專利名稱：人源菌群仔豬模型的構建及仔豬腸道中菌群分子檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種微生物技術領域的方法，具體涉及一種人源菌群仔豬模型的構建及仔豬腸道中菌群分子檢測方法。
背景技術：
人的胃腸道中定居著一個十分復雜和活躍的微生物群落，包括約1014個細菌，相當于人體所有組織細胞總數量的10倍。大量研究表明，這個龐大的微生物菌群與人形成了一種穩(wěn)定的共生體系，對人的健康及疾病狀況至關重要。因此，研究人胃腸道菌群結構與組成以及菌群與其宿主的相互作用一直是微生物生態(tài)領域的熱點。近年來，越來越多商業(yè)化生產的調節(jié)腸道菌群的功能性食品及藥物大量涌現，對這些益生元、益生菌類產品功能的科學評價也引起了很多人的研究興趣。由于直接以人為對象研究腸道菌群的結構、功能和調控存在難于標準化實驗個體的遺傳及環(huán)境背景的問題且存在安全隱患，因此，建立一個穩(wěn)定的、能反映人腸道菌群組成和特點的人源菌群(Human Flora-associated，HFA)動物模型就顯得尤為重要。
經對現有技術的文獻檢索發(fā)現，HFA動物模型的研究主要集中于嚙齒類動物。如Mallett等人1987年在《Journal of Applied Bacteriology》(應用細菌學學報)63卷39-45頁上報道，通過用人的糞便懸浮液接種無菌動物，建立了人源菌群大鼠模型，雖然經用常規(guī)培養(yǎng)方法檢測，發(fā)現部分人腸道菌群中的類群可以在HFA鼠中定植，但是，模型鼠的腸道菌群與人的差異較大，而且，其免疫系統(tǒng)發(fā)育也不完善。雖然此類模型已被廣泛應用于研究腸道菌群的生態(tài)和代謝、評價功能性食品對胃腸道生理的影響以及某些藥物和高危食物的致癌作用的分析上，然而，作為微生態(tài)和代謝模型，仔豬較之嚙齒類動物有更大的優(yōu)勢，表現在(1)屬雜食性動物；(2)消化道的生理和解剖學特性和人高度相似；(3)具有和人類似的發(fā)育期。美國食品和藥物管理局(FDA)2000年將人的早期發(fā)育期劃分為4個階段，這4個階段和仔豬自出生至6.5月齡的發(fā)育階段相對應；(4)仔豬的高營養(yǎng)需求和生長快速的特性使其對營養(yǎng)和代謝調控的表現更為明顯。以上特性表明仔豬更適合構建人源菌群動物模型。
自HFA動物模型建立并被應用于人胃腸道生理和生態(tài)的研究以來，對HFA動物模型腸道菌群的分析以及評價各種功能性食品或藥物對腸道菌群的影響均依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術。越來越多的研究證實，培養(yǎng)方法費時、費力且遠不能反映微生物群落的多樣性，故建立不依賴于純培養(yǎng)的分子生物學檢測方法將更準確、更精細、更快捷地評價HFA動物模型的菌群定植情況和監(jiān)測腸道菌群在某種生理、病理或外界干擾以及食物、藥物處理狀態(tài)下的動態(tài)變化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種人源菌群仔豬模型的構建及仔豬腸道中菌群分子檢測方法。本發(fā)明采用在微生物生態(tài)學領域廣泛使用的RAPD指紋圖譜技術結合Southern Blot以及類群特異性PCR-TGGE/DGGE(溫度梯度變性凝膠電泳/變性梯度凝膠電泳)技術，在從總體上比較HFA動物模型菌群組成和供體菌群組成相似性的基礎上，再對人腸道菌群中的兩個主要類群-與健康密切相關的雙岐桿菌類以及在腸道菌群中數量最多的擬桿菌類進行組成分析，該技術路線系統(tǒng)、簡便，可全面地反映腸道菌群組成的主要特征。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的，本發(fā)明人源菌群仔豬模型的構建方法，包括以下步驟(1)制備健康人糞便菌懸液；(2)對懷孕待產母豬剖腹取胎產仔；(3)仔豬的飼養(yǎng)，剖腹取出的仔豬飼養(yǎng)于全天候過濾正壓通風的隔離室中；(4)對仔豬接種人糞便菌懸液使人源菌群逐步在仔豬胃腸道中定植。
