豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)，形成單層細(xì)胞；生產(chǎn)用種毒的繁殖，將基礎(chǔ)種毒接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)；單層細(xì)胞消化成細(xì)胞懸浮液接種于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)；制苗毒液的繁殖，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到5×106個(gè)單位/ml～5×107個(gè)單位/ml后，將生產(chǎn)用種毒接種于細(xì)胞培養(yǎng)；病毒液的收獲。本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，每個(gè)生產(chǎn)周期僅需5-7天，并且相比現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法所生產(chǎn)的豬傳染性胃腸炎病毒效價(jià)更高；具有自動(dòng)化程度高，用人少，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，同時(shí)易操作、產(chǎn)量大占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，并且質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定；環(huán)境污染少且易于處理。
【專利說明】豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的方法，可用于工業(yè)化生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒疫苗，替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，國(guó)內(nèi)豬傳染性胃腸炎病毒疫苗生產(chǎn)都是依靠轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)。該傳統(tǒng)工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，生產(chǎn)成本高；細(xì)胞環(huán)境不均一，環(huán)境條件不易測(cè)量與監(jiān)控，容易被環(huán)境污染；細(xì)胞不同批次間的差異大；難以擴(kuò)大生產(chǎn)；細(xì)胞自身被細(xì)菌或其它病毒污染而致生產(chǎn)的疫苗或有質(zhì)量隱患。另外，目前已經(jīng)有利用生物反應(yīng)器微載體生產(chǎn)狂犬病疫苗的報(bào)道，若能利用生物反應(yīng)器微載體生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒疫苗可以廣泛的應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法技術(shù)存在的不足之處，提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的方法。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
[0005]一種豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一:生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):取生長(zhǎng)良好的PK15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層PK15或ST細(xì)胞；
[0007]步驟二:生產(chǎn)用種毒的繁殖:在PK15細(xì)胞或ST細(xì)胞形成單層后，倒掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，將豬傳染性胃腸炎病毒接種到`步驟一的單層細(xì)胞上，豬傳染性胃腸炎病毒的接種量與步驟一中細(xì)胞生長(zhǎng)液的體積比為1:10，將細(xì)胞瓶迅速翻轉(zhuǎn)使傳染性胃腸炎病毒充分浸沒單層細(xì)胞，置于37°c、體積百分含量為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附lh，然后加入細(xì)胞維持液，置于37°C、體積百分含量為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，當(dāng)75%~80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒置于-15°C冰箱中，反復(fù)凍融細(xì)胞三次，此病毒液作為生產(chǎn)用種毒；
[0008]步驟三:PK15或ST細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):向無菌檢驗(yàn)合格的、含有微載體的生物反應(yīng)器中加入總培養(yǎng)體積的2/3體積的細(xì)胞生長(zhǎng)液，取步驟一中已形成良好單層ΡΚ15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0009]步驟四:制苗毒液的繁殖:觀察微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml~5 X IO7個(gè)細(xì)胞/ml后進(jìn)行接毒操作，所接入種毒為步驟二中的生產(chǎn)用種毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液洗滌生產(chǎn)用種毒2-4次；
[0010]步驟五:病毒液的收獲:待微載體上細(xì)胞全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，將反應(yīng)器內(nèi)液體連同微載體一起收獲，置于_20°C反復(fù)凍融兩次，然后經(jīng)離心或過濾去除微載體及細(xì)胞碎片，即制得病毒液。[0011]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為3L-3000L。
