專利名稱：一種魚類虹彩病毒dna疫苗制備方法
一種魚類虹彩病毒DNA疫苗制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖中DNA疫苗制備方法，具體的說是防治虹彩病毒的DNA疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及編碼和表達(dá)魚虹彩病毒免疫原的載體構(gòu)建，虹彩病毒是造成漁業(yè)生產(chǎn)中巨大損失的一種致病病毒，致死率高達(dá)60%以上。本專利涉及到生產(chǎn)和制備該疫苗的方法，也涉及到了虹彩病毒DNA疫苗的接種方法。
虹彩病毒主要感染無脊椎動物和低等脊椎動物，是大型20面體狀DNA病毒， 分為虹彩病毒屬(Iridovirus),綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus),淋巴囊腫病毒屬 (Lymphocystivirus),娃病毒屬(Ranavirus)和細(xì)胞腫大病毒屬(Megalocytivirus)。在水產(chǎn)業(yè)中造成巨大損失的虹彩病毒有紅鯛魚虹彩病毒(red sea bream iridovirus)、臺灣石斑魚虹彩病毒(Taiwan Grouper iridovirus)、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus)、大黃魚虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus)和大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus)。
病毒類疾病沒有有效的藥物來控制，接種疫苗預(yù)防是針對病毒類疾病的一種經(jīng)濟(jì)有效的手段。目前世界上應(yīng)用的虹彩病毒疫苗只有日本鯛魚虹彩病毒疫苗(Kazuhiro Nakajima etc, Effectiveness of a vaccine against red sea bream iridovirus disease in a field trial test, Dis Aquat Org, Vol. 36: 73-75，1999),其疫苗米用滅活方法制備。國內(nèi)研發(fā)中的虹彩病毒疫苗也都采取滅活方法制備，病毒的培養(yǎng)使疫苗的生產(chǎn)成本非常昂貴，這限制了疫苗的推廣。
主要衣殼蛋白是虹彩病毒的重要免疫原，ankyrin repeat containing protein 也有文獻(xiàn)報(bào)道其具有免疫原性(Yun Im Kim etc, Production of polyclonal antibody against recombinant ORF 112L of rock bream iridovirus and in vitro neutralization)。
本發(fā)明為一種DNA疫苗,通過免疫接種，使魚自身表達(dá)虹彩病毒major capsid protein和ankyrin repeats containing protein這兩種病毒蛋白，通過抗原提呈，使魚的免疫細(xì)胞產(chǎn)生針對這兩種蛋白質(zhì)的抗體，從而達(dá)到免疫保護(hù)的作用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一個DNA疫苗，通過接種，魚類自身能夠表達(dá)虹彩病毒的具有免疫原性的蛋白質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生對虹彩病毒的抗體，保護(hù)魚類免受虹彩病毒的侵害。
本發(fā)明提供的DNA疫苗，包括以下內(nèi)容a)質(zhì)粒構(gòu)建 氨芐青霉素抗性篩選比較和原核復(fù)制起始位點(diǎn)取自質(zhì)粒PBR322，NdeI和EcoRI酶切， Agrose 膠回收 2Kb 的片段；MCP 基因和 ankyrin repeats containing protein 基因?yàn)槿蚝铣?，其前面加上真核啟動子，后面加上終止子?；蚱唇映梢粭l片段，通過同源重組與質(zhì)粒PBR322的ori和amp片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (圖1)。挑選陽性克隆，DNA測序驗(yàn)證；b)以上構(gòu)建的質(zhì)粒和生理鹽水、佐劑混合后，得到DNA疫苗。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。
圖1是表達(dá)載體不意圖。
