竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)提取竹節(jié)參總皂苷、竹節(jié)參總皂苷的急性毒性實(shí)驗(yàn)、建立小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型、觀察竹節(jié)參總皂苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用等一系列試驗(yàn)，探討竹節(jié)參總皂苷對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的防治作用及作用機(jī)制，首次揭示竹節(jié)參總皂苷對(duì)NF?κB和PPAR?γ信號(hào)通路的影響。竹節(jié)參總皂苷在治療潰瘍性結(jié)腸炎上具有標(biāo)本兼治、安全有效的功效。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體是竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病，以慢性、 反復(fù)發(fā)作，病因不明為其特征。該病發(fā)病率和患病率在我國(guó)有明顯增加趨勢(shì)。潰瘍性結(jié)腸炎 病因尚未完全闡明，主要是侵及結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，以連續(xù)方式逐漸進(jìn)展。 UC臨床表現(xiàn)為糞便糊狀松軟，常混有膿血，下腹部疼痛，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生血水樣腹瀉或血便。UC 的病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，可能與免疫異常、腸道菌群失調(diào)、遺傳及精神狀態(tài)等多種因素 有關(guān)。目前認(rèn)為結(jié)腸黏膜免疫功能失調(diào)，促炎性細(xì)胞因子分泌增多，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng) 是其主要的發(fā)病機(jī)制。由于本病病程漫長(zhǎng)，其病情輕重不一，常易反復(fù)發(fā)作。常用的治療藥 物有氨基水楊酸類(lèi)藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和一些中藥，但至今尚無(wú)理想的藥物，開(kāi) 發(fā)標(biāo)本兼治、安全有效的藥物，尤其是民族藥物有著重要的實(shí)際價(jià)值。
[0003] 潰瘍性結(jié)腸炎可分屬于不同的中醫(yī)病名，鑒于其發(fā)病特點(diǎn)，多歸屬于"久痢""泄 瀉"范疇。在治療上主要有健脾益氣、清熱解毒、化瘀通絡(luò)法辨證治療潰瘍性結(jié)腸炎。在《湘 西土家族醫(yī)藥調(diào)查與臨床研究》記載白三七(竹節(jié)參）具有益氣補(bǔ)虛，健脾和胃，澀腸止痢， 活血通經(jīng)，民間單方用于胃氣痛、肚子痛、跌打損傷、久病體虛、頭暈眼花、肚痛腹瀉，也是土 家多種復(fù)方的常用藥，為土家藥四寶之一。竹節(jié)參健脾和胃，澀腸止瀉的功效是否是治療潰 瘍性結(jié)腸炎的藥理學(xué)基礎(chǔ)，目前尚未有人研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供標(biāo)本兼治、安全有效的竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸 炎藥物中的應(yīng)用，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
[0007] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：竹節(jié)參總皂苷對(duì)小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎的有效劑量為 150mg/kg，小鼠對(duì)竹節(jié)參總阜苷的最大耐受量為4500mg/kg。
[0008] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:竹節(jié)參總皂苷的制備過(guò)程，包括以下步驟：
[0009] (1)取竹節(jié)參藥材根部，粉碎至30-40目；分3次加入提取罐中回流提取3次，依次加 入10倍量、8倍量、5倍量質(zhì)量濃度為80 %乙醇回流提取，溫度為80°C，提取時(shí)間分別為2小 時(shí)、1.5小時(shí)、1小時(shí);合并提取液，并過(guò)濾然后濃縮至無(wú)醇度，制得竹節(jié)參提取液；
[001 0] (2)取大孔樹(shù)脂，乙醇浸泡過(guò)夜，加入玻璃層析柱中，依次用乙醇、水、質(zhì)量濃度為 5%的氫氧化鈉、質(zhì)量濃度為5%鹽酸處理大孔樹(shù)脂，然后用水沖至中性；
[0011] (3)將濃縮好的無(wú)醇度的竹節(jié)參提取液緩慢的加入到含有大孔樹(shù)脂的玻璃層析柱 中，依次用純水洗脫，質(zhì)量濃度為10 %乙醇、30 %乙醇、50 %乙醇、80 %乙醇梯度洗脫；水和 不同濃度乙醇，各洗脫2個(gè)柱體積，將80%乙醇洗脫部濃縮真空干燥制得竹節(jié)參總皂苷。
[0012] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:大孔樹(shù)脂采用DlOl大孔樹(shù)脂。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0014] 本發(fā)明通過(guò)提取竹節(jié)參總皂苷、竹節(jié)參總皂苷的急性毒性實(shí)驗(yàn)、建立小鼠急性潰 瘍性結(jié)腸炎模型、觀察竹節(jié)參總皂苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用等一系列試驗(yàn)，探討竹節(jié) 參總皂苷對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的防治作用及作用機(jī)制，首次揭示竹節(jié) 參總皂苷對(duì)NF-kB和PPAR- γ信號(hào)通路的影響。竹節(jié)參總皂苷在治療潰瘍性結(jié)腸炎上具有標(biāo) 本兼治、安全有效的功效。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是模型組和空白組小鼠體重變化。
[0016]圖2是模型組和空白組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)。
[0017] 圖3是SASP和TSPJ對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響（HEX 100)，（a)正常對(duì)照， (13)模型對(duì)照，（(：）3厶3?25〇11^/1^，（(1)了3?了15〇11^/1^，（6)了3?了30〇11^/1^。
[0018]圖4是TSPJ對(duì)4 % DSS誘導(dǎo)小鼠體重變化的影響。
