鑒定大腸桿菌相關腸紊亂的抗性豬的方法，所述方法包括a．測定豬生物樣品中豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因1第307位的含氮堿基是否僅是腺嘌呤；和b．如果第307位的含氮堿基僅是腺嘌呤，即可將豬鑒定為抗性。
3．繁殖對大腸桿菌相關疾病具有抗性的豬的方法，所述方法包括a．選擇α(1,2)巖藻糖基轉移酶1基因中具有遺傳多態(tài)性因而將其鑒定為對大腸桿菌相關腸疾病具有抗性的豬的繁殖豬；和b．繁殖所選擇的豬。
4．權利要求1,2或3的方法，其中大腸桿菌是菌株F18。
5．分離的DNA分子，其中豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶1基因具有多態(tài)性。
6．分離的DNA分子，其具有根據圖1的核苷酸序列。
7．權利要求6的分離的DNA分子，其中第307位的鳥嘌呤被腺嘌呤取代。
8．分離的DNA分子，其與權利要求6的核苷酸序列互補。
9．權利要求6的分離的DNA分子，其中第857位的鳥嘌呤被腺嘌呤取代。
10．權利要求6的分離的DNA分子，其第229位的核苷酸為蘇氨酸。
11．由權利要求5或6的DNA分子編碼的多肽，所述分子具有α(1,2)巖藻糖基轉移酶活性。
12．權利要求5或6的分離的DNA分子的部分，所述部分包括將大腸桿菌定居抗性豬和敏感豬區(qū)分開的核苷酸序列。
13．檢測大腸桿菌F18受體的分子測定法，所述測定法包括從豬成核細胞中分離DNA；使用與豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因1的DNA序列互補的寡核苷酸作為引物，在聚合酶鏈反應中擴增所述DNA；用至少一種限制性酶進行限制性酶消化；通過凝膠電泳分離所得片斷；測定各片斷的數(shù)目和長度；和由片斷的數(shù)目和長度確定存在哪一種受體。
14．權利要求14的分子測定法，其中限制性酶是CfoI。
15．檢測大腸桿菌F18受體的試劑盒，所述試劑盒在獨立的容器中含有與豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶基因1的多態(tài)性DNA序列互補的寡核苷酸。
16．豬多肽，其具有α(1,2)巖藻糖基轉移酶活性和第103位的氨基酸取代。
17．權利要求17的多肽，其進一步的特征在于第286位具有氨基酸取代。
18．豬α(1,2)巖藻糖基轉移酶的多態(tài)性在開發(fā)治療患有大腸桿菌相關疾病的豬的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了以高水平的敏感性和特異性將在基因上對F18大腸桿菌感染的相關疾病敏感的豬與抗性豬區(qū)分開來的非侵害性方法和組合物。使用α(1,2)巖藻糖基轉移酶(FUT1)基因的DNA多態(tài)性區(qū)分抗性豬和易感豬。本發(fā)明包括由核苷酸多態(tài)性編碼的具有氨基酸取代的多肽,區(qū)分大腸桿菌F18－粘附抗性,雜合(載體)和純合易感豬的分子診斷試驗和試劑盒。分子試驗以高敏感性和特異性鑒定豬對水腫病和斷奶后腹瀉的易感性,因此豬飼養(yǎng)者可利用該試驗提高豬的抗性。本發(fā)明多態(tài)性的有關資料可以讓人們深入了解大腸桿菌相關腸紊亂的病因和治療方法。
文檔編號A61P1/00GK1314953SQ98807387
公開日2001年9月26日 申請日期1998年5月20日 優(yōu)先權日1997年5月20日
發(fā)明者B·T·波斯沃斯, P·沃格利 申請人:生物技術研究及發(fā)展公司, 美國農業(yè)部, 蘇黎世瑞士聯(lián)邦技術協(xié)會