專利名稱：用于誘導(dǎo)針對(duì)金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽的制作方法
用于誘導(dǎo)針對(duì)金黃色葡萄球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求于2005年1月21日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/645,811的優(yōu)先權(quán)，通過引用將它合并于本文中。
背景技術(shù)：
在本申請(qǐng)全文中引用的對(duì)比文件不被認(rèn)為是所要求保護(hù)的發(fā)明的 現(xiàn)有技術(shù)。
5V"/;/^/oc0cc"s "i^ens (金黃色葡萄球菌)是作用于多種疾病和狀 況(condition)的病原體。由S.做reMs引起的疾病和狀況的例子包括 菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎、毛嚢炎、邦、癰、膿皰病、大皰性膿皰病、 蜂窩組織炎、botryomyosis、毒性休克綜合癥、燙傷樣皮膚綜合中樞神 經(jīng)系統(tǒng)感染、傳染性和炎癥性的眼病、骨髄炎和其它關(guān)節(jié)及骨骼的感 染和呼吸道感染。(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer ( eds.) ， Churchill Livingstone Inc. 1997.)
可以采用基于免疫學(xué)的策略來控制51. flMWlW感染和51. flfM"MS的傳 播。基于免疫學(xué)的策略包括被動(dòng)和主動(dòng)的免疫。被動(dòng)免疫采用靶向&
的免疫球蛋白。主動(dòng)免疫諸導(dǎo)針對(duì)& a w s的免疫反應(yīng)。 潛在的& "iweMS疫苗乾向51. ""reus多糖和多肽。把向可以通過使 用適合的S. a"""s多糖或多肽作為疫苗成分來實(shí)現(xiàn)?？梢员挥米鳛闈?在的疫苗成分的多糖的例子包括& 5型和8型莢膜多糖。
(Shinefield et al. ， N. Eng. J. Med. 346:491-496 ， 2002.)可以用作為可
能的疫苗成分的多肽的例子包括膠原粘附素、纖維蛋白原結(jié)合蛋白和 聚集因子.(Mamo et al" FEMS Immunology and Medical Microbiology 10:47-54， 1994， Nilsson et al" J. Clin. Invest 101:2640-2649, 1998， Josefsson et al" The Journal of Infectious Diseases 184:1572-1580， 2001.)
關(guān)于5". flwe^多肽序列的信息可以通過對(duì)5". flM/*et 基因組效、J序來 獲得。(Kurodaetal" Lancet 357:1225-1240， 2001， Baba et al" Lancet359:1819-1827， 2000， Kunsch et al.，歐洲專利公開EP 0 786 519， 1997 年7月30日公開)。使用生物信息學(xué)的努力在一定程度上表征了從基 因組測(cè)序獲得的多肽序列。(Kunsch et al.，歐洲專利公開EP 0 786 519， 1997年7月30日公開)
一些技術(shù)，例如涉及展示(display)技術(shù)和來自受感染患者的血 清的技術(shù)，已經(jīng)用于努力幫助鑒定編碼潛在抗原的基因。(Foster et al.，國際公開號(hào)WO 01/98499， 2001年12月27日公開，Meinkeetal.， 國際公開號(hào)WO 02/059148， 2002年8月1日公開，Etz et al., PNAS 99:6573-6578， 2002.)
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及包含與SEQ ID NO: 1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸序列的多 肽或其片段、5". fl"retwAhpC-AhpF組合物，以及此類多肽和組合物的 用途。SEQ ID NO: 1具有全長S. aureus AhpC序列。含有氨基His-tag 和三個(gè)額外羧基氨基酸的SEQ ID NO: 1的衍生物被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
提到"保護(hù)性"免疫或免疫應(yīng)答表明針對(duì)S. aureus感染的可檢測(cè)
水平的保護(hù)。可以使用動(dòng)物模型，例如在本文中描述的那些來評(píng)定保 護(hù)的水平。
因而，本發(fā)明的第一個(gè)方面描述了多肽免疫原，其包含與SEQID NO: l或SEQ ID NO: 1的片段至少85%相同的氨基酸序列，其中所 述多肽提供了針對(duì)又的保護(hù)性免疫，并且所述多肽免疫原不是 SEQ ID NO: 1的多肽。提到免疫原表明提供針對(duì)& ""^"s的保護(hù)性
免疫的能力。
提到包含與SEQ ID NO: 1至少85%相同的氨基酸序列表明存 在SEQ ID NO: 1的相關(guān)區(qū)域，并且可以存在其它的多肽區(qū)域。與參 考序列的同一性百分比(也稱為百分比相同于)是通過對(duì)多肽序列與 參考序列進(jìn)行比對(duì)并確定相應(yīng)區(qū)域中相同氨基酸的數(shù)目來測(cè)定的。這 個(gè)數(shù)目除以參考序列(例如，SEQ ID NO: 1)中的氨基酸總數(shù)，然后 乘以IOO并四舍五入到最接近的整數(shù)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了免疫原，其包含提供針對(duì)^做"w的 保護(hù)性免疫的多肽，以及在羧基末端或氨基末端與所述多肽共價(jià)連接的一個(gè)或多個(gè)其它區(qū)域或部分(moiety)，其中每個(gè)區(qū)域或部分獨(dú)立地 選自具有至少一種以下性質(zhì)的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫應(yīng)答，有利于純 化或有利于多肽穩(wěn)定性。
提到"其它區(qū)域或部分"表明不同于^ ""re"s AhpC區(qū)域的區(qū)域 或部分。其它區(qū)域或部分可以是，例如，其它的多肽區(qū)域或非肽區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了由AhpC-AhpF組合物組成的純化的 免疫原。AhpC組分包含至少85%相同于SEQ ID NO: 1的多肽。AhpC 組分包含至少85%相同于SEQ ID NO: 3的多肽。提到純化的表明所 述組合物存在于缺少一種或多種下述其它多肽的環(huán)境中，所述其它多 肽是AhpC和AhpF與之天然地相關(guān)的或代表了存在的總蛋白中的至少 約10%。
優(yōu)選地，所述組合物是基本上純化的。"基本上純化的"AhpC和 AhpF組合物存在于缺少所有的或大多數(shù)下述其它多肽的環(huán)境中，所述 其他多肽是AhpC和AhpF多肽與之天然地相關(guān)的。