[0019] 圖5是TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的影響。
[0020] 圖6是TSPJ和SASP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織NF-KB表達(dá)的影響（SPX200)，（a)空白 對(duì)照組，（b)模型對(duì)照，（c)SASP250mg/kg，（d)TSPJ 150mg/kg，（e)TSPJ 300mg/kg。
[0021] 圖7是TSPJ和SASP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織PPAR-γ表達(dá)的影響（SP X 200)，（a)空 白對(duì)照組，（b)模型對(duì)照，（c)SASP250mg/kg，（d)TSPJ 150mg/kg，（e)TSPJ 300mg/kg。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] -、實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立
[0025] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0026] K1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
[0027] 清潔級(jí)昆明小鼠（雄性），體重22-25克，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0028] 1.2主要試劑和藥品：
[0029] 葡聚糖硫酸鈉鹽（Dextran sulfate sodium salt MW:36000_50000)(美國(guó)MP Biomedicals)
[0030] 大便隱血試劑盒(南京建成生物工程研究所）
[0031] 1.3主要儀器：
[0032] 電子天平
[0033] A2000S型電子分析天平（德國(guó)Sartorius)
[0034] Sigma_3k低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma)
[0035] -80 °C超低溫冰箱(德國(guó)）
[0036] UV-225紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本）
[0037] BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus)
[0038] 1.4溶液的配制：
[0039] 0.5%的羧甲基纖維素鈉。
[0040] 4%DSS水溶液的配制:稱取40gDSS溶解于雙蒸水，并定容到1000ml。
[0041 ] 4%的中性甲醛（10 %中性福爾馬林)溶液的配制：甲醛(40% ) 100mL，無(wú)水磷酸氫 二鈉6 · 5g，磷酸二氫鈉4 · Og，蒸餾水900ml。
[0042] 2 方法
[0043] 2.1小鼠結(jié)腸炎模型建立：
[0044]參照Okayasu介紹的方法，對(duì)DSS的濃度進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整：
[0045] 小鼠隨機(jī)分組，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，第8天自由飲用4%DSS水溶液，連續(xù)7d。在這期間， 每天定時(shí)稱量小鼠體重，進(jìn)行隱血試驗(yàn)和觀察糞便性狀。結(jié)腸組織取樣:第8天，頸椎脫臼處 死小鼠，剪開(kāi)腹腔，清理出結(jié)腸，測(cè)量整個(gè)結(jié)腸長(zhǎng)度，剪下距離肛門(mén)處Icm剪下結(jié)腸2cm(直腸 至升結(jié)腸）。冰冷生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，用清潔濾紙吸干水分。然后將結(jié)腸樣本剪為兩段： 直腸端段（約Icm)置入4°C4%甲醛溶液固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片，切片厚約6μπι，ΗΕ染 色。余下部分編號(hào)，稱重，用鋁箱包好，立即放入液氮(-196Γ)中速凍，轉(zhuǎn)入低溫冰箱(-80 °C)存放。
[0046] 2.2觀察指標(biāo)：
[0047] 2.2.1臨床癥狀觀察評(píng)分/疾病活動(dòng)指數(shù)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。
[0048] 表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0050] 2.2.2形態(tài)學(xué)觀測(cè)
[0051] 光鏡下觀察各組標(biāo)本切片，每組15個(gè)視野（X 100, X 200)進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分，求 其平均值，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。
[0052]表2組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0054] 2.2.3生化指標(biāo)測(cè)定
[0055] 結(jié)腸組織樣品制備:取結(jié)腸組織塊在冰冷生理鹽水中漂洗干凈，干凈濾紙吸干，準(zhǔn) 確稱重后，立即用眼科剪子剪碎，置于冰浴的玻璃勻漿器中，加入0.86%生理鹽水后勻漿， 按重量體積比為1:9加勻漿介質(zhì)制備成10%的組織勻漿。
[0056] 測(cè)定方法：按MPO試劑盒測(cè)定方法，取5 %待測(cè)組織勻漿液0.9ml加3號(hào)試劑0.1 ml， 充分混勻后37 °C水浴15分鐘，取出后待測(cè)。其余步驟按表3操作：
[0057]弄 3
L〇〇59J 混均，37uC水浴30分鉀，冉加入試刑七谷0.05ml，混均，60Γ水浴IOmin，取出后立 即在460nm處，I cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管OD值。
[0060] M蝴立/克組組」則〒氣 丨丨.3X取樣樣星（克）
[0061 ]注:11.3為斜率的倒數(shù);取樣量為取樣中所含組織勻漿的量(克）。
[0062] 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0063]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組資料用（（X土s)表示，采用單因素方差分 析和非參數(shù)WiIcox on秩和檢驗(yàn)，比較各組資料間的差異，P<0.05為差異有顯著性。
[0064] 4 結(jié)果
[0065] 4.1小鼠體重變化
[0066] 模型組小鼠飲用4 %DSS水溶液后從第3天開(kāi)始，體重開(kāi)始下降，而空白組小鼠體重 呈自然上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖1:模型組和空白組小鼠體重變化。
[0067] 4.2模型組小鼠結(jié)腸炎的臨床癥狀
