專利名稱：安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的系統(tǒng)，具體是一種安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)病毒的方式是采用轉(zhuǎn)瓶方式培養(yǎng)。這種方式產(chǎn)量低，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，重復(fù)性不好，批次差異大。隨著生物反應(yīng)器的出現(xiàn)，大大解決了上述問題，一般細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器由反應(yīng)器罐體、提供熱量的夾套、氣體分布器、機(jī)械攪拌裝置、連有眾多進(jìn)樣口、取樣口、排氣口、傳感器接口的蓋板和溫度傳感器、pH電極、溶氧電極等感應(yīng)元件組成，很好地解決了混合、傳質(zhì)和供氧問題，為細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增度增殖提供了適宜的環(huán)境，一般最大細(xì)胞密度可達(dá)107cell/ml以上，這樣病毒的產(chǎn)量也相應(yīng)得到提高。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，劉建青等人在《山東醫(yī)藥》2005，45(23)7～8上發(fā)表的“固定床生物反應(yīng)器生產(chǎn)高滴度乙型腦炎病毒”一文中，提出了一種使用Fibra-Cel Disks為載體的固定床培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)乙型腦炎病毒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)由培養(yǎng)液輸送管道、蠕動(dòng)泵、生物反應(yīng)器、供氣裝置等組成。該系統(tǒng)由培養(yǎng)液輸送管道、蠕動(dòng)泵、生物反應(yīng)器、供氣裝置等組成。首先，用加有10％新生牛血清的199(Gibco)作為細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基進(jìn)行灌注培養(yǎng)方式大量擴(kuò)增Vero細(xì)胞，高密度培養(yǎng)，達(dá)到一定程度后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用加有0.4％人血白蛋白的199(Gibco)作為細(xì)胞維持培養(yǎng)基，接種病毒，采用灌注培養(yǎng)方式大量增殖病毒。檢索中還發(fā)現(xiàn)，Y.Z.Ghendon等在《Vaccine》2005，234678～4684上發(fā)表的“Development of cell culture(MDCK)live cold-adapted(CA)attenuated influenza vaccine”(細(xì)胞培養(yǎng)活耐寒減毒流感疫苗的發(fā)展，《疫苗》)一文中，提出了一種使用Cytodex-1微載體懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)由培養(yǎng)液輸送管道、蠕動(dòng)泵、生物反應(yīng)器、細(xì)胞分離器、供氣裝置等組成。首先，用Axcevir-MDCK無血清培養(yǎng)基通過灌注培養(yǎng)方式大量擴(kuò)增MDCK細(xì)胞，高密度培養(yǎng)，達(dá)到一定程度后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，換用加有2μg/ml胰酶的Axcevir-MDCK無血清培養(yǎng)基作為細(xì)胞維持液，接種病毒，采用分批培養(yǎng)方式大量增殖病毒。以上兩種系統(tǒng)中，細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖兩個(gè)過程單獨(dú)來看有連續(xù)生產(chǎn)的，但整個(gè)過程是間歇和不封閉進(jìn)行的，是在前一個(gè)過程單元結(jié)束后才開始下一個(gè)過程單元的，不利于大規(guī)模、連續(xù)性、安全生產(chǎn)病毒疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前病毒疫苗生產(chǎn)中“不連續(xù)性和不封閉性”這一不足之處，本發(fā)明提供一種安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，使其用于細(xì)胞培養(yǎng)、病毒增殖、病毒滅活的連續(xù)封閉生產(chǎn)，首先采用灌注培養(yǎng)方式進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)，然后流加新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，從反應(yīng)器流出的細(xì)胞進(jìn)入病毒增殖單元進(jìn)行病毒增殖，病毒進(jìn)入收集罐收集，封閉滅活，這樣能夠減少不斷開、關(guān)反應(yīng)器引起的染菌和病毒外泄的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)整套系統(tǒng)便于自動(dòng)化控制，能夠安全、高效、大規(guī)模增殖病毒用于疫苗生產(chǎn)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括氣體供應(yīng)單元、蒸汽發(fā)生器、細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置、細(xì)胞擴(kuò)增單元、初級(jí)灌注收集裝置、基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置、病毒增殖單元、細(xì)胞/載體分離裝置、病毒收集裝置、熱源供應(yīng)裝置、酸/堿液供應(yīng)裝置和陳舊載體收集裝置。連接方式為氣體供應(yīng)單元分兩路，出口端的一路與細(xì)胞擴(kuò)增單元的進(jìn)口端連接，滿足細(xì)胞擴(kuò)增所需的氣體要求，另一路與病毒增殖單元的進(jìn)口端連接，滿足病毒增殖所需的氣體要求；蒸汽發(fā)生器的出口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元的進(jìn)口端連接，用于整個(gè)系統(tǒng)的在位滅菌；細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置的出口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元的進(jìn)口端連接，初級(jí)灌注收集裝置的入口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元的出口端連接，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的初級(jí)灌注培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)；熱源供應(yīng)裝置分別與細(xì)胞擴(kuò)增單元和病毒增殖單元連接，滿足所需溫度要求；酸/堿液供應(yīng)裝置的出口端分別與細(xì)胞擴(kuò)增單元和病毒增殖單元的進(jìn)口端連接，滿足所需pH值要求；細(xì)胞擴(kuò)增單元的出口端與病毒增殖單元的進(jìn)口端連接；基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置的出口端與病毒增殖單元的進(jìn)口端連接；細(xì)胞/載體分離裝置的進(jìn)口端與病毒增殖單元的出口端相連接，三個(gè)出口端分別與病毒增殖單元、病毒收集裝置和陳舊載體收集裝置的進(jìn)口端連接；陳舊載體收集裝置的出口端和病毒收集裝置的進(jìn)口端連接。