所述的制備健康人糞便菌懸液，具體為采集剛排出的新鮮健康人糞便，迅速懸浮于含10％甘油的預還原處理過的PBS緩沖液(0.05M，PH7.4)中，稍靜置，上清即為人糞便菌懸液。
所述的對仔豬接種人糞便菌懸液，具體為于仔豬出生12小時起開始第一次接種人糞便菌懸液(1ml/day)，每天1次，連續(xù)3天。第4-10天每隔一天接種1次，每次1ml。
本發(fā)明同時還提供一種上述人源菌群仔豬模型的仔豬腸道中菌群分子檢測方法，包括以下步驟(1)提取糞便微生物基因組DNA；(2)ERIC-PCR指紋圖譜分析及群落DNA雜交；(3)HFA仔豬腸道菌群中雙岐桿菌定植檢測；(4)HFA仔豬腸道菌群中擬桿菌定植檢測。
所述的提取糞便微生物基因組DNA，具體為自仔豬出生4-5天排出正常糞便起，每天采集新鮮仔豬糞便，提取糞便菌群總DNA。
所述的HFA仔豬腸道菌群中雙歧桿菌和擬桿菌定植檢測，采用類群特異性PCR-TGGE方法。
根據上述步驟，通過分子方法檢測、比較仔豬模型與供體人的ERIC-PCR指紋圖譜以及腸道中最重要的兩大類細菌-雙岐桿菌和擬桿菌的組成，證實本發(fā)明模型仔豬胃腸道中成功定植了供體人的雙岐桿菌和擬桿菌，指紋圖譜的比較也顯示模型仔豬腸道菌群的指紋圖譜與供體人同源性高，而與普通仔豬差異顯著。從而說明本發(fā)明以實驗手段建立了人源菌群(HFA)仔豬模型，該模型可用于研究腸道菌群與其宿主生理及免疫特性的相互關系，也可用于評價含益生元或益生菌成分的功能性食品或藥品對胃腸道菌群的作用及檢測高危食品的致癌性方面。


圖1為一頭HFA仔豬5、9、12、15日齡腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜。
圖2(A)為7頭HFA仔豬在12日齡腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜；(B)為圖譜聚類分析結果。
圖3為3窩HFA仔豬腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜。
圖4(A)為10個不同人、5頭普通仔豬及2頭HFA仔豬腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜；(B)為聚類分析結果；(C)為以HFA仔豬的供體(H4)的ERIC-PCR產物為探針對(A)圖進行的群落雜交。
圖5(A)為HFA仔豬和供體的雙歧桿菌類群性PCR-TGGE圖譜，(B)為聚類分析結果。
圖6(A)為HFA仔豬和供體的擬桿菌類群性PCR-TGGE圖譜，(B)為聚類分析結果。
具體實施例方式
下面通過實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1 人源菌群仔豬模型的構建(1)制備健康人糞便菌懸液配置含10％(vol/vol)甘油的PBS緩沖液(0.05M，PH7.4)，121℃滅菌30min，置于厭氧罐中預還原處理24h。采集剛排出的新鮮健康兒童或成人糞便，每2克糞便懸浮于40ml上述處理過的PBS緩沖液中，稍靜置，吸取上清于無菌離心管中，此即糞便菌懸液。菌懸液可直接接種初生仔豬或迅速保存于-70℃冰箱，用前解凍，切忌反復凍融。