[0012]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述微載體為Cytodexl、Cytodex2> Cytodex3 中的一種。
[0013]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述微載體在使用前需清洗、滅菌，步驟如下:A、用PBS浸泡微載體過夜；B、用PBS清洗微載體3遍；C、用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘，微載體經(jīng)PBS清洗、高壓滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應(yīng)器中，在反應(yīng)器中用DMEM清洗微載體。 [0014]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述EDTA-胰酶細(xì)胞分散液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25%的規(guī)格1:250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液，所述的規(guī)格1:250的胰酶為每克胰酶中含有250個(gè)活力單位的胰蛋白酶。
[0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為:重量分?jǐn)?shù)為90%-98%DMEM液、2%-10%牛血清，終濃度為200-1000單位/ml的抗菌素，pH為
6.8~7.6o
[0016]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述步驟四中的病毒培養(yǎng)液的配方為:重量分?jǐn)?shù)分別是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，終濃度為200-1000單位/ml的抗菌素，pH 為 6.8-7.6。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。
[0018]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述步驟四中的生產(chǎn)用種毒接種量為0.01-0.5M0I，所述的MOI為病毒感染復(fù)數(shù)。
[0019]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述的生物反應(yīng)器設(shè)定的參數(shù)為培養(yǎng)溫度 37°C、pH6.8-7.6、溶氧 30%_60%、攪拌速度 30_60rpm。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0021](I)本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，不會(huì)受制于原料供應(yīng)，而且生產(chǎn)周期短，每個(gè)生產(chǎn)周期僅需5-7天，并且相比現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法所生產(chǎn)的豬傳染性胃腸炎病毒效價(jià)更高，可達(dá)到轉(zhuǎn)瓶法的10倍以上。。
[0022]( 2 )應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有自動(dòng)化程度高，用人少，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，同時(shí)易操作、產(chǎn)量大占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，并且質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定，解決了細(xì)胞不同批次間的差異大的問題。
[0023](3)應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗，環(huán)境污染少且易于處理，解決了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法在操作過程中容易產(chǎn)生污染，且處理難度大，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋和說明。
[0026]實(shí)施例1:[0027]豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0028]步驟1:生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):取生長(zhǎng)良好的PK15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液(EDTA-胰酶細(xì)胞分散液為含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.25%的規(guī)格1:250胰酶、0.02%EDTA的Hank’s液；其中規(guī)格1:250胰酶為每克胰酶中含有250個(gè)活力單位的胰蛋白酶)消化傳代，以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%DMEM液、10%牛血清、青霉素鈉和硫酸鏈霉素各200單位/ml，pH調(diào)整為7.4的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層PK15或ST細(xì)胞，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。