氣體供應(yīng)單元包括氣體鋼瓶、粗過濾器、空氣壓縮機(jī)、三通、第一自控閥門、氣體流量計(jì)、氣體混合裝置和氣體增濕裝置。其中，氣體鋼瓶有三個(gè)，即N2氣體鋼瓶、CO2氣體鋼瓶、O2氣體鋼瓶；氣體混合裝置由不銹鋼材料制成，呈橢圓柱形，其橢圓頂部一側(cè)是四個(gè)氣體入口，另一側(cè)是一個(gè)混合氣體出口；氣體增濕裝置主體為圓柱型半球頂玻璃容器，其頂部整合有第一進(jìn)氣口和第一出氣口，第一進(jìn)氣接口深入容器內(nèi)近底部處，從第一出氣口出來的氣體通過第一0.2μm濾膜過濾供氣。其連接方式為粗過濾器與空氣壓縮機(jī)的入口相連，三個(gè)氣體鋼瓶、空氣壓縮機(jī)通過四條銅輸氣管道順次連接第一自控閥門、氣體流量計(jì)以及氣體混合裝置上的四個(gè)氣體入口，混合氣體出口和氣體增濕裝置的第一進(jìn)氣口相接，第一出氣口與第一0.2μm濾膜相接。
氣體供應(yīng)單元將供氣分為兩個(gè)通路，可以使細(xì)胞擴(kuò)增單元與病毒增殖單元得到不同的供氣需求，有利于細(xì)胞擴(kuò)增和病毒增殖過程的順利進(jìn)行，這個(gè)過程通過控制N2、CO2、O2和空氣的流量來實(shí)現(xiàn)。
細(xì)胞擴(kuò)增單元包括第一熱源輸入口、第一熱源輸出口、第一夾套、細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體、第二進(jìn)氣口、蒸汽輸入口、細(xì)胞接種口、細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口、第一酸/堿輸入口、第二自控閥門、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置、第一傳感器、初級(jí)灌注輸出口、第一取樣口、細(xì)胞混合液輸出口、第二出氣口、第二0.2μm濾膜、第一蓋板、細(xì)胞截流裝置、第一攪拌裝置、第一氣體分布器和第一控制器及執(zhí)行器。其連接方式為細(xì)胞擴(kuò)增單元的主體由細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體和覆蓋其上的第一蓋板組成，細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體由耐腐蝕性高硼硅玻璃制成，它的周圍是第一夾套，上面設(shè)有的第一熱源輸入口和第一熱源輸出口；第一蓋板為圓形鋼制材料，其上連有很多出入口，入口包括第二進(jìn)氣口、蒸汽輸入口、細(xì)胞接種口、細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口和第一酸/堿輸入口，出口包括第一傳感器、初級(jí)灌注輸出口、第一取樣口、細(xì)胞混合液輸出口和第二出氣口；初級(jí)灌注輸出口通過不銹鋼管與細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體中的細(xì)胞截流裝置連接；第二進(jìn)氣口通過硅橡膠管與第一氣體分布器相連；第二出氣口與第二0.2μm濾膜相連；第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置位于第一蓋板的上面，與第一攪拌裝置相連；第一控制器及執(zhí)行器通過數(shù)據(jù)線一端與第一傳感器連接，另一端與第二自控閥門、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置和氣體供應(yīng)單元中的第一自控閥門連接，在線自動(dòng)控制細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基輸入口、第一酸/堿輸入口、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置、細(xì)胞混合液輸出口和氣體供應(yīng)單元中的第一自控閥門。
在細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)單元中，蒸汽輸入口與蒸汽發(fā)生器相連，可以用蒸汽對整個(gè)系統(tǒng)滅菌；第一熱源在第一夾套內(nèi)循環(huán)流動(dòng)，維持細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體內(nèi)培養(yǎng)介質(zhì)的溫度；第一取樣口可用于離線取樣測量；同時(shí)，第一控制器及執(zhí)行器通過第一傳感器包括測溫元件、pH電極、溶氧電極和細(xì)胞密度測量電極，在線自動(dòng)控制細(xì)胞生長培養(yǎng)基和第一酸/堿的輸入量、第一攪拌裝置的轉(zhuǎn)速、細(xì)胞混合液的輸出量和供氣組成和流量，為細(xì)胞擴(kuò)增提供適宜的溫度、pH、溶氧等環(huán)境和適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長培養(yǎng)基流率，使從細(xì)胞擴(kuò)增單元中流出的細(xì)胞混合液密度適中，便于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒過程中病毒增殖步驟的順利進(jìn)行。
首先在細(xì)胞擴(kuò)增單元中接種一定的細(xì)胞，通過細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口、初級(jí)灌注輸出口、細(xì)胞截流裝置和初級(jí)灌注收集裝置的連接，進(jìn)行初級(jí)灌注培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至適當(dāng)密度后停止初級(jí)灌注培養(yǎng)，由細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置提供流加細(xì)胞生長培養(yǎng)基(若微載體懸浮培養(yǎng)時(shí)，還要向培養(yǎng)基中加入微載體并混合流加)，同時(shí)細(xì)胞混合液流入病毒增殖單元，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)。
病毒增殖單元包括第二熱源輸入口、第二熱源輸出口、第二夾套、病毒增殖反應(yīng)器罐體、第三進(jìn)氣口、細(xì)胞混合液輸入口、細(xì)胞/載體回流輸入口、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口、第二酸/堿輸入口、第三自控閥門、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置、病毒接種口、二傳感器、第二取樣口、病毒混合液輸出口、第三出氣口、第三0.2μm濾膜、第二蓋板、第二攪拌裝置、第二氣體分布器和第二控制器及執(zhí)行器。其連接方式為病毒增殖單元的主體由病毒增殖反應(yīng)器罐體和覆蓋其上的第二蓋板組成，病毒增殖反應(yīng)器罐體由耐腐蝕性高硼硅玻璃制成，它的周圍是第二夾套，上面設(shè)有的第二熱源輸入口和第二熱源輸出口；第二夾套為圓形鋼制材料，上連有很多出入口，入口包括第三進(jìn)氣口、細(xì)胞混合液輸入口、細(xì)胞/載體回流輸入口、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口、第二酸/堿輸入口和病毒接種口，出口包括第二傳感器、第二取樣口、病毒混合液輸出口和第三出氣口；第三進(jìn)氣口；通過硅橡膠管與第二氣體分布器；相連；第三出氣口和第三0.2μm濾膜相連；第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置位于第二蓋板的上面，與第二攪拌裝置相連；第二控制器及執(zhí)行器通過數(shù)據(jù)線一端與第二傳感器連接，另一端與第三自控閥門、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置、細(xì)胞擴(kuò)增單元中的第二自控閥門和氣體供應(yīng)單元中的第一、二自控閥門連接，在線自動(dòng)控制第一、二自控閥門、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口、第二酸/堿輸入口、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置、細(xì)胞/載體回流輸入口、病毒混合液輸出口。