(2)對懷孕待產母豬剖腹取胎產仔剖腹產手術應盡量接近自然順產時間，最好在預產期前一天進行。手術采用常規(guī)剖腹產方法，所得仔豬迅速移入無菌隔離室，用無菌干紗布擦拭豬口、鼻、周身，去除粘膜、黏液，保證仔豬能夠自主正常呼吸。
(3)仔豬的飼養(yǎng)將剖腹取出的仔豬飼養(yǎng)于全天候高效過濾正壓通風的隔離室中，隔離室根據仔豬生長特點及實驗需要設計。實驗前隔離室和飼養(yǎng)仔豬的不銹鋼籠子需徹底消毒。消毒采用以下方法先用1％來蘇爾溶液擦拭隔離室地面、門、窗及籠子，再用2％過氧乙酸(8ml/立方空氣)噴灑隔離室2小時，紫外燈照射12小時以上，最后用高錳酸鉀∶甲醛∶水(1∶2∶1)溶液熏蒸隔離室24小時并開啟排送風系統(tǒng)待用。實驗開始后，工作人員每次進入隔離室工作前必須經過下列步驟手、臂部消毒(1∶1000稀釋的新潔而滅溶液)→在一級緩沖間更換無菌工作服→在二級緩沖間穿戴無菌隔離服和口罩。
實驗仔豬單籠飼養(yǎng)。仔豬出生前7天隔離室溫度為35-37℃，7天后溫度逐步降為30-32℃并維持此溫度不變。仔豬斷奶前飼喂安佑(漳州)飼料科技有限公司生產的“奶媽奶”奶粉，該奶粉是一種具有初乳效果的豬用代母乳，每次飼喂前用無菌水新鮮配制。人工乳用奶瓶逐頭哺飼。仔豬27日齡開始斷奶，約持續(xù)5-7天，此期間逐步減少奶粉的用量而代之以雀巢公司嬰兒營養(yǎng)米粉。斷奶結束后仔豬完全用固體粉料飼喂，自由取食、自由飲水。
(4)對仔豬接種人糞便菌懸液仔豬出生12小時后開始接種人糞便菌懸液，1-3日齡每天接種一次，每頭仔豬每次1ml，用注射器直接注射進仔豬口腔，并誘導其吞咽。3日齡后每兩天接種一次，劑量仍為每頭仔豬每次1ml，接種持續(xù)至仔豬10日齡。此后仔豬正常飲食，不再進行接種。
本實施例在仔豬模型胃腸道中成功定植了供體人的雙岐桿菌和擬桿菌，該模型可用于研究腸道菌群與其宿主生理及免疫特性的相互關系，也可用于評價功能性食品或藥物對腸道菌群的調節(jié)和代謝作用。
實施例2 對上述人源菌群(HFA)仔豬腸道中菌群的分子檢測。
(1)提取糞便微生物基因組DNA用分子微生物學方法檢測腸道菌群的組成，必須首先提取優(yōu)質的腸道微生物的總基因組DNA。HFA仔豬糞便DNA的提取采用試劑盒QIAamp DNA stool minikit(Qiagen，Hilden)，方法依照試劑盒說明書。得到的DNA用DNA濃度測定儀DyNA QuantTM200 fluorometer(Amersham Pharmacia Biotech，USA)測定濃度，并在1％瓊脂糖凝膠上電泳以檢查其大小及完整性。
(2)ERIC-PCR指紋圖譜分析及群落DNA雜交用ERIC-PCR指紋圖譜技術連續(xù)監(jiān)測HFA仔豬自出生后腸道菌群組成的動態(tài)變化。ERIC-PCR體系(25μl)包括引物E1(5’-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3’)和E2(5’-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3’)各25pmol，dNTP各5mM，模板DNA 80ng，Taq DNA聚合酶2.5U(Promega，USA)以及配套1×buffer及50mmol MgCl2。ERIC-PCR擴增程序如下95℃7min；然后94℃變性1min，52℃變性1min，65℃延伸8min，共執(zhí)行30個循環(huán)；最后再65℃延伸16min。指紋圖譜采用UVI band/map軟件(UVItec，Cambridge，United Kingdom)進行相似性指數的分析和聚類。