[0068]小鼠臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)、毛色、大小便、生長(zhǎng)均正常。模型組 小鼠，在飲用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出現(xiàn)隱血陽(yáng)性，4-5d幾乎所有小鼠糞便隱血陽(yáng) 性，6-7d呈強(qiáng)陽(yáng)性，甚至血便；同時(shí)伴有小鼠活動(dòng)減少，體重明顯減輕;糞便松軟，或腹瀉發(fā) 生，與人類(lèi)UC臨床癥狀表現(xiàn)相似，表明4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型成功。見(jiàn)圖2:模型組和空 白組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)。4%DSS模型組所示，4%DSS模型組小鼠，3d后模型小鼠體重下降， 肛門(mén)周?chē)y，有血樣大便的痕跡，DAI顯著增高。
[0069] 4.3模型組小鼠結(jié)腸組織MPO活性的改變
[0070] 模型組小鼠結(jié)腸組織上皮和固有層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增多，MPO活性較正常對(duì) 照組明顯增高，見(jiàn)表4。
[0071] 表4模型組小鼠結(jié)腸組織MPO活性(X土S)
[0073] **P〈0.05vs normal group。
[0074] 4.4模型組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)改變
[0075]如圖3(b)所示，光鏡下觀察DSS模型組小鼠結(jié)腸上皮黏膜損傷明顯：黏膜上皮糜 爛，腺體隱窩結(jié)構(gòu)破壞;杯狀細(xì)胞丟失，伴有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞 浸潤(rùn)，而正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸上皮黏膜完整、無(wú)損壞，可見(jiàn)完整的杯狀細(xì)胞，如圖3(a)所示。 [0076]討論:據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，可采取以下方式誘導(dǎo)急性期/活動(dòng)期結(jié)腸 炎和緩解期結(jié)腸炎，這與人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，易反復(fù)發(fā)作的特征相似:一種為 急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型，方法為5%DSS水溶液給小鼠自由飲用，連續(xù)7天，國(guó)內(nèi)外也有文 獻(xiàn)報(bào)道用3-5%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的;在預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，曾嘗試對(duì)該造模方式加以改進(jìn):采用給 小鼠5 %DSS溶液灌胃（0.8ml/只，bid X 4d)，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀，提示出 現(xiàn)這種情況有兩種可能：一是DSS攝入的量不夠，二是這種造模給藥方式，不能在結(jié)腸腔內(nèi) 維持一定的濃度，產(chǎn)生對(duì)上皮組織的毒性作用。所以，基于對(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)的觀察，以及相關(guān)文獻(xiàn) 的報(bào)道，認(rèn)為采用灌胃這種方式給予小鼠DSS溶液誘導(dǎo)結(jié)腸炎是不太可能的，因?yàn)榧词乖黾?DSS溶液的濃度，采取0.8ml/只，每天3次的給藥方式，每天攝入的溶液體積也只有2.4ml，而 正常小鼠一般飲水3-6ml/天。因此，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的情況和相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，讓小鼠自由飲用 4%DSS溶液，連續(xù)7d造模，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎;通過(guò)觀察小鼠臨床癥狀，結(jié)腸黏膜損傷以及 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，以疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)，結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng) 分和MPO活性評(píng)估4%DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型是否成功。MPO是主要存在于中性粒細(xì)胞嗜 天青顆粒中的一種酶，其活性反映了中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目和活性，已被公認(rèn)為評(píng)價(jià)組織 炎癥嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。
[0077]預(yù)實(shí)驗(yàn)讓小鼠自由飲用5%DSS溶液，第3天臨床癥狀開(kāi)始出現(xiàn)，如稀便、血便，第4 天開(kāi)始陸續(xù)有小鼠死亡，說(shuō)明5 % DSS濃度太高。前期研究用3.5 % DSS溶液效果不明顯。 [0078] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠飲用4%DSS溶液3d，開(kāi)始有糞便出現(xiàn)隱血陽(yáng)性;4-5d， 小鼠出現(xiàn)活動(dòng)度明顯減少、體毛凌亂;大便松軟、稠狀;體重減輕，糞便隱血陽(yáng)性程度增強(qiáng)； 6-7d，可見(jiàn)肉眼血便，有腹瀉發(fā)生，小鼠活動(dòng)、進(jìn)食及體重明顯減少。光鏡下觀察結(jié)腸病理切 片顯示，結(jié)腸黏膜上皮糜爛，幾乎全部隱窩結(jié)構(gòu)被破壞，杯狀細(xì)胞丟失，部分病灶表面僅少 許上皮殘留。炎癥主要累及黏膜和黏膜下層，少數(shù)可達(dá)漿膜層;模型組小鼠結(jié)腸組織MPO活 性較正常小鼠顯著增高，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，伴有單核巨噬細(xì)胞，少量淋巴 細(xì)胞，單核細(xì)胞。在一些病變較輕的部位，可見(jiàn)到部分隱窩破壞、變形，排列紊亂，杯狀細(xì)胞 減少，以上提示用4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎是可靠的，模型是成功的。