在病毒增殖單元中，第二熱源在第二夾套內(nèi)循環(huán)流動(dòng)，維持病毒增殖反應(yīng)器罐體內(nèi)培養(yǎng)介質(zhì)的溫度；基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有病毒增殖所需的外源因子，與細(xì)胞混合液按一定比例混合流加，一同組成病毒增殖培養(yǎng)基，起到稀釋血清和提供營養(yǎng)物質(zhì)的作用；第二取樣口可用于離線取樣測量；同時(shí)，第二控制器及執(zhí)行器通過第二傳感器包括測溫元件、pH電極、溶氧電極和營養(yǎng)物質(zhì)測量電極，在線自動(dòng)控制第一自控閥門、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和第二酸/堿的輸入量、第二攪拌裝置的轉(zhuǎn)速、病毒混合液的輸出量和供氣組成和流量，為細(xì)胞擴(kuò)增病毒增殖提供適宜的溫度、pH、溶氧等環(huán)境和適當(dāng)?shù)牟《净旌弦狠敵隽髀?，維持系統(tǒng)穩(wěn)定和病毒生產(chǎn)的順利進(jìn)行。
在病毒增殖單元中，當(dāng)細(xì)胞混合液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基按一定比例混合流加，組成病毒增殖培養(yǎng)基最先流入病毒增殖反應(yīng)器罐體時(shí)，從病毒接種口接種病毒進(jìn)行微分式病毒初級(jí)增殖，當(dāng)液體體積達(dá)到病毒增殖反應(yīng)器罐體的有效體積時(shí)，抽出病毒混合液，維持系統(tǒng)平衡，進(jìn)行病毒的連續(xù)增殖過程。
細(xì)胞/載體分離裝置包括細(xì)胞/載體回流輸出口、病毒混合液輸入口、第四自控閥門、外框體、病毒上清液輸出口、第三傳感器、沉積板、第三取樣口、陳舊載體輸出口、載體輸出閥門和第三控制器及執(zhí)行器。
細(xì)胞/載體分離裝置是利用密度差異，沉降分離細(xì)胞/載體、病毒上清夜和陳舊載體的，橫截面是“倒L”形狀，與垂直方向呈15°～45°，上部分長寬比在3～5之間，用于病毒上清液的分離；下部分長寬比在5～10之間，用于細(xì)胞/載體的回流和陳舊載體的回收。其中，外框體構(gòu)成細(xì)胞/載體分離裝置的外殼；沉積板平行分布在細(xì)胞/載體分離裝置內(nèi)部，間距在0.5～1.5cm之間，硅滲處理；中間部位是病毒混合液輸入口，上端是病毒上清液輸出口和第三傳感器，下端是細(xì)胞/載體回流輸出口、第三取樣口和陳舊載體輸出口；陳舊載體輸出口通過裝有載體輸出閥門的硅橡膠管線與陳舊載體收集裝置相連；第三控制器及執(zhí)行器通過數(shù)據(jù)線一端與第三傳感器連接，另一端與第四自控閥門、病毒增殖單元的第三自控閥門、細(xì)胞擴(kuò)增單元中的第二自控閥門和氣體供應(yīng)單元中的第一自控閥門連接，在線自動(dòng)控制第一、二、三自控閥門、病毒混合液輸入口、細(xì)胞/載體回流輸出口和病毒上清液輸出口。
通過細(xì)胞/載體分離裝置，將病毒上清液抽至病毒收集裝置以維持整個(gè)操作系統(tǒng)的平衡，沉降下來的細(xì)胞/載體通過回流輸出口回流到病毒增殖單元，達(dá)到充分利用病毒宿主細(xì)胞、提高病毒產(chǎn)量的目的，同時(shí)，可以根據(jù)系統(tǒng)運(yùn)作情況，將在反應(yīng)器中停留時(shí)間過長的細(xì)胞已大量脫落的陳舊載體間歇排放到陳舊載體收集裝置，減少對病毒增殖的影響，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集裝置。
病毒收集裝置包括液體分配器入口、液體分配器、液體分配器出口、液位自控開關(guān)閥門、病毒液輸入口、液位傳感器、病毒液輸出口、滅活劑輸入口、第四0.2μm濾膜、第四出氣口、病毒罐、和第四控制器及執(zhí)行器。其中，液體分配器的一端通過液體分配器入口與細(xì)胞/載體分離裝置中的病毒上清液輸出口相連，另一端液體分配器出口通過液位自控開關(guān)閥門與病毒罐上的病毒液輸入口相連；病毒罐與病毒液輸入口、液位傳感器、病毒液輸出口、滅活劑輸入口和第四出氣口相連；第四出氣口與第四0.2μm濾膜相連；第四控制器及執(zhí)行器通過數(shù)據(jù)線一端與液位傳感器連接，另一端與液位自控開關(guān)閥門連接，在線自動(dòng)控制病毒液的收集。
在病毒收集裝置中，病毒收集是通過一系列帶有液位自控開關(guān)閥門控制的病毒罐完成的，每一個(gè)病毒罐收集滿病毒后，通過液位自控開關(guān)閥門在關(guān)閉該病毒罐的同時(shí)打開其它病毒罐繼續(xù)收集病毒，然后把滿的病毒罐取下，換上空的病毒罐，如此反復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)病毒的連續(xù)收集。而且，根據(jù)病毒生產(chǎn)能力的多少，可以將一組病毒罐和另一組病毒罐分開，通過液位自控開關(guān)閥門的控制，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)時(shí)連續(xù)收集病毒的目的。
將收集滿病毒的病毒罐取下后，可以通過采用常規(guī)的病毒滅活劑如β丙內(nèi)酯、福爾馬林等滅活病毒，然后再通過離心、超濾、層析等純化方法和加入佐劑和穩(wěn)定劑等程序制備病毒疫苗。
本發(fā)明工作時(shí)，首先用蒸汽發(fā)生器對系統(tǒng)進(jìn)行一體化滅菌。供氣包括N2、CO2、O2和空氣，通過粗過濾器、氣體增濕裝置和0.2μm濾膜進(jìn)行預(yù)處理，氣體供應(yīng)單元將供氣分為兩個(gè)通路，調(diào)節(jié)N2、CO2、O2和空氣四種氣體的流量，可以使細(xì)胞擴(kuò)增單元與病毒增殖單元得到不同的供氣需求；酸/堿液供應(yīng)裝置為細(xì)胞擴(kuò)增單元和病毒增殖單元添加酸/堿，調(diào)節(jié)pH值；熱源供應(yīng)裝置為細(xì)胞擴(kuò)增單元和病毒增殖單元提供熱源，調(diào)節(jié)溫度；細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置和基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置分別為細(xì)胞擴(kuò)增單元和病毒增殖單元提供細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖階段所需的培養(yǎng)基；傳感器、控制器及執(zhí)行器在線檢測和控制細(xì)胞擴(kuò)增單元與病毒增殖單元的溫度、pH、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基的流加速率，使系統(tǒng)中各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到設(shè)定值，維持系統(tǒng)的穩(wěn)定。