如圖1所示，一頭HFA仔豬5、9、12、15日齡腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜。從圖1可看出，仔豬自出生接種人腸道菌懸液后建立了自己的腸道菌群，ERIC-PCR指紋圖譜條帶豐富。該腸道菌群逐漸變化、平衡至12日齡后維持穩(wěn)定，12日齡和15日齡的指紋圖譜基本一致。12日齡時，同一窩試驗仔豬腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜趨于一致(見圖2A)，相似性指數達90％以上(圖2B)，表明HFA仔豬不同個體之間腸道菌群組成相似，個體差異小。
定植實驗用同一個供體的菌群，在3窩豬上進行了重復，3次獨立的實驗得到基本相同的DNA指紋圖，表明用這種方法建立的仔豬模型具有很好的重復性。(圖3)為檢測供體腸道菌群在HFA仔豬腸道內的定植情況，并比較HFA仔豬腸道菌群與其供體以及普通仔豬(指正常出生、正常飼養(yǎng)的仔豬)腸道菌群組成的異同，本發(fā)明采用了基于ERIC-PCR指紋圖譜基礎上的群落DNA雜交方法，該方法可同時分析比較多個微生物生態(tài)系統(tǒng)的菌群結構差異，具有簡便、快速、靈敏的特點。探針標記以及Southern雜交方法采用現有技術實現。分析樣品包括10個不同人、5個普通仔豬以及2個HFA仔豬的糞便樣品。HFA仔豬的供體人的ERIC-PCR產物以地高辛標記作為混合探針(DIG DNA labeling and detection kit，Roche，Germany)。如圖4所示，不同人及普通仔豬腸道菌群均表現出各自特異的指紋圖譜(圖4A)，但不同人及HFA仔豬的指紋圖譜可聚為一個大類，而普通仔豬為一個類群(圖4B)。以HFA仔豬的供體(H4)的ERIC-PCR擴增所得的所有DNA片斷作為混合探針與其他樣品的ERIC-PCR指紋圖譜進行基因組水平的雜交(圖4C)，9個不同人的指紋圖譜雜交信號較強(H3個體例外)，顯示同源的序列較多，說明不同個體的人的腸道中存在一些共有的細菌類群。5個普通仔豬的指紋圖譜均表現出較弱的雜交信號，表明仔豬腸道菌群的DNA的序列組成與人(H4個體)的腸道菌群的DNA的序列同源性低，反映其菌群組成與人差異較大。HFA仔豬樣品的雜交結果也顯示出了很強的信號，表明其指紋圖譜上DNA片斷與供體高度同源，顯示其腸道菌群的組成與供體相似，而與普通仔豬差異顯著。
(3)HFA仔豬腸道菌群中雙岐桿菌定植檢測雙岐桿菌是人腸道菌群的重要組成部分，約占成人腸道菌總數的3％以上，在嬰兒腸道菌中更高達75％-91％。雙岐桿菌也是和腸道健康密切相關的一類菌。因此，分析雙岐桿菌的組成是檢測HFA仔豬腸道菌群的一個重要內容。
本發(fā)明采用雙岐桿菌屬特異性PCR-TGGE(溫度梯度變性凝膠電泳)方法檢測HFA仔豬腸道雙岐桿菌的組成，并比較其與供體以及普通仔豬的雙岐桿菌的組成的異同。雙岐桿菌屬特異性PCR采用引物Bif164-f5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’和Bif662-r 5’-CCACCGTTACACCGGGAA-3’。擴增體系及程序均采用現有成熟技術。對不同人、HFA仔豬及普通仔豬糞便樣品的雙岐桿菌屬特異性擴增結果發(fā)現，該對引物(針對人源雙岐桿菌)在人及HFA仔豬樣品中均可擴增得到目標產物，而在所有分析的(20例)普通仔豬的樣品中均無擴增產物。此結果說明常見的人源雙岐桿菌在普通仔豬的腸道中不存在或含量極低，而HFA仔豬腸道中已定植了人源的雙岐桿菌。對HFA仔豬及供體人的雙岐桿菌屬特異性擴增產物進一步進行TGGE分析以直觀和精確地展示其腸道內各種雙岐桿菌的組成結構，結果見圖5，其中(A)為HFA仔豬和供體的雙歧桿菌類群性PCR-TGGE圖譜，(B)為聚類分析結果。TGGE使用TGGE-Mini system(Biometra，德國)進行，方法參考使用說明。不同樣品的雙岐桿菌屬特異性擴增產物在含8M尿素和20％(vol/vol)甲酰胺的聚丙烯酰胺凝膠(濃度為8％)上進行分離，150V電泳3小時，變性溫度范圍為46-54℃。由圖5TGGE圖譜可看出，HFA仔豬腸道內雙歧桿菌的TGGE圖譜與其供體人的圖譜相似性高，表明二者的雙歧桿菌類的組成高度相似，從而證實供體人的雙歧桿菌成功地在HFA仔豬腸道內進行了“復制”。