[0079]小結(jié)：昆明小鼠自由飲用4%DSS水溶液，連續(xù)7d能成功地誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型。 [0080]二、竹節(jié)參總皂苷的提取 [0081 ] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0082]藥材:竹節(jié)參(湖北恩施土家族椿木營(yíng)竹節(jié)參)DlOl大孔樹(shù)脂、不同濃度的乙醇;標(biāo) 準(zhǔn)品：竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷IVa;器材:提取罐、高效液相10*150的玻璃層析柱。
[0083] 2、方法
[0084] (1)取竹節(jié)參藥材根部1000g，粉碎至30-40目。分3次加入4000ml提取罐中回流提 取3次，依次加入10倍量、8倍量、5倍量80 %乙醇回流提取，溫度為80°C，提取時(shí)間分別為2小 時(shí)、1.5小時(shí)、1小時(shí)。提取液合并，并過(guò)濾然后濃縮至無(wú)醇度。
[0085] (2)取1600gD101大孔樹(shù)脂，乙醇浸泡過(guò)夜，加入10*150的玻璃層析柱中，依次用乙 醇，水，5 %的氫氧化鈉，5 %鹽酸，處理樹(shù)脂，然后用水沖至中性。
[0086] (3)將濃縮好的無(wú)醇度的竹節(jié)參提取液緩慢的加入到大孔樹(shù)脂柱中，依次用純水 洗脫，10 %乙醇，30 %乙醇，50 %乙醇，80 %乙醇梯度洗脫。水和不同濃度乙醇，各洗脫2個(gè)柱 體積。HPLC檢測(cè)每個(gè)洗脫液，其中純水，10%乙醇，30%乙醇中含有大量水溶性雜質(zhì)和多糖， 棄去。50 %乙醇洗脫部分，含有少量的竹節(jié)參總皂苷和部分極性較大的雜質(zhì)。80 %乙醇洗脫 部分為竹節(jié)參總皂苷，將80%乙醇洗脫部濃縮真空干燥精制得竹節(jié)參總皂苷12.6克，提取 率為1.26%。以竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷Iva為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)竹節(jié)參總皂苷含量為 67%〇
[0087]三、竹節(jié)參總皂苷對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)
[0088] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0089] 藥品:竹節(jié)參總皂苷;溶劑:0.5%的羧甲基纖維素鈉。
[0090] 2 方法
[0091] 取30只昆明小鼠，體重18-22g雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為3組，每組10只， 分別一次性灌胃給予4500mg/kg(這是最大的給藥劑量）、1500mg/kg、600mg/kg的竹節(jié)參總 皂苷。觀察1周，正常飲食。給藥后第二天、第三天3組小鼠均表現(xiàn)比較興奮，體重有所降低， 大小便正常。觀察一周無(wú)動(dòng)物死亡，故小鼠對(duì)竹節(jié)參總皂苷的最大耐受量為4500mg/kg，比 較安全。
[0092] 四、竹節(jié)參總皂苷對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎防治作用的研究
[0093] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0094] K1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
[0095]雄性昆明小鼠，體重22_25g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0096] 1.2主要試劑和藥品：
[0097]葡聚糖硫酸鈉(美國(guó)MP公司）
[0098]柳氮磺吡啶腸溶片(上海福達(dá)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020840)
[0099] 大便隱血試劑盒(南京建成生物工程研究所）
[0100] IL-Ιβ、IL-10、IL-17、IFN-r 等 ELISA 試劑盒，R&D 公司
[0101] 1.3主要儀器：
[0102] 電子天平
[0103] A2000S型電子分析天平
[0104] XiangYiH165_W 離心機(jī) [0105] _80°C超低溫冰箱(德國(guó)）
[0106] Rayto RT-6500酶標(biāo)分析儀 [0107] BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus)
[0108] 2 方法
[0109] 2 · 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：
[0110] 將50只昆明小鼠，雄性，隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組(Normal)、潰瘍性結(jié)腸炎模型 組(DSS)、陽(yáng)性藥物（SASP，250mg(kg- 1 · d-1K竹節(jié)參總皂苷低劑量組(TSPJ-I，150mg · kg 4 · cf1)和竹節(jié)參皂苷高劑量組(TSPJ-II，300g · kg< · cf1)，每組各10只。各藥物處理組小 鼠灌胃相應(yīng)藥物，見(jiàn)表5動(dòng)物分組及給藥方案。正常組和模型組給予等體積0.5%的羧甲基 纖維素鈉，每日1次，連續(xù)給藥l〇d，給藥第三天開(kāi)始，除正常對(duì)照組以外，其余各組自由飲用 4 % DSS水溶液，每天更換一次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天稱體重，測(cè)大便隱血。
[0111] 表5動(dòng)物分組及給藥方案
[0113] 2.2實(shí)驗(yàn)小鼠處理
[0114] 參照第一部分建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型；同時(shí)按表5的方案給予藥物干預(yù)。
[0115] 2.3小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的評(píng)價(jià)參照第一部分建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中的評(píng)價(jià)方 法。
[0116] 2.4小鼠血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)
[0117] 給藥第8天，摘除眼球取血。離心取血清，按照ELISA(雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸 附法)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)小鼠血清中IL-Ιβ、IL-17、IFN-r、IL-10水平。具體操作 如下：