首先在細(xì)胞擴(kuò)增單元中接種一定的細(xì)胞，初級(jí)灌注培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增至適當(dāng)密度后由細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置提供流加細(xì)胞生長培養(yǎng)基(微載體懸浮培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中還要混有微載體)，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞混合液流入病毒增殖單元，同時(shí)通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置向病毒增殖單元中流加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，二者按一定比例混合共同組成病毒增殖培養(yǎng)基，從病毒接種口接種病毒，進(jìn)行微分式病毒初級(jí)增殖，當(dāng)液體體積達(dá)到病毒增殖反應(yīng)器罐體的有效體積時(shí)，從病毒增殖單元中流出的病毒混合液進(jìn)入細(xì)胞/載體分離裝置，進(jìn)行病毒的連續(xù)增殖過程，通過細(xì)胞/載體分離裝置的沉降分離，細(xì)胞/載體回流進(jìn)入病毒增殖單元，病毒上清液進(jìn)入病毒收集裝置進(jìn)行滅活，實(shí)現(xiàn)連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒和滅活，而且可依據(jù)系統(tǒng)運(yùn)行情況間歇收集陳舊載體至陳舊載體收集裝置，可減少陳舊載體對病毒增殖的影響，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集裝置一同滅活。
通過以上說明，可見，本發(fā)明系統(tǒng)將細(xì)胞擴(kuò)增和病毒增殖兩個(gè)過程關(guān)聯(lián)起來，在連續(xù)封閉下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)/滅活病毒，一方面，便于自動(dòng)化控制，標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，另一方面，降低了污染機(jī)會(huì)和提高了生產(chǎn)安全系數(shù)，是十分適于大規(guī)模高效連續(xù)生產(chǎn)病毒的新系統(tǒng)。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意2為本發(fā)明氣體供應(yīng)單元結(jié)構(gòu)示意3為本發(fā)明細(xì)胞擴(kuò)增單元結(jié)構(gòu)示意4為本發(fā)明病毒增殖單元結(jié)構(gòu)示意5為本發(fā)明細(xì)胞/載體分離裝置結(jié)構(gòu)示意6為本發(fā)明病毒收集裝置結(jié)構(gòu)示意中，1.氣體供應(yīng)單元 2.蒸汽發(fā)生器 3.細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置 4.細(xì)胞擴(kuò)增單元 5.初級(jí)灌注收集裝置 6.基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置 7.病毒增殖單元 8.細(xì)胞/載體分離裝置 9.病毒收集裝置 10.熱源供應(yīng)裝置 11.酸/堿液供應(yīng)裝置 12.陳舊載體收集裝置 13.氣體鋼瓶 14.粗過濾器 15.空氣壓縮機(jī) 16.三通 17.第一自控閥門 18.氣體流量計(jì) 19.氣體混合裝置 20.氣體增濕裝置 21.氣體入口22.混合氣體出口 23.第一進(jìn)氣口 24第一出氣口 25.第一0.2μm濾膜 26.第一熱源輸入口 27.第一熱源輸出口 28.第一夾套 29.細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體30.第二進(jìn)氣口 31.蒸汽輸入口 32.細(xì)胞接種口 33.細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口 34.第一酸/堿輸入口 35.第二自控閥門 36.第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置 37.第一傳感器 38.初級(jí)灌注輸出口 39.第一取樣口 40.細(xì)胞混合液輸出口 41.第二出氣口42.第二0.2μm濾膜 43.第一蓋板 44.細(xì)胞截流裝置 45.第一攪拌裝置 46.第一氣體分布器 47.第一控制器及執(zhí)行器 48.第二熱源輸入口 49.第二熱源輸出口 50.第二夾套 51.病毒增殖反應(yīng)器罐體 52.第三進(jìn)氣口 53.細(xì)胞混合液輸入口 54.細(xì)胞/載體回流輸入口 55.基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口 56.第二酸/堿輸入口 57.第三自控閥門 58.第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置 59.病毒接種口 60.第二傳感器 61.第二取樣口 62.病毒混合液輸出口 63.第三出氣口 64.第三0.2μm濾膜 65.第二蓋板 66.第二攪拌裝置 67.第二氣體分布器 68.第二控制器及執(zhí)行器 69.細(xì)胞/載體回流輸出口 70.病毒混合液輸入口 71.第四自控閥門 72.外框體 73.病毒上清液輸出口 74.第三傳感器 75.沉積板 76.第三取樣口 77.陳舊載體輸出口 78.載體輸出閥門 79.第三控制器及執(zhí)行器 80.液體分配器入口 81.液體分配器 82.液體分配器出口 83.液位自控開關(guān)閥門 84.病毒液輸入口 85.液位傳感器 86.病毒液輸出口 87.滅活劑輸入口 88.第四0.2μm濾膜 89.第四出氣口 90.病毒罐 91.第四控制器及執(zhí)行器。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示，本發(fā)明包括氣體供應(yīng)單元1、蒸汽發(fā)生器2、細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置3、細(xì)胞擴(kuò)增單元4、初級(jí)灌注收集裝置5、基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置6、病毒增殖單元7、細(xì)胞/載體分離裝置8、病毒收集裝置9、熱源供應(yīng)裝置10、酸/堿液供應(yīng)裝置11、陳舊載體收集裝置12。