提到"純化的"或"基本上純化的"不需要多肽經(jīng)歷任何純化， 可以包括，例如，沒有被純化的化學(xué)上合成的多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了能在患者中誘導(dǎo)針對(duì)S. aureus的保護(hù) 性免疫的組合物。所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和免疫有效量 的提供針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫的免疫原。
免疫有效量是足以提供針對(duì)S. aureus感染的保護(hù)性免疫的數(shù)量。 該數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以顯著地防止S. aureus感染的可能性或嚴(yán)重度。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了包含重組基因的核酸，所述重組基因 編碼提供針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫的多肽。重組基因含有編碼多肽 的重組核酸以及用于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和加工的調(diào)節(jié)元件(其可以包括翻譯 和翻譯后元件)。重組基因可以獨(dú)立于宿主基因組存在，或可以是宿 主基因組的一部分。
重組核酸是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸。重組核酸的 例子包括純化的核酸、組合在一起提供了不同于自然中發(fā)現(xiàn)的核酸的 兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域，以及相互之間天然相關(guān)的一種或多種核酸區(qū)域 (例如，上游或下游區(qū)域)的缺少。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了重組細(xì)胞。所述細(xì)胞包含重組基因， 所述重組基因編碼提供針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了產(chǎn)生提供針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫 的多肽的方法。所述方法包括培養(yǎng)含有編碼所述多肽的重組核酸的重 組細(xì)胞，并純化所述多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了提供針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫的多 肽，所述多肽由下述過程生產(chǎn)，所述過程包括在宿主中培養(yǎng)含有編碼 所述多肽的重組核酸的重組細(xì)胞，并純化所述多肽?？梢圆捎貌煌?宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了分離的AhpC-AhpF結(jié)合蛋白。所述結(jié) 合蛋白包含與AhpC-AhpF復(fù)合物結(jié)合的抗體可變區(qū)。
提到"分離的"表明與天然發(fā)現(xiàn)的形式不同的形式。所述不同形 式可以是，例如，與天然發(fā)現(xiàn)有所不同的純度和/或天然沒有發(fā)現(xiàn)的結(jié) 構(gòu)。天然沒有發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)包括下述重組結(jié)構(gòu)，其中不同的區(qū)域被組合 在一起，例如，人源化抗體，其中一個(gè)或多個(gè)鼠的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 被插入到人類框架支架(framework scaffold)上；雜交抗體，其中來 自抗體結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)CDR被插入到不同的框架支架上；以及 來自天然人類序列的抗體，其中編碼輕和重可變區(qū)的基因被隨機(jī)組合 到一起。
優(yōu)選地，分離的蛋白基本上沒有血清蛋白?；旧蠜]有血清蛋白 的蛋白質(zhì)存在于缺乏大多數(shù)或所有血清蛋白的環(huán)境中。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了針對(duì)S. aureus感染對(duì)患者加以治療的 方法。所述方法包括向所述患者施用一種或多種以下物質(zhì)的步驟
(a) 免疫有效量的免疫原，其包含與SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: 1的片段至少85。/o相同的氨基酸序列，其中所述多肽提供了針對(duì) S. aureus的保護(hù)性免疫
(b) 免疫原性組合物，其包含與SEQIDNO: 1至少85%相同的 多肽和與SEQIDNO: 3至少85%相同的多肽；或
(c) 有效量的AhpC-AhpF結(jié)合蛋白。
除非特定的術(shù)語互相排斥，提到"或"表明可能性之一或兩者都 有。有時(shí)，例如"和/或"等用語被用于突出之一或兩者的可能性。
引述開放性的術(shù)語例如"包含"允許添加元素或步驟。有時(shí)用語 例如"一個(gè)或多個(gè)，，與或不與開放式術(shù)語一同使用來強(qiáng)調(diào)添加元素或 步驟的可能性。除非明確地聲明，提到術(shù)語例如"a"或"an"不局限于一個(gè)。例 如，"細(xì)胞(a cell)"不排除"多個(gè)細(xì)胞(cells)，，。有時(shí)例如"一 個(gè)或多個(gè)"等用語被用于強(qiáng)調(diào)多個(gè)的存在的可能性。
根據(jù)在此提供的包括不同實(shí)施例的其它描述，本發(fā)明的其它特征 和益處是明顯的。提供的實(shí)施例例舉了在實(shí)踐本發(fā)明中有用的不同成 分和方法。實(shí)施例不限制要求保護(hù)的發(fā)明。根據(jù)當(dāng)前的公開，熟練的 技術(shù)人員可以鑒定和采用對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明有用的其它成分和方法。
附圖的簡要說明
附

圖1闡示了SEQIDNO: 1和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。 完整的序列是SEQIDNO: 2。粗體顯示的部分是SEQ ID NO: 1。下 劃線的區(qū)域是氨基His-tag區(qū)域和在羧基端的其它氨基酸。
附圖2闡示了對(duì)來自S. aureus ( SEQ ID NO: 1)和S.印idermidis (SEQ ID NO: 6， GenBank Accession No. AE016752 )的AhpC序列 之間的序列比較。氨基酸差異以粗體顯示。
附圖3闡示了編碼SEQIDNO: 2的核酸序列(SEQ ID NO: 5)。 額外的His-tag和羧基氨基酸編碼區(qū)以粗體顯示.