[0118] (1)準(zhǔn)備:標(biāo)準(zhǔn)品稀釋和配制生物素抗體工作液和酶結(jié)合物工作液。將濃縮洗滌液 用雙蒸水稀釋?zhuān)?:20)，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0 ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中（濃度為10ng/ml)，再配成 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0pg/ml 濃度。
[0119] (2)取出冷凍血清解凍，12〇〇〇\8,311^11。從11^-10、11^17、1卩^廣11^-1〇試劑盒取出 所需板條，除空白孔外，分別將標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100μΙ/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板封 住反應(yīng)孔，37°C孵育90min。
[0120] (3)洗板:甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350μ1，靜置30sec，在厚迭吸水紙上拍干， 洗板5次。
[0121] (4)除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（100μΙ/孔），用封板膠封住反應(yīng)孔，37 °C 孵育 60min。
[0122] (5)洗板 4 次。
[0123] (6)除空白孔外，加入酶結(jié)合工作液（100μΙ/孔），用封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵育 30min〇
[0124] (7)洗板 4 次。
[0125] (8)加入顯色劑100μΙ/孔，避光37°C孵育10_20min。
[0126] (9)加入終止液100μΙ/孔，混勻后在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。
[0127] 2.5小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察及小鼠結(jié)腸組織MPO活性檢測(cè)
[0128] 處死小鼠后，立即取結(jié)腸組織。參照第一部分建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的方法準(zhǔn)備 結(jié)腸樣品及觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)、進(jìn)行結(jié)腸組織MPO活性檢測(cè)。
[0129] 2.6 NF-κΒ、PPAR-γ 免疫組化染色
[0130] 將石蠟標(biāo)本作結(jié)腸橫截面連續(xù)切片，貼附于經(jīng)多聚氨酸處理過(guò)的載玻片上，置入 60°C烘箱過(guò)夜。待樣品收齊后，采用免疫組化SP法染色。具體操作步驟下：
[0131] (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水：50°C左右二甲苯I30min，二甲苯Π30π?η，100%、 95%、85%、70%酒精、蒸餾水各5min，再在蒸餾水中浸泡5min。
[0132] (2) 3 % H2O2室溫孵育IOmin。（以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，3 % H2O2臨時(shí)配 制。）
[0133] (3)蒸餾水洗 2minX3，PBS 浸泡 5min。
[0134] (4)抗原修復(fù):采用熱修復(fù)法。將切片置于盛有抗原修復(fù)液(0.0 lM枸櫞酸緩沖液 P H 6.0)的玻璃容器中，放在電爐上加熱，控制溶液溫度維持在9 2 °C - 9 8 °C之間，持續(xù)10 -15min。停止加熱后，自然冷卻至室溫（約需20-30min，勿將切片從緩沖液中取出），roS洗 5minX3〇
[0135] (5)滴加正常小鼠封閉血清工作液(試劑1)，室溫孵育20min，傾去，勿洗。
[0136] (6)分別滴加一抗NF-kB、PPAR- γ (1:100稀釋?zhuān)?°C過(guò)夜。陰性對(duì)照組加PBS緩沖液 作陰性對(duì)照。
[0137] (7)PBS 沖洗 5minX3。
[0138] (8)滴加生物素化二抗工作液:生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37°C孵育20min。
[0139] (9)PBS 沖洗 5minX3。
[0140] (10)滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液(試劑3)，37°C孵育20min。
[0141] (Il)PBS 沖洗 5minX3。
[0142] (12)DAB顯色劑顯色（用法:取Iml雙蒸水，試劑盒中A、B、C試劑各加1滴，混均后滴 加至切片。顯色劑應(yīng)避光保存，即用即配），自來(lái)水洗3min。
[0143] (13)蘇木素復(fù)染30秒(復(fù)染時(shí)間根據(jù)染色情況而定），自來(lái)水洗3min。
[0144] (14)浸入分化液3-4秒，自來(lái)水充分沖洗，60°C烘箱烤干。
[0145] (15)中性樹(shù)膠封片。
[0146] 2.7免疫組化染色切片吧-仙、??41?-丫蛋白表達(dá)的半定量分析
[0147] 顯微鏡下觀察結(jié)腸組織各層的表達(dá)情況并攝影記錄。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):PPAR-γ以細(xì)胞胞 體部分被染成棕黃(褐)色為陽(yáng)性，NF-kB以胞質(zhì)或胞核部分被染成棕黃(褐)色為陽(yáng)性;陰性 對(duì)照:采用PBS緩沖液代替一抗，其余步驟完全相同。采用GD-8型病理影像多媒體分析系統(tǒng) 對(duì)各組免疫組化的切片隨機(jī)采集，每組至少有3個(gè)以上的動(dòng)物組織切片，選取10個(gè)高倍視野 (400 X 10)，測(cè)定面積積分光密度值(Area integral optical density，AI0D)顯示被檢測(cè) 指標(biāo)的染色強(qiáng)度，即表達(dá)量。 「01481 A TOO-_.陽(yáng)性積分光密度_ =管壁面積（即隨機(jī)選定的視野面積)
[0149] 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
[0150]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS12.0在統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組資料用（X土s)表示，采用單因素方差 分析，比較各組資料間的差異，P<〇.05為差異有顯著性。
[0151] 4 結(jié)果
[0152] 4.1 TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠體重的變化
[0153] 模型組小鼠從飲用4%DSS第3天起，與空白組小鼠相比，體重明顯下降；其余各給 藥組小鼠體重的下降趨勢(shì)均不及模型組，見(jiàn)圖4。同時(shí)和正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸明顯 縮短、萎縮。