連接方式為氣體供應(yīng)單元1分兩路，出口端的一路與細(xì)胞擴(kuò)增單元4的進(jìn)口端連接，滿足細(xì)胞擴(kuò)增所需的氣體要求，另一路與病毒增殖單元7的進(jìn)口端連接，滿足病毒增殖所需的氣體要求；蒸汽發(fā)生器2的出口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元4的進(jìn)口端連接，用于整個(gè)系統(tǒng)的在位滅菌；細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置3的出口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元4的進(jìn)口端連接、初級(jí)灌注收集裝置5的入口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元4的出口端連接，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的初級(jí)灌注培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)；熱源供應(yīng)裝置10分別與細(xì)胞擴(kuò)增單元4和病毒增殖單元7連接，滿足所需溫度要求；酸/堿液供應(yīng)裝置11的出口端分別與細(xì)胞擴(kuò)增單元4和病毒增殖單元7的進(jìn)口端連接，滿足所需pH值要求；細(xì)胞擴(kuò)增單元4的出口端與病毒增殖單元7的進(jìn)口端連接；基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置6的出口端與病毒增殖單元7的進(jìn)口端連接；細(xì)胞/載體分離裝置8的進(jìn)口端與病毒增殖單元7的出口端相連接，三個(gè)出口端分別與病毒增殖單元7、病毒收集裝置9和陳舊載體收集裝置12的進(jìn)口端連接；陳舊載體收集裝置12的出口端和病毒收集裝置9的進(jìn)口端連接。
如圖2所示，氣體供應(yīng)單元1包括氣體鋼瓶13、粗過濾器14、空氣壓縮機(jī)15、三通16、第一自控閥門17、氣體流量計(jì)18、氣體混合裝置19和氣體增濕裝置20。其中，氣體鋼瓶13有三個(gè)，即N2氣體鋼瓶、CO2氣體鋼瓶、O2氣體鋼瓶；氣體混合裝置19由不銹鋼材料制成，呈橢圓柱形，其橢圓頂部一側(cè)是四個(gè)氣體入口21，另一側(cè)是一個(gè)混合氣體出口22；氣體增濕裝置20主體為圓柱型半球頂玻璃容器，其頂部整合有第一進(jìn)氣口23和第一出氣口24，第一進(jìn)氣接口23深入容器內(nèi)近底部處，從第一出氣口24出來的氣體通過第一0.2μm濾膜25過濾供氣。連接方式為粗過濾器14與空氣壓縮機(jī)15的入口相連，三個(gè)氣體鋼瓶13、空氣壓縮機(jī)15通過四條銅輸氣管道順次連接第一自控閥門17、氣體流量計(jì)18以及氣體混合裝置19上的四個(gè)氣體入口21，混合氣體出口22和氣體增濕裝置的第一進(jìn)氣口23相接，第一出氣口24與第一0.2μm濾膜25相接。氣體供應(yīng)單元將供氣分為兩個(gè)通路，可以使細(xì)胞擴(kuò)增單元與病毒增殖單元得到不同的供氣需求，這個(gè)過程通過控制N2、CO2、O2和空氣的流量來實(shí)現(xiàn)。
如圖3所示，細(xì)胞擴(kuò)增單元4包括第一熱源輸入口26、第一熱源輸出口27、第一夾套28、細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體29、第二進(jìn)氣口30、蒸汽輸入口31、細(xì)胞接種口32、細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口33、第一酸/堿輸入口34、第二自控閥門35、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置36、第一傳感器37、初級(jí)灌注輸出口38、第一取樣口39、細(xì)胞混合液輸出口40、第二出氣口41、第二0.2μm濾膜42、第一蓋板43、細(xì)胞截流裝置44、第一攪拌裝置45、第一氣體分布器46、第一控制器及執(zhí)行器47。連接方式為細(xì)胞擴(kuò)增單元4的主體由細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體29和覆蓋其上的第一蓋板43組成，細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體29由耐腐蝕性高硼硅玻璃制成，它的周圍是第一夾套28，上面設(shè)有的第一熱源輸入口26和第一熱源輸出口27；第一蓋板43為圓形鋼制材料，其上連有很多出入口，提供適宜細(xì)胞增殖培養(yǎng)環(huán)境。第一蓋板43的入口包括第二進(jìn)氣口30、蒸汽輸入口31、細(xì)胞接種口32、細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口33和第一酸/堿輸入口34，出口包括第一傳感器37、初級(jí)灌注輸出口38、第一取樣口39、細(xì)胞混合液輸出口40和第二出氣口41。其中，蒸汽輸入口31與蒸汽發(fā)生器2相連；初級(jí)灌注輸出口39通過不銹鋼管與細(xì)胞截流裝置44連接，用于初級(jí)灌注培養(yǎng)；第二進(jìn)氣口30通過硅橡膠管與第一氣體分布器46相連；第二出氣口41與第二0.2μm濾膜42相連。第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置36位于第一蓋板43的上面，與第一攪拌裝置45相連。第一控制器及執(zhí)行器47通過數(shù)據(jù)線一端與第一傳感器37連接，另一端與第二自控閥門35、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置36和氣體供應(yīng)單元1中的第一自控閥門17連接，在線自動(dòng)控制細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口33、第一酸/堿輸入口34、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置36、細(xì)胞混合液輸出口40和第一自控閥門17。
如圖4所示，病毒增殖單元7包括第二熱源輸入口48、第二熱源輸出口49、第二夾套50、病毒增殖反應(yīng)器罐體51、第三進(jìn)氣口52、細(xì)胞混合液輸入口53、細(xì)胞/載體回流輸入口54、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口55、第二酸/堿輸入口56、第三自控閥門57、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置58、病毒接種口59、第二傳感器60、第二取樣口61、病毒混合液輸出口62、第三出氣口63、第三0.2μm濾膜64、第二蓋板65、第二攪拌裝置66、第二氣體分布器67、第二控制器及執(zhí)行器68。連接方式為病毒增殖單元7的主體由病毒增殖反應(yīng)器罐體51和覆蓋其上的第二蓋板65組成，病毒增殖反應(yīng)器罐體51由耐腐蝕性高硼硅玻璃制成，它的周圍是第二夾套50，通過設(shè)有的第二熱源輸入口48和第二熱源輸出口49提供給病毒增殖單元7適宜溫度；第二蓋板65為圓形鋼制材料，其上連有很多出入口，提供適宜病毒增殖培養(yǎng)環(huán)境。第二蓋板65的入口包括第三進(jìn)氣口52、細(xì)胞混合液輸入口53、細(xì)胞/載體回流輸入口54、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口55、第二酸/堿輸入口56和病毒接種口59，出口包括第二傳感器60、第二取樣口61、病毒混合液輸出口62和第三出氣口63。其中，第三進(jìn)氣口52通過硅橡膠管與第二氣體分布器67相連；第三出氣口63和第三0.2μm濾膜64相連。第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置58位于第二蓋板65的上面，與第二攪拌裝置66相連。第二控制器及執(zhí)行器68通過數(shù)據(jù)線一端與第二傳感器60連接，另一端與第三自控閥門57、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置58、細(xì)胞擴(kuò)增單元4中的第二自控閥門35和氣體供應(yīng)單元1中的第一自控閥門17連接，在線自動(dòng)控制第一自控閥門17、第二自控閥門35、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口55、第二酸/堿輸入口56、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置58、細(xì)胞/載體回流輸入口54和病毒混合液輸出口62。