[0029]步驟2:生產(chǎn)用種毒的繁殖:在PK15細(xì)胞或ST細(xì)胞形成單層后，倒掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，將豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)接種到步驟I的單層細(xì)胞上，豬傳染性胃腸炎病毒的接種量與步驟I中細(xì)胞生長(zhǎng)液的體積比為1:10，將細(xì)胞瓶迅速翻轉(zhuǎn)使豬傳染性胃腸炎病毒充分浸沒單層細(xì)胞，置于37°C、體積百分含量5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附lh，然后加入細(xì)胞維持液(細(xì)胞維持液為含有10 μ g/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液，即細(xì)胞維持液為重量分?jǐn)?shù)90%DMEM液、10%牛血清，10 μ g/ml胰酶，青霉素鈉和硫酸鏈霉素各200單位/ml, PH為7.4)，置37。。、體積百分含量5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，當(dāng)75%~80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒置于-15°C的冰箱中，反復(fù)凍融細(xì)胞三次，使病毒從細(xì)胞中充分釋放出來，然后分裝液體，置_70°C或液氮保存?zhèn)溆?此病毒液作為生產(chǎn)用種毒。
[0030]步驟3:PK15或ST細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):向無菌檢驗(yàn)合格的、含有微載體的生物反應(yīng)器中加入總培養(yǎng)體積的2/3體積的細(xì)胞生長(zhǎng)液，取步驟I中已形成良好單層ΡΚ15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種于生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器設(shè)定培養(yǎng)溫度37°C、PH7.4、溶氧量50%、攪拌速度60rpm，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)，其中生物反應(yīng)器容積為75L ;微載體為Cytodex系列微載體，Cytodex系列微載體包括Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3。微載體在使用前,需清洗、滅菌,具體步驟為:I)稱量Cytodex微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘；微載體加入反應(yīng)器中，用DMEM清洗微載體。
[0031]步驟4:制苗毒液的繁殖:培養(yǎng)后第三日觀察微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO7個(gè)細(xì)胞/ml后進(jìn)行接毒操作,所接入種毒為步驟2中的生產(chǎn)用種毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液洗漆生產(chǎn)用種毒4次,病毒培養(yǎng)液配方為:重量分?jǐn)?shù)為90%DMEM液、10%牛血清,青霉素鈉和硫酸鏈霉素各200單位/ml, PH為7.4 ;接種量為0.1MOI ;生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為培養(yǎng)溫度37°C、PH7.4、溶氧50%、攪拌速度60rpm，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)，接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。
[0032]步驟5:病毒液的收獲:待微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，將反應(yīng)器內(nèi)液體連同微載體一起收獲，置_20°C反復(fù)凍融兩次，然后經(jīng)離心或過濾去除微載體及細(xì)胞碎片，即制得病毒液。
[0033]病毒液于-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0034]實(shí)施例2:
[0035]豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0036]步驟1:生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):取生長(zhǎng)良好的PK15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液(EDTA-胰酶細(xì)胞分散液為含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.25%的規(guī)格1:250胰酶、0.02%EDTA的Hank’s液；其中規(guī)格1:250胰酶為每克胰酶中含有250個(gè)活力單位的胰蛋白酶)消化傳代，以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%DMEM液、2%牛血清、青霉素鈉和硫酸鏈霉素各200單位/ml，pH調(diào)整為7.4的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層PK15或ST細(xì)胞，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。
[0037]步驟2:生產(chǎn)用種毒的繁殖:在PK15細(xì)胞或ST細(xì)胞形成單層后，倒掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，將豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)接種到步驟I的單層細(xì)胞上，豬傳染性胃腸炎病毒的接種量與步驟I中細(xì)胞生長(zhǎng)液的體積比為1:10，將細(xì)胞瓶迅速翻轉(zhuǎn)使豬傳染性胃腸炎病毒充分浸沒單層細(xì)胞，置于37°C、體積百分含量5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附lh，然后加入細(xì)胞維持液(細(xì)胞維持液為含有10 μ g/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液，即細(xì)胞維持液為重量分?jǐn)?shù)95%DMEM液、5%牛血清，10 μ g/ml胰酶，青霉素鈉和硫酸鏈霉素各200單位/ml，PH為7.0)，置37°C、體積百分含量5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，當(dāng)75%~80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒置于-15°C的冰箱中，反復(fù)凍融細(xì)胞三次，使病毒從細(xì)胞中充分釋放出來，然后分裝液體，置_70°C或液氮保存?zhèn)溆?