[0154] 4.2 TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠臨床癥狀的影響
[0155] 小鼠臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組小鼠行為活躍，生長(zhǎng)正常。模型組小鼠，在飲 用4%DSS溶液2d后，部分小鼠糞便出現(xiàn)隱血陽(yáng)性，4-5d幾乎所有小鼠糞便隱血陽(yáng)性，6-7d呈 強(qiáng)陽(yáng)性，甚至血便；同時(shí)伴有小鼠活動(dòng)減少，體重明顯減輕;糞便松軟，或腹瀉發(fā)生，與人類(lèi) UC臨床癥狀表現(xiàn)相似，表明4 % DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型成功。如圖5TSPJ對(duì)4 % DSS誘導(dǎo)小鼠 疾病活動(dòng)指數(shù)的影響所示，DSS模型組小鼠，3d后DAI開(kāi)始出現(xiàn)持續(xù)顯著增高；SASP能阻遏 DAI增高;TSPJ 150mg/kg、300mg/kg有一定的劑量依賴性抑制DAI增高，有相似的改善DSS誘 導(dǎo)的UC小鼠臨床癥狀的作用(P < 0.01)。
[0156] 4.3 TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響
[0157] HE染色可見(jiàn)正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸上皮黏膜完整，見(jiàn)圖3(a) ASS模型組小鼠結(jié)腸上 皮黏膜損傷明顯，見(jiàn)圖3 (b):黏膜上皮糜爛，腺體隱窩結(jié)構(gòu)破壞;杯狀細(xì)胞丟失，伴有中性粒 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SASP250mg/kg，TSPJ150mg/kg、300mg/kg組結(jié) 腸黏膜損傷明顯減輕，上皮結(jié)構(gòu)較完整，腺體隱窩排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少見(jiàn)，分別 見(jiàn)圖3(c)、圖3(d)、圖3(e)。光鏡下觀察各組標(biāo)本切片，每組15個(gè)視野（X 100, X 200)按照 "表2組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)"，進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分，求其平均值，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表6TSP J對(duì)4% DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響。
[0158] 表6 TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響
[0161] **Ρ<0·01 是與 normal 組比較;##Ρ<0·01 是與 model 組比較。
[0162] 4.3 TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MPO活性的影響
[0163] 小鼠結(jié)腸組織MPO活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7TSP J對(duì)4 %DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MPO活性的 影響，可見(jiàn)在DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織上皮和固有層中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增多，MPO活性 0.565 ± 0.381U/g，較正常對(duì)照組0.241 ± 0.019U/g明顯增高。SASP明顯抑制中性粒細(xì)胞的 浸潤(rùn)和MPO增高（P〈0 · 01) JSPJ各劑量組（150mg/kg，3000mg/kg)亦明顯減小MPO活性（P〈 0 · Oland P〈0 · 05)，且與劑量呈一定的相關(guān)性。
[0164] 表7 TSPJ對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MPO活性的影響
[0166] **P〈0 · 01 與 normal組比較;##P〈0 · 01與model組比較。
[0167] 4.4 TSPJ對(duì)UC小鼠血清中IL-Ιβ、IL-17、IFN-r、IL-10影響的檢測(cè)結(jié)果
[0168] 如表8所示，模型組小鼠血清IL-lf3、IL-17、IFN-r含量均顯著高于正常對(duì)照組(p< 0.01)，其余各給藥組小鼠血清IL-li3、IL-17、IFN-r含量均顯著低于模型組(p<0.01)。模型 組小鼠血清IL-10含量顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01)，各給藥組小鼠血清IL-10含量顯著 高于模型組。竹節(jié)參總皂苷對(duì)IL-li3、IL-17、IFN-r等促炎因子表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而可 以提高抗炎因子IL-10的水平。
[0169] 表8了3?1對(duì)4%〇33誘導(dǎo)小鼠的血清中11^-10、11^-1〇、11^-17、正~1水平的影響（ x±s,n = 10)
LOI7I」wp<0.01 是與normal組比較；ffp<0.05與ffffp<0.01 是與model組比較。
[0172] 4.5TSPJ NF-κΒ、PPAR-γ 免疫組化染色
[0173] 小鼠結(jié)腸組織免疫組化染色顯示，正常對(duì)照組結(jié)腸組織中NF-KB幾乎沒(méi)有表達(dá)見(jiàn) 圖6(a)，而DSS誘導(dǎo)模型組小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)NF-kB的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，呈棕黃色， NF-κΒ在上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核上均有表達(dá)，見(jiàn)圖6(b)。和模型組相比，SASP 組和TSP J低劑量組、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中NF-kB陽(yáng)性細(xì)胞不僅數(shù)量減少，而且染色也較 DSS模型組淺，分別見(jiàn)圖6(c)、圖6(d)、圖6(e)。