如圖5所示，細(xì)胞/載體分離裝置8包括細(xì)胞/載體回流輸出口69、病毒混合液輸入口70、第四自控閥門71、外框體72、病毒上清液輸出口73、第三傳感器74、沉積板75、第三取樣口76、陳舊載體輸出口77、載體輸出閥門78、第三控制器及執(zhí)行器79。細(xì)胞/載體分離裝置8的橫截面是“倒L”形狀，與垂直方向呈15°～45°，上部分長寬比在3～5之間，用于病毒上清液的分離；下部分長寬比在5～10之間，用于細(xì)胞/載體的回流和陳舊載體的回收。連接方式為外框體72構(gòu)成細(xì)胞/載體分離裝置8的外殼，沉積板75平行分布在細(xì)胞/載體分離裝置8內(nèi)部，間距在0.5～1.5cm之間，細(xì)胞/載體分離裝置8的中間部位是病毒混合液輸入口70，上端是病毒上清液輸出口73和第三傳感器74，下端是細(xì)胞/載體回流輸出口69、第三取樣口76和陳舊載體輸出口77；陳舊載體輸出口77通過載體輸出閥門78控制的硅橡膠管線與陳舊載體收集裝置12相連；第三控制器及執(zhí)行器79通過數(shù)據(jù)線一端與第三傳感器74連接，另一端與第四自控閥門71、病毒增殖單元7中的第三自控閥門57、細(xì)胞擴(kuò)增單元4中的第二自控閥門35和氣體供應(yīng)單元1中的第一自控閥門17連接，在線自動(dòng)控制第一自控閥門17、第二自控閥門35、第三自控閥門57、病毒混合液輸入口70、細(xì)胞/載體回流輸出口69和病毒上清液輸出口73。
如圖6所示，病毒收集裝置9包括液體分配器入口80、液體分配器81、液體分配器出口82、液位自控開關(guān)閥門83，病毒液輸入口84、液位傳感器85、病毒液輸出口86、滅活劑輸入口87、第四0.2μm濾膜88、第四出氣口89、病毒罐90和第四控制器及執(zhí)行器91。連接方式為液體分配器81的一端通過液體分配器入口80與細(xì)胞/載體分離裝置8中的病毒上清液輸出口73相連，另一端液體分配器出口82通過液位自控開關(guān)閥門83與病毒罐90上的病毒液輸入口84相連；病毒罐90與病毒液輸入口84、液位傳感器85、病毒液輸出口86、滅活劑輸入口87和第四出氣口89相連；第四出氣口89與第四0.2μm濾膜88相連；第四控制器及執(zhí)行器91通過數(shù)據(jù)線一端與液位傳感器85連接，另一端與液位自控開關(guān)閥門83連接，在線自動(dòng)控制病毒液的收集、每一罐收集滿后、用滅活劑封閉滅活病毒。
本系統(tǒng)固定安裝好后，開啟蒸汽發(fā)生器2，使蒸汽充分進(jìn)入細(xì)胞擴(kuò)增單元4、細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置3、初級(jí)灌注收集裝置5、病毒增殖單元7、基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置6、細(xì)胞/載體分離裝置8、病毒收集裝置9、酸/堿液供應(yīng)裝置11和陳舊載體收集裝置12，對整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌。滅菌后，關(guān)閉蒸汽發(fā)生器2，開啟氣體供應(yīng)單元1的空氣壓縮機(jī)15，將系統(tǒng)中殘留的蒸汽和水分吹干。然后，打開熱源供應(yīng)裝置10，使熱源在第一夾套28和第二夾套50循環(huán)流動(dòng)，確保細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體29和病毒增殖反應(yīng)器罐體51的溫度。將滅過菌的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、酸/堿分別注入細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置3、基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置6和酸/堿液供應(yīng)裝置11，然后將細(xì)胞生長培養(yǎng)基泵入細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體29。氣體供應(yīng)單元1供應(yīng)的氣體依次經(jīng)三通17、第一自控閥門18、氣體流量計(jì)19、氣體混合裝置20、氣體增濕裝置21和第一0.2μm濾膜25過濾滅菌后進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體29，為細(xì)胞擴(kuò)增過程提供適宜供氣組成和流量。調(diào)節(jié)第一攪拌裝置45和使氣體和細(xì)胞生長培養(yǎng)基均勻混合。然后，從細(xì)胞接種口32接種細(xì)胞，初級(jí)灌注培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增至適當(dāng)密度后停止初級(jí)灌注培養(yǎng)，由細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置3提供流加細(xì)胞生長培養(yǎng)基(若微載體懸浮培養(yǎng)時(shí)，還要向培養(yǎng)基中加入微載體并混合流加)，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞混合液流入病毒增殖反應(yīng)器罐體51，同時(shí)通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置6流加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，二者按一定比例混合共同組成病毒增殖培養(yǎng)基，從病毒接種口59接種病毒，再按照與細(xì)胞擴(kuò)增過程相同的步驟開啟氣體供應(yīng)單元1和第二攪拌裝置66，進(jìn)行微分式病毒初級(jí)增殖，當(dāng)液體體積達(dá)到病毒增殖反應(yīng)器罐體51的有效體積時(shí)，從病毒增殖單元7中流出的病毒混合液進(jìn)入細(xì)胞/載體分離裝置8，進(jìn)行病毒的連續(xù)增殖過程。通過細(xì)胞/載體分離裝置8的沉降分離，細(xì)胞/載體回流進(jìn)入病毒增殖反應(yīng)器罐體51，病毒上清液進(jìn)入病毒收集裝置9進(jìn)行收集，封閉滅活，實(shí)現(xiàn)連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒和滅活，而且可依據(jù)系統(tǒng)運(yùn)行情況間歇收集陳舊載體至陳舊載體收集裝置12，可減少陳舊載體對病毒增殖的影響，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集裝置9一同收集、封閉滅活。
在系統(tǒng)運(yùn)行過程中，感應(yīng)器包括測溫元件、pH電極、溶氧電極和營養(yǎng)物質(zhì)測量電極、細(xì)胞密度測量電極和液位傳感器與控制器及執(zhí)行器連接，在線自動(dòng)監(jiān)測控制，調(diào)節(jié)熱源、酸/堿、培養(yǎng)基的流量與供氣組成和流量，維持系統(tǒng)穩(wěn)定和細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活過程的順利進(jìn)行。同時(shí)，也可以通過取樣口進(jìn)行取樣分析。