(4)HFA仔豬腸道菌群中擬桿菌定植檢測擬桿菌是一類革蘭氏陰性、明顯發(fā)酵糖類、不產生黑色素的厭氧菌，是人和動物胃腸道菌群中最優(yōu)勢的一個類群，占人腸道菌群總量的25％以上。擬桿菌屬細菌的特異性擴增采用引物Bfr-F5’-CTGAACCAGCCAAGTAGCG-3’和Bfr-R5’-CCGCAAACTTTCACA ACTGACTTA-3’。為便于TGGE檢測，一段富含GC的序列5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’被添加于引物Bfr-R的5’端。PCR產物在含8M尿素和20％(vol/vol)甲酰胺的聚丙烯酰胺凝膠(濃度為8％)上進行分離，150V電泳3小時，變性溫度范圍為36-45C。結果見圖6，其中，(A)為HFA仔豬和供體的擬桿菌類群性PCR-TGGE圖譜，(B)為聚類分析結果。從不同人、HFA仔豬及普通仔豬的擬桿菌TGGE圖譜比較可看出，HFA仔豬的圖譜與其供體的圖譜相似性高達80％以上，尤其是主帶的位置和亮度基本一致，而與其他人和普通仔豬的圖譜顯著不同。此結果說明供體的擬桿菌也在HFA仔豬腸道內成功定植。
綜上所述，對HFA仔豬腸道菌群的分子檢測表明，供體人腸道菌群的兩個重要類群-雙岐桿菌和擬桿菌在HFA仔豬腸道中成功定植，且模型仔豬腸道菌群的總體指紋圖譜也與供體人高度同源，而與普通仔豬差異顯著。以上結果證實，用本發(fā)明描述的方法建立的仔豬模型，其腸道菌群具備了供體人腸道菌群的主要組成特征。
權利要求
1.一種人源菌群仔豬模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備健康人糞便菌懸液；(2)對懷孕待產母豬剖腹取胎產仔；(3)仔豬的飼養(yǎng)，剖腹取出的仔豬飼養(yǎng)于全天候過濾正壓通風的隔離室中；(4)對仔豬接種人糞便菌懸液使人源菌群逐步在仔豬胃腸道中定植。
2.如權利要求1所述的人源菌群仔豬模型的構建方法，其特征是，所述的制備健康人糞便菌懸液，具體為采集剛排出的新鮮健康人糞便，迅速懸浮于含10％甘油的預還原處理過的0.05M，pH7.4的PBS緩沖液中，稍靜置，上清即為人糞便菌懸液。
3.如權利要求1所述的人源菌群仔豬模型的構建方法，其特征是，所述的仔豬的飼養(yǎng)，隔離室和飼養(yǎng)仔豬的不銹鋼籠子需徹底消毒，消毒采用以下方法先用1％來蘇爾溶液擦拭隔離室地面、門、窗及籠子，再用2％過氧乙酸噴灑隔離室2小時，紫外燈照射12小時以上，最后用高錳酸鉀∶甲醛∶水＝1∶2∶1溶液熏蒸隔離室24小時并開啟排送風系統(tǒng)待用。
4.如權利要求1所述的人源菌群仔豬模型的構建方法，其特征是，所述的對仔豬接種人糞便菌懸液，具體為于仔豬出生12小時起開始第一次接種人糞便菌懸液1ml/day，每天1次，連續(xù)3天，第4-10天每隔一天接種1次，每次1ml。
5.一種人源菌群仔豬腸道中菌群分子檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取糞便微生物基因組DNA；(2)ERIC-PCR指紋圖譜分析及群落DNA雜交；(3)HFA仔豬腸道菌群中雙岐桿菌定植檢測；(4)HFA仔豬腸道菌群中擬桿菌定植檢測；所述的HFA仔豬腸道菌群中雙歧桿菌和擬桿菌定植檢測，采用類群特異性PCR-TGGE方法。