[0174] 正常對(duì)照組PPAR-γ主要表達(dá)在結(jié)腸上皮的細(xì)胞核中，表達(dá)比較多，見(jiàn)圖7(a) ;DSS 誘導(dǎo)模型組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，見(jiàn)圖7(b)，UC越嚴(yán)重PPAR-γ 的表達(dá)越少。和模型組相比，SASP組和TSPJ低劑量組、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中PPAR- γ陽(yáng) 性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，分別見(jiàn)圖7(c)、圖7(d)、圖7(e)。
[0175] 4.6 TSPJ免疫組化染色切片NF-KB、PPAR_y蛋白表達(dá)的半定量分析
[0176]顯微鏡下觀察結(jié)腸組織各層的表達(dá)情況并攝影記錄。采用⑶-8型病理影像多媒體 分析系統(tǒng)對(duì)各組免疫組化的切片隨機(jī)采集，每組至少有3個(gè)以上的動(dòng)物組織切片，選取10個(gè) 高倍視野(200 X 10)，測(cè)定面積積分光密度值(Area integral optical density，AI0D)顯 示被檢測(cè)指標(biāo)的染色強(qiáng)度，即表達(dá)量。分析結(jié)果見(jiàn)表9TSP J和SASP對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組 織NF-κΒ和PPAR- γ表達(dá)的影響。
[0177] AIOD=-陽(yáng) I1 生 1? -: 管壁面積（即隨機(jī)選定的視野面積）
[0178] 經(jīng)圖像分析顯示，TSPJ能明顯降低NF-κΒ蛋白表達(dá)，增加 PPAR- γ蛋白表達(dá)。如圖6-7所示。
[0179] 表9 TSPJ和SASP對(duì)4%DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織NF-κΒ和PPAR- γ表達(dá)的影響
[0181] ，<0· 01是與normal組比較嚴(yán)Ρ<0
.01與叩<0.05是與model組比較。
[0182] 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，正常對(duì)照組中NF-κΒ只有少量表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，模型組 中NF-κΒ表達(dá)顯著增加(P<0.01 )，各給藥組可顯著降低NF-κΒ的表達(dá)。模型組中PPAR- γ表 達(dá)與正常對(duì)照組相比，顯著減少(Ρ<〇.01)，各給藥組均可顯著增加PPAR-γ的表達(dá)。
[0183] 討論：
[0184] (一）過(guò)氧化物酶體增殖活化受體（peroxidase proliferation ofactivated receptors，PPARs )PPARs屬核受體超家族，有PPAR-α、PPAR-0( δ)和PPAR- γ三種類(lèi)型。該類(lèi) 受體擁有核受體超家族的特征性結(jié)構(gòu)，即DNA結(jié)合域(DBD)和配體結(jié)合域(LBD) JPAR- γ主 要在脂肪組織表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和糖代謝平衡。PPAR-γ在正常腸黏膜細(xì)胞也呈較高 表達(dá)，PPAR-γ主要表達(dá)在結(jié)腸上皮的細(xì)胞核中，而在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)中呈低表達(dá)。結(jié)腸 上皮是結(jié)腸黏膜免疫系統(tǒng)重要組成部分，任何破壞結(jié)腸上皮生理功能的因素將導(dǎo)致局部免 疫紊亂，產(chǎn)生腸道炎癥，其中能量代謝是其中重要的因素之一。DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎存在 丁酸鹽的氧化缺陷，丁酸鹽是結(jié)腸上皮主要能量來(lái)源之一，丁酸鹽可能通過(guò)PPAR-γ發(fā)揮作 用。當(dāng)PPAR-γ表達(dá)降低時(shí)，上皮細(xì)胞的能量供給下降，細(xì)胞的生理功能遭受破壞，產(chǎn)生腸道 炎癥。在體研究顯示，PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型動(dòng)物有明顯保護(hù)作用;采用 能表達(dá)PPAR- γ的復(fù)制缺陷性腺病毒基因治療和/或PPAR- γ激動(dòng)劑治療，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎 動(dòng)物有明顯防治作用，但對(duì)已形成潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物單用PPAR-γ激動(dòng)劑幾乎沒(méi)有治療作 用。本研究中竹節(jié)參總皂苷可以提高DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的PPAR-γ表 達(dá)，而發(fā)揮治療作用。
[0185] (二)PPAR-γ與細(xì)胞因子
[0186] 結(jié)腸上皮細(xì)胞受到刺激后，可分泌重要的細(xì)胞因子如IL-l、IL-6、TNF_a對(duì)單核巨 噬細(xì)胞、多核中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞亞群有趨化作用，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展、維持和放大中起重 要作用。正常情況下這些免疫因子的表達(dá)處于抑制狀態(tài)，防止局部炎癥的擴(kuò)大，一旦這種抑 制作用被破壞，局部炎癥調(diào)節(jié)將失控，導(dǎo)致腸道疾患產(chǎn)生。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPAR-γ有抑制細(xì) 胞因子及化學(xué)趨化因子分泌的作用，如激活PPAR-γ可抑制脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-6、 IL-l、TNF-a 的分泌。