此病毒液作為生產(chǎn)用種毒。[0038]步驟3:PK15或ST細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):向無菌檢驗(yàn)合格的、含有微載體的生物反應(yīng)器中加入總培養(yǎng)體積的2/3體積的細(xì)胞生長(zhǎng)液，取步驟I中已形成良好單層ΡΚ15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種于生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器設(shè)定培養(yǎng)溫度37°C、PH7.0、溶氧量50%、攪拌速度60rpm，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)，其中生物反應(yīng)器容積為75L ;微載體為Cytodex系列微載體，Cytodex系列微載體包括Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3。微載體在使用前,需清洗、滅菌,具體步驟為:I)稱量Cytodex微載體500g、使用20LPBS液浸泡過夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘；微載體加入反應(yīng)器中，用DMEM清洗微載體。
[0039]步驟4:制苗毒液的繁殖:培養(yǎng)后第三日觀察微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO7個(gè)細(xì)胞/ml后進(jìn)行接毒操作,所接入種毒為步驟2中的生產(chǎn)用種毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液洗漆生產(chǎn)用種毒4次,病毒培養(yǎng)液配方為:重量分?jǐn)?shù)為95%DMEM液、5%牛血清,青霉素鈉和硫酸鏈霉素各200單位/ml, PH為7.4 ;接種量為0.5M0I ;生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為培養(yǎng)溫度37 °C、PH7.4、溶氧50%、攪拌速度60rpm，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)，接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。
[0040]步驟5:病毒液的收獲:待微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，將反應(yīng)器內(nèi)液體連同微載體一起收獲，置_20°C反復(fù)凍融兩次，然后經(jīng)離心或過濾去除微載體及細(xì)胞碎片，即制得病毒液。
[0041]病毒液于_20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0042]半成品檢驗(yàn)及制苗、成品檢驗(yàn):
[0043]1、病毒液毒價(jià)的測(cè)定:將以上收獲的細(xì)胞病毒液混合后取樣，測(cè)定毒價(jià)。結(jié)果表明病毒含量≥ IO8TCID50A).lrnl。
[0044]2、滅活、半成品檢驗(yàn)
[0045]無菌檢驗(yàn):按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)附錄42頁進(jìn)行，無菌生長(zhǎng)。[0046]滅活檢驗(yàn):滅活后，無菌從每瓶病毒滅活液中取樣，接種PK15細(xì)胞或ST細(xì)胞，盲傳三代，細(xì)胞仍無CPE產(chǎn)生。
[0047]3、油佐劑滅活疫苗的配制
[0048]油相制備:油相由下述重量份的組分組成:注射用白油《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)附錄51頁96份、司本-804份和硬脂酸鋁2份。取硬脂酸鋁，用少量注射用白油混合，加熱融化至半透明狀，再與全量司本-80及剩余注射用白油混合均勻，經(jīng)121°C滅菌15分鐘，冷卻至室溫，備用。
[0049]水相制備:取經(jīng)檢驗(yàn)合格的豬傳染性胃腸炎病毒滅活液，按病毒液的4%加入吐溫-80乳化I分鐘。
[0050]滅活疫苗的制備:按水相和油相為1:3 (體積比)比例進(jìn)行乳化，10000r/min乳化3~5分鐘。
[0051]4、成品檢驗(yàn)
[0052]4.1 性狀:
[0053]外觀:白色乳狀液。
[0054]劑型:呈油包水型。
[0055]穩(wěn)定性:在37°C保存21日或以3000r/min離心15分鐘，未破乳。
[0056]粘度:用Iml潔凈吸管(上口內(nèi)徑2.7mm、下口內(nèi)徑1.2mm)，吸取25°C左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時(shí)間，在8秒以內(nèi)。
[0057]4.2無菌檢驗(yàn):按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)附錄42頁進(jìn)行，無菌生長(zhǎng)。
[0058]4.3安全檢驗(yàn):用豬傳染性胃腸炎抗體陰性母豬產(chǎn)3日齡哺乳仔豬10頭，于后海穴注射疫苗，其中2頭，各注射2頭份；其余8頭，各注射I頭份，觀察14日，均應(yīng)無異常臨床反應(yīng)。
[0059]4.4效力檢驗(yàn):符合下列標(biāo)準(zhǔn)之一者判為合格
[0060]( I)檢驗(yàn)血清中和抗體用豬傳染性胃腸炎抗體陰性母豬產(chǎn)3日齡哺乳仔豬8頭，于后海穴注射疫苗I頭份,于免疫后14日采血，用中和試驗(yàn)法檢驗(yàn)血清中和抗體。8頭仔豬應(yīng)至少7頭仔豬陽轉(zhuǎn)，豬傳染性胃腸炎中和抗體效價(jià)GMT均應(yīng)≥32。
[0061](2)免疫攻毒上述8頭免疫仔豬，于免疫后14日，連同條件相同的對(duì)照仔豬8頭，各均分為2組，以10_4稀釋的豬傳染性胃腸炎強(qiáng)毒分別口服攻毒，觀察7日。對(duì)照組全部發(fā)病，免疫組至少保護(hù)3頭；或?qū)φ战M3頭發(fā)病，免疫組全部保護(hù)為合格。