權(quán)利要求
1.一種安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，包括氣體供應(yīng)單元(1)、蒸汽發(fā)生器(2)、細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置(3)、細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)、初級(jí)灌注收集裝置(5)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置(6)、病毒增殖單元(7)、細(xì)胞/載體分離裝置(8)、病毒收集裝置(9)、熱源供應(yīng)裝置(10)、酸/堿液供應(yīng)裝置(11)、陳舊載體收集裝置(12)，其特征在于，氣體供應(yīng)單元(1)分兩路，出口端的一路與細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)的進(jìn)口端連接，另一路與病毒增殖單元(7)的進(jìn)口端連接，蒸汽發(fā)生器(2)的出口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)的進(jìn)口端連接，細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置(3)的出口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)的進(jìn)口端連接，初級(jí)灌注收集裝置(5)的入口端與細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)的出口端連接，熱源供應(yīng)裝置(10)分別與細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)和病毒增殖單元(7)連接，酸/堿液供應(yīng)裝置(11)的出口端分別與細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)和病毒增殖單元(7)的進(jìn)口端連接，細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)的出口端與病毒增殖單元(7)的進(jìn)口端連接，基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置(6)的出口端與病毒增殖單元(7)的進(jìn)口端連接，細(xì)胞/載體分離裝置(8)的進(jìn)口端與病毒增殖單元(7)的出口端相連接，三個(gè)出口端分別與病毒增殖單元(7)、病毒收集裝置(9)和陳舊載體收集裝置(12)的進(jìn)口端連接，陳舊載體收集裝置(12)的出口端和病毒收集裝置(9)的進(jìn)口端連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，氣體供應(yīng)單元(1)包括氣體鋼瓶(13)、粗過濾器(14)、空氣壓縮機(jī)(15)、三通(16)、第一自控閥門(17)、氣體流量計(jì)(18)、氣體混合裝置(19)和氣體增濕裝置(20)，其中，氣體混合裝置(19)頂部一側(cè)是四個(gè)氣體入口(21)，另一側(cè)是一個(gè)混合氣體出口(22)；體增濕裝置(20)頂部整合有第一進(jìn)氣口(23)和第一出氣口(24)，第一進(jìn)氣接口(23)深入容器內(nèi)近底部處；粗過濾器(14)與空氣壓縮機(jī)(15)的入口相連，氣體鋼瓶(13)、空氣壓縮機(jī)(15)通過銅輸氣管道順次連接第一自控閥門(17)、氣體流量計(jì)(18)、氣體混合裝置(19)和氣體增濕裝置(20)的第一進(jìn)氣口(23)、第一出氣口(24)與第一0.2μm濾膜(25)相接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，氣體鋼瓶(13)有三個(gè)，即N2氣體鋼瓶、CO2氣體鋼瓶、O2氣體鋼瓶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，氣體混合裝置(19)呈橢圓柱形，其橢圓頂部一側(cè)是四個(gè)氣體入口(21)；體增濕裝置(20)主體為圓柱型半球頂玻璃容器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)包括第一熱源輸入口(26)、第一熱源輸出口(27)、第一夾套(28)、細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體(29)、第二進(jìn)氣口(30)、蒸汽輸入口(31)、細(xì)胞接種口(32)、細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口(33)、第一酸/堿輸入口(34)、第二自控閥門(35)、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置(36)、第一傳感器(37)、初級(jí)灌注輸出口(38)、第一取樣口(39)、細(xì)胞混合液輸出口(40)、第二出氣口(41)、第二0.2μm濾膜(42)、第一蓋板(43)、細(xì)胞截流裝置(44)、第一攪拌裝置(45)、第一氣體分布器(46)和第一控制器及執(zhí)行器(47)，其中，細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)的主體由細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體(29)和覆蓋其上的第一蓋板(43)組成，細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器罐體(29)的周圍是第一夾套(28)，上面設(shè)有的第一熱源輸入口(26)和第一熱源輸出口(27)；第一蓋板(43)上連有很多出入口，入口包括第二進(jìn)氣口(30)、蒸汽輸入口(31)、細(xì)胞接種口(32)、細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口(33)和第一酸/堿輸入口(34)，出口包括第一傳感器(37)、初級(jí)灌注輸出口(38)、第一取樣口(39)、細(xì)胞混合液輸出口(40)和第二出氣口(41)；蒸汽輸入口(31)與蒸汽發(fā)生器(2)相連；初級(jí)灌注輸出口(39)通過不銹鋼管與細(xì)胞截流裝置(44)連接；第二進(jìn)氣口(30)通過硅橡膠管與第一氣體分布器(46)相連；第二出氣口(41)與第二0.2μm濾膜(42)相連；第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置(36)位于第一蓋板(43)的上面，與第一攪拌裝置(45)相連；第一控制器及執(zhí)行器(47)通過數(shù)據(jù)線一端與第一傳感器(37)連接，另一端與第二自控閥門(35)、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置(36)和氣體供應(yīng)單元(1)中的第一自控閥門(17)連接，在線自動(dòng)控制細(xì)胞生長培養(yǎng)基輸入口(33)、第一酸/堿輸入口(34)、第一電動(dòng)機(jī)和變速裝置(36)、細(xì)胞混合液輸出口(40)和氣體供應(yīng)單元(1)中的第一自控閥門(17)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，病毒增殖單元(7)包括第二熱源輸入口 (48)、第二熱源輸出口 (49)、第二夾套(50)、病毒增殖反應(yīng)器罐體(51)、第三進(jìn)氣口(52)、細(xì)胞混合液輸入口(53)、細(xì)胞/載體回流輸入口(54)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口(55)、第二酸/堿輸入口(56)、第三自控閥門(57)、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置(58)、病毒接種口(59)、第二傳感器(60)、第二取樣口(61)、 病毒混合液輸出口(62)、第三出氣口(63)、第三0.2μm濾膜(64)、第二蓋板(65)、第二攪拌裝置(66)、第二氣體分布器(67)、第二控制器及執(zhí)行器(68)，其中，病毒增殖單元(7)的主體由病毒增殖反應(yīng)器罐體(51)和覆蓋其上的第二蓋板(65)組成，病毒增殖反應(yīng)器罐體(51)的周圍是第二夾套(50)，上面設(shè)有的第二熱源輸入口(48)和第二熱源輸出口(49)；第二蓋板(65)上連有很多出入口，入口包括第三進(jìn)氣口(52)、細(xì)胞混合液輸入口(53)、細(xì)胞/載體回流輸入口(54)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口(55)、第二酸/堿輸入口(56)和病毒接種口(59)，出口包括第二傳感器(60)、第二取樣口(61)、 病毒混合液輸出口(62)和第三出氣口(63)；第三進(jìn)氣口(52)通過硅橡膠管與第二氣體分布器(67)相連；第三出氣口(63)和第三0.2μm濾膜(64)相連；第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置(58)位于第二蓋板(65)的上面，與第二攪拌裝置(66)相連；第二控制器及執(zhí)行器(68)一端與第二傳感器(60)連接，另一端與第三自控閥門(57)、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置(58)、細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)中的第二自控閥門(35)和氣體供應(yīng)單元(1)中的第一自控閥門(17)連接，在線自動(dòng)控制第一自控閥門(17)、第二自控閥門(35)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基輸入口(55)、第二酸/堿輸入口(56)、第二電動(dòng)機(jī)和變速裝置(58)、細(xì)胞/載體回流輸入口(54)和病毒混合液輸出口(62)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，細(xì)胞/載體分離裝置(8)包括細(xì)胞/載體回流輸出口(69)、病毒混合液輸入口(70)、第四自控閥門(71)、外框體(72)、病毒上清液輸出口(73)、第三傳感器(74)、沉積板(75)、第三取樣口(76)、陳舊載體輸出口(77)、載體輸出閥門(78)、第三控制器及執(zhí)行器(79)，其中，外框體(72)構(gòu)成細(xì)胞/載體分離裝置(8)的外殼，沉積板(75)設(shè)在細(xì)胞/載體分離裝置(8)內(nèi)部，細(xì)胞/載體分離裝置(8)的中間部位是病毒混合液輸入口(70)，上端是病毒上清液輸出口(73)和第三傳感器(74)，下端是細(xì)胞/載體回流輸出口(69)、第三取樣口(76)和陳舊載體輸出口(77)；陳舊載體輸出口(77)通過載體輸出閥門(78)控制的硅橡膠管線與陳舊載體收集裝置(12)相連；第三控制器及執(zhí)行器(79)一端與第三傳感器(74)連接，另一端與第四自控閥門(71)、病毒增殖單元(7)中的第三自控閥門(57)、細(xì)胞擴(kuò)增單元(4)中的第二自控閥門(35)和氣體供應(yīng)單元(1)中的第一自控閥門(17)連接，在線自動(dòng)控制第一自控閥門(17)、第二自控閥門(35)、第三自控閥門(57)、病毒混合液輸入口(70)、細(xì)胞/載體回流輸出口(69)和病毒上清液輸出口(73)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或者7所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，細(xì)胞/載體分離裝置(8)橫截面是倒L形狀，與垂直方向呈15°～45°，上部分長寬比在3～5之間，下部分長寬比在5～10之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，沉積板(75)平行分布在細(xì)胞/載體分離裝置(8)內(nèi)部，間距在0.5～1.5cm之間，硅滲處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)，其特征是，病毒收集裝置(9)包括液體分配器入口(80)、液體分配器(81)、液體分配器出口(82)、液位自控開關(guān)閥門(83)、病毒液輸入口(84)、液位傳感器(85)、病毒液輸出口(86)、滅活劑輸入口(87)、第四0.2μm濾膜(88)、第四出氣口(89)、病毒罐(90)和第四控制器及執(zhí)行器(91)，其中，液體分配器(81)的一端通過液體分配器入口(80)與細(xì)胞/載體分離裝置(8)中的病毒上清液輸出口(73)相連，另一端液體分配器出口(82)通過液位自控開關(guān)閥門(83)與病毒罐(90)上的病毒液輸入口(84)相連，病毒罐(90)與病毒液輸入口(84)、液位傳感器(85)、病毒液輸出口(86)、滅活劑輸入口(87)和第四出氣口(89)相連，第四出氣口(89)與第四0.2μm濾膜(88)相連，第四控制器及執(zhí)行器(91)一端與液位傳感器(85)連接，另一端與液位自控開關(guān)閥門(83)連接。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的安全高效連續(xù)封閉式細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)/滅活系統(tǒng)。本發(fā)明中，細(xì)胞擴(kuò)增單元分別與氣體供應(yīng)單元、蒸汽發(fā)生器、細(xì)胞生長培養(yǎng)基供應(yīng)裝置、初級(jí)灌注收集裝置、熱源供應(yīng)裝置和酸/堿液供應(yīng)裝置相接；病毒增殖單元分別與氣體供應(yīng)單元、基礎(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)裝置、細(xì)胞/載體分離裝置、熱源供應(yīng)裝置和酸/堿液供應(yīng)裝置相接；細(xì)胞/載體分離裝置分別與病毒增殖單元、病毒收集裝置和陳舊載體收集裝置相接；陳舊載體收集裝置和病毒收集裝置相接。本系統(tǒng)將細(xì)胞擴(kuò)增和病毒增殖兩個(gè)過程關(guān)聯(lián)起來，在連續(xù)封閉下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)/滅活病毒，便于自動(dòng)化控制，標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，并降低了污染機(jī)會(huì)和提高了生產(chǎn)安全系數(shù)。
文檔編號(hào)C12M3/00GK1840651SQ20061002323
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月12日
發(fā)明者羅鳳山, 齊瀚實(shí), 陳彥田, 耿濤, 孫海英 申請人:上海交通大學(xué)