[0187] PPAR-γ的天然配體前列素J2(15-dPGJ2)可抑制IFN-r誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞化學(xué)趨化 因子的表達(dá)，而IFN-r是Thl最要的細(xì)胞因子之一，在T細(xì)胞回流至炎癥部位有重要作用， PPAR-γ可通過(guò)抑制化學(xué)趨化因子的作用來(lái)減弱T細(xì)胞的回流，從而減弱Thl介導(dǎo)的炎癥反 應(yīng)。Yang等發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2與格列酮類(lèi)均能通過(guò)活化的PPAR γ而抑制PHA誘導(dǎo)的人T細(xì)胞增殖 及IL-2基因表達(dá)，抑制活化的T細(xì)胞與IL-2啟動(dòng)子中同源順式元件相結(jié)合。PPAR γ在調(diào)節(jié)諸 如單核P巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化中有重要意義。PPARy配體通過(guò)PPAR γ依賴P非依賴途徑抑制T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN2 γ。基因芯片技術(shù)結(jié)果顯示PPAR γ在2型T 細(xì)胞中表達(dá)要明顯強(qiáng)于1型T細(xì)胞（大約5~8倍）。2型免疫細(xì)胞在培養(yǎng)條件下（加用IL-IS IFN-γ抗體）可誘導(dǎo)人NK細(xì)胞表達(dá)PPARy?；罨腜PARy可介導(dǎo)抑制單核細(xì)胞炎癥因子 TNF-α，IL-I，IL-2和IL-6的生成，產(chǎn)生抗炎癥作用。T淋巴細(xì)胞活化的關(guān)鍵是控制淋巴細(xì)胞 早期分化反應(yīng)的IL-2基因的表達(dá)。PPARy活化后可抑制IL-2基因表達(dá)從而抑制人T淋巴細(xì) 胞的早期活化。提示PPARy配基可通過(guò)IL-2基因表達(dá)治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，并具有臨床潛 力。
[0188] IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，可以通過(guò)促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因 子來(lái)放大炎癥反應(yīng)。IL-17與受體結(jié)合后，可通過(guò)NF-kB等途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用。Thl7細(xì)胞 能夠分泌產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-6以及a腫瘤壞死因子（tumor necrosis factora，TNF_a) 等，這些細(xì)胞因子可以集體動(dòng)員、募集及活化中性粒細(xì)胞。Thl7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17能有效地 介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動(dòng)員的興奮過(guò)程，從而有效地介導(dǎo)了組織的炎癥反應(yīng)。IL-10來(lái)源于Th2和 部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，能抑制Thl細(xì)胞應(yīng)答及合成細(xì)胞因子，抑制巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能及 合成細(xì)胞因子。
[0189] IL-10作為抗炎因子，能抑制由LPS激活的人單核巨噬細(xì)胞釋放IL-I、IL-17、TNF_a 等促炎因子的分泌。
[0190] (三)PPARy 與NF-kB
[0191] PPAR γ通過(guò)與NF-kB的亞基p65/p50結(jié)合，發(fā)生蛋白-蛋白相互作用，形成轉(zhuǎn)錄抑制 復(fù)合物，降低了 NF-kB與炎癥因子基因啟動(dòng)子區(qū)的同源順式元件結(jié)合，從而抑制其表達(dá)。由 于結(jié)腸黏膜PPAR- γ和TLR4表達(dá)失衡，后者表達(dá)增多，激活下游信號(hào)通路增強(qiáng)，導(dǎo)致NF-kB等 轉(zhuǎn)錄因子激活，炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大。
[0192] 結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究推測(cè)竹節(jié)總皂苷的作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)PPAR- γ、抑制NF-κΒ的 表達(dá)，抑制血清中促炎因子IL-li3、IL-17、IFN-r的表達(dá)，增強(qiáng)抗炎因子IL-10的表達(dá)，減少脂 質(zhì)氧化產(chǎn)物MPO的產(chǎn)生而發(fā)揮對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用，減輕炎癥的損傷。
[0193] 本發(fā)明中涉及到的英文縮寫(xiě)的具體名稱如表10所示。 「01941 丟1Ω革j縮S對(duì)眧
L0197」對(duì)十本領(lǐng)域技術(shù)人員時(shí)言，M然本友明小|很十上述不范性買(mǎi)施例的細(xì)節(jié)，時(shí)且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論 從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0198]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，竹節(jié)參總皂苷對(duì)小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎的有效劑量為150mg/kg，小鼠對(duì)竹節(jié)參總皂苷 的最大耐受量為4500mg/kg。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，竹節(jié)參總皂苷的制備過(guò)程，包括以下步驟： (1) 取竹節(jié)參藥材根部，粉碎至30-40目；分3次加入提取罐中回流提取3次，依次加入10 倍量、8倍量、5倍量質(zhì)量濃度為80%乙醇回流提取，溫度為80°C，提取時(shí)間分別為2小時(shí)、1.5 小時(shí)、1小時(shí);合并提取液，并過(guò)濾然后濃縮至無(wú)醇度，制得竹節(jié)參提取液； (2) 取大孔樹(shù)脂，乙醇浸泡過(guò)夜，加入玻璃層析柱中，依次用乙醇、水、質(zhì)量濃度為5 %的 氫氧化鈉、質(zhì)量濃度為5%鹽酸處理大孔樹(shù)脂，然后用水沖至中性； (3) 將濃縮好的無(wú)醇度的竹節(jié)參提取液緩慢的加入到含有大孔樹(shù)脂的玻璃層析柱中， 依次用純水洗脫，質(zhì)量濃度為10 %乙醇、30 %乙醇、50 %乙醇、80 %乙醇梯度洗脫;水和不同 濃度乙醇，各洗脫2個(gè)柱體積，將80 %乙醇洗脫部濃縮真空干燥制得竹節(jié)參總皂苷。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的竹節(jié)參總皂苷在制備抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，大孔樹(shù)脂采用D101大孔樹(shù)脂。
【文檔編號(hào)】A61P1/00GK105963333SQ201610536850
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月8日
【發(fā)明人】鄧慶華, 唐倩, 陳先玉, 劉曉穎, 蔣紅艷, 蘇湲淇, 鄭小紅
【申請(qǐng)人】重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校