6.如權利要求5所述的人源菌群仔豬腸道中菌群分子檢測方法，其特征是，所述的提取糞便微生物基因組DNA，具體為自仔豬出生4-5天排出正常糞便起，每天采集新鮮仔豬糞便，提取糞便菌群總DNA。
7.如權利要求5所述的人源菌群仔豬腸道中菌群分子檢測方法，其特征是，用ERIC-PCR指紋圖譜技術連續(xù)監(jiān)測HFA仔豬自出生后腸道菌群組成的動態(tài)變化，25μl的ERIC-PCR體系包括引物E1和E2各25pmol，其序列分別為5’-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3’，5’-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3’，dNTP各5mM，模板DNA 80ng，TaqDNA聚合酶2.5U以及配套1×buffer及50mmol MgCl2；ERIC-PCR擴增程序如下95℃ 7min；然后94℃變性1min，52℃變性1min，65℃延伸8min，共執(zhí)行30個循環(huán)；最后再65℃延伸16min；指紋圖譜采用UVI band/map軟件進行相似性指數的分析和聚類。
8.如權利要求5所述的人源菌群仔豬腸道中菌群分子檢測方法，其特征是，所述的HFA仔豬腸道菌群中雙歧桿菌定植檢測，雙岐桿菌屬特異性PCR采用引物Bif164-f，其序列為5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’和Bif662-r，其序列為5’-CCACCGTTACACCGGGAA-3’。
9.如權利要求5所述的人源菌群仔豬腸道中菌群分子檢測方法，其特征是，所述的HFA仔豬腸道菌群中擬桿菌定植檢測，擬桿菌屬細菌的特異性擴增采用引物Bfr-F，其序列為5’-CTGAACCAGCCAAGTAGCG-3’和Bfr-R，其序列為5’-CCGCAAACTTTCACA ACTGACTTA-3’；為便于TGGE檢測，一段富含GC的序列5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’被添加于引物Bfr-R的5’端。
10.如權利要求5所述的人源菌群仔豬腸道中菌群分子檢測方法，其特征是，PCR產物在含8M尿素和體積比為20％的甲酰胺的濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠上進行分離，150V電泳3小時，變性溫度范圍為雙歧桿菌類為46-54℃和擬桿菌類為36-45℃。
全文摘要
一種微生物技術領域的人源菌群仔豬模型的構建及仔豬腸道中菌群分子檢測方法。構建步驟(1)制備健康人糞便菌懸液；(2)對懷孕待產母豬剖腹取胎產仔；(3)仔豬飼養(yǎng)于全天候高效過濾正壓通風的隔離室中；(4)接種。檢測步驟(1)提取糞便微生物基因組DNA；(2)ERIC－PCR指紋圖譜分析及群落DNA雜交分析；(3)HFA仔豬腸道菌群中雙岐桿菌定植分析；(4)HFA仔豬腸道菌群中擬桿菌定植分析。本發(fā)明在仔豬模型胃腸道中成功定植了供體人的雙岐桿菌和擬桿菌，指紋圖譜的比較也顯示仔豬模型腸道菌群的指紋圖譜與供體人同源性高，可用于研究腸道菌群與其宿主生理及免疫特性的相互關系，也可用于評價功能性食品或藥物對腸道菌群的調節(jié)和代謝作用。
文檔編號C12Q1/68GK1840206SQ20061002345
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月19日 優(yōu)先權日2006年1月19日
發(fā)明者趙立平, 龐小燕, 華修國, 崔立 申請人:上海交通大學