該DNA疫苗與其他技術(shù)路線構(gòu)建的疫苗相比具有如下優(yōu)點(diǎn)a、生產(chǎn)成本低,適合大批量生產(chǎn)；DNA分子穩(wěn)定,適合儲藏和運(yùn)輸；b、安全，DNA疫苗表達(dá)的是一段病毒基因，不會發(fā)生病毒逆變；C、該DNA疫苗同時(shí)表達(dá)MCP和ankyrin repeats protein,它是一個兩價(jià)疫苗，同時(shí)DNA 分子本身就可以作為佐劑，可以與生理鹽水混合直接注射。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :DNA疫苗的制備載體構(gòu)建全基因合成片段 Pcmv-MCP_SV40 pA-Pcmv-ankyrin repeats_SV40 pA, MCP 和 ankyrin repeats核苷酸序列見附件。此片段同質(zhì)粒pBR322上的2k片段同源重組 (GBI)，反應(yīng)體系為15ul GBclonart反應(yīng)液；Iul pBR322片段；2ul全基因合成片段；2ul ddH20。50°C孵育30min后，取5ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。氨芐青霉素LB固體平板篩選。測序驗(yàn)證正確克隆，500ml LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，大量抽提質(zhì)粒備用。液體LB培養(yǎng)基的配方為 O. 5%的酵母提取液；1%的蛋白胨；1%的氯化鈉，條pH值至7. 0,121°C，15分鐘滅菌。固體 LB培養(yǎng)基為在液體LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1. 5%的瓊脂粉；DNA疫苗配方生理鹽水配方為O. 65%的氯化鈉溶解于蒸餾水，氯化鈉的濃度可以使O. 5%到O. 9%之間。也可以是任氏生理鹽水或者樂氏生理鹽水。推薦DNA疫苗配方為=IugDNA溶解在Iul 生理鹽水中。
實(shí)施例2 以大菱鲆為對象的注射給藥免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)大菱鲆隨機(jī)分為14組，每組3個水槽，10尾/槽。將制備的DNA疫苗采用肌肉注射方式免疫，注射量為Iug/尾和IOug/尾，對照為生理鹽水。免疫4周后，用虹彩病毒攻毒 (105CFU/尾)。15天后觀察死亡數(shù)，計(jì)算每組的免疫保護(hù)率(見表I)。
表 I
權(quán)利要求
1.一種虹彩病毒DNA疫苗制備方法，其特征在于，該DNA載體 a)含有編碼和表達(dá)虹彩病毒衣殼蛋白(MCP)的基因； b)含有編碼ankyrinrepeats基因； c)可以是同時(shí)含有衣殼蛋白和ankyrinrepeats兩個基因的混合物。
2.如權(quán)利I所描述的DNA載體，載體上的免疫原性基因的啟動子和增強(qiáng)子可以是常用的強(qiáng)啟動子如Pcmv等，也可以是使真核細(xì)胞尤其是魚類來源的組成型或者組織特異性的啟動子，如ATP酶啟動子、肌動蛋白啟動子等。
3.如權(quán)利I和2所描述的DNA疫苗在制備養(yǎng)殖魚類虹彩病毒防治中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利3所描述的應(yīng)用，其特征在于，其中所說的制備是如權(quán)利I和2所描述的DNA載體、生理鹽水和免疫佐劑。
5.如權(quán)利3所描述的應(yīng)用，其特征在于，其中所制備的DNA疫苗通過注射方式給藥，給藥濃度為1-1Oug/尾。
6.如權(quán)利3所描述的應(yīng)用，其特征在于，其中所制備的DNA疫苗通過浸泡給藥，給藥濃度為1-1Oug/尾。
全文摘要
本發(fā)明為一種魚類虹彩病毒的DNA疫苗，它包含真核轉(zhuǎn)錄啟動子、虹彩病毒主要衣殼蛋白(MCP)的基因、ankyrinrepeats基因和真核轉(zhuǎn)錄終止子，還包括用于擴(kuò)增質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性篩選標(biāo)記(圖1)。本發(fā)明涉及的DNA疫苗，推薦采用肌肉注射的方法，此外還可以采用口服和浸泡的方式免疫。
文檔編號A61P31/20GK103041404SQ201210153708
公開日2013年4月17日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者李琦, 滕以剛 申請人:上海七海復(fù)泰生物科技有限公司