[0062]4.5甲醛含量測(cè)定:分別按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010版)附錄40頁進(jìn)行。符合規(guī)定。
[0063]盡管這里參照本發(fā)明的解釋性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，上述實(shí)施例僅為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出很多其他的修改和實(shí)施方式，這些修改和實(shí)施方式將落在本申請(qǐng)公開的原則范圍和精神之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟: 步驟一:生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):取生長(zhǎng)良好的PK15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層PK15或ST細(xì)胞； 步驟二:生產(chǎn)用種毒的繁殖:在PK15細(xì)胞或ST細(xì)胞形成單層后，倒掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，將豬傳染性胃腸炎病毒接種到步驟一的單層細(xì)胞上，豬傳染性胃腸炎病毒的接種量與步驟一中細(xì)胞生長(zhǎng)液的體積比為1:10，將細(xì)胞瓶迅速翻轉(zhuǎn)使傳染性胃腸炎病毒充分浸沒單層細(xì)胞，置于37°C、體積百分含量為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附lh，然后加入細(xì)胞維持液，置于37°C、體積百分含量為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，當(dāng)75%~80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒置于-15°C冰箱中，反復(fù)凍融細(xì)胞三次，此病毒液作為生產(chǎn)用種毒； 步驟三:PK15或ST細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):向無菌檢驗(yàn)合格的、含有微載體的生物反應(yīng)器中加入總培養(yǎng)體積的2/3體積的細(xì)胞生長(zhǎng)液，取步驟一中已形成良好單層ΡΚ15或ST細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟四:制苗毒液的繁殖:觀察微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml~5X IO7個(gè)細(xì)胞/ml后進(jìn)行接毒操作，所接入種毒為步驟二中的生產(chǎn)用種毒，接毒前用含有10 μ g/ml胰酶的病毒培養(yǎng)液洗滌生產(chǎn)用種毒2-4次； 步驟五:病毒液的收獲:待微載體上細(xì)胞全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，將反應(yīng)器內(nèi)液體連同微載體一起收獲，置于_20°C反復(fù)凍融兩次，然后經(jīng)離心或過濾去除微載體及細(xì)胞碎片，即制得病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為3L-3000L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述微載體為 Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3 中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述微載體在使用前需清洗、滅菌，步驟如下:A、用PBS浸泡微載體過夜；B、用PBS清洗微載體3遍；C、用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘，微載體經(jīng)PBS清洗、高壓滅菌處理后，加入到已滅菌的生物反應(yīng)器中，在反應(yīng)器中用DMEM清洗微載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述EDTA-胰酶細(xì)胞分散液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25%的規(guī)格1:250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液，所述的規(guī)格1:250的胰酶為每克胰酶中含有250個(gè)活力單位的胰蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為:重量分?jǐn)?shù)為90%-98%DMEM液、2%_10%牛血清，終濃度為200-1000單位/ml的抗菌素，pH為6.8-7.6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟四中的病毒培養(yǎng)液的配方為:重量分?jǐn)?shù)分別是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，終濃度為200-1000 單位 /ml 的抗菌素，pH 為 6.8-7.6。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述抗菌素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟四中的生產(chǎn)用種毒接種量為0.01-0.5MOI。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的生物反應(yīng)器設(shè)定的參數(shù)為培 養(yǎng)溫度37°C、pH6.8-7.6、溶氧30%_60%、攪拌速度30_60rpm。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103550771SQ201310529342
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】徐宏軍, 胡來根, 楊鵬程, 任麗, 王家福 申請(qǐng)人:成都天邦生物制品有限公司