附圖4闡示了編碼SEQ ID NO: 3的DNA序列(SEQ ID NO: 4)。
附圖5A和5B闡示了對(duì)來自S. aureus: SEQ ID NO: 3 ( GenBank 登記No. U92441 ) 、 9 ( GenBank登記No. AP004823 )和10 ( GenBank 登記No. BX57183 )和S. epidermidis, SEQ ID NO: 8 ( GenBank登記 No. AE016752)的不同AhpF序列之間的序列比較。氨基酸差異以粗體 顯示。
附圖6A和6B闡示了使用處于氫氧化磷酸鋁佐劑中的SEQ ID NO: 2多肽(圓團(tuán))或單獨(dú)的佐劑(三角形)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
發(fā)明的詳細(xì)說明
在下文提供的使用SEQ ID NO: 2的實(shí)施例中闡釋了 SEQ ID NO: l相關(guān)多肽提供保護(hù)性免疫的能力。SEQ ID NO: 2是SEQIDNO: 1 的衍生物，其含有氨基His-tag和三個(gè)額外的羧基氨基酸。His-tag有利 于多肽純化和鑒定。
與SEQ ID NO: 1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽包括含有不同S. aureus菌林中存在的相應(yīng)區(qū)域和天然發(fā)生區(qū)域的衍生物的多肽。SEQ ID NO: l的 氨基酸序列由附圖1中的粗體區(qū)域闡示。附圖l還闡示了 SEQ ID NO: 2中存在的氨基His-tag和額外的羧基氨基酸。 I. AhpC序列
S. aureus AhpC最初被鑒定為與E. coli烴基過氧化氬物還原酶具 有廣泛相似性的由、滲透上調(diào)休克(osmotic up shock) i秀導(dǎo)的蛋白質(zhì) (AhpC ) 。 (Amstrong-Buisseret et al" Microbiology 141:1655-1661 ， 1995.)不同相似性的AhpC同源物存在于哺乳動(dòng)物腦中和不同的生物 體，包括許多細(xì)菌物種中。(Chae et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7017-7021， 1994， Yanetal.， Helicobacter 6:274-282， 2001.)
S. aureus AhpC相關(guān)序列已經(jīng)在不同的參考文獻(xiàn)中被給出了不同 的名稱。在TIGR ( SA0452 ); Babaetal" Lancet 359:1819-1827， 2002 (MW0357); K訓(xùn)da et al" Lancet 357:1225-1240， 2001 ( SAV0381 ); 和Ohta et al" DNA Research 1:51， 2004 ( SAV0381 and SAV0773 )中
提供了不同名稱的例子。。
附圖2提供了對(duì)S. aureus ( SEQ ID NO: 1)和S. epidermidis ( SEQ ID NO: 6)中存在的S. aureus AhpC相關(guān)序列之間的序列比較?？梢?從其它AhpC序列進(jìn)行另外的比較。
可以根據(jù)與已知AhpC序列相比高度的序列相似性或連續(xù)氨基酸 的存在，來鑒定天然存在的其它AhpC序列。連續(xù)的氨基酸提供了特 征性標(biāo)簽。在不同的實(shí)施方式中，天然存在的AhpC序列是在 Staphylococcus中、優(yōu)選的S. aureus中發(fā)現(xiàn)的序列，具有如SEQ ID NO: l中至少20個(gè)、至少30個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)氨基酸；和/或具有與 SEQ ID NO: 1的至少85%序列相似性或同一性。
可以通過不同的算法和本領(lǐng)域公知的技術(shù)來確定序列相似性。一 般地，可以通過比對(duì)兩個(gè)序列來獲得最大氨基酸同一性，容許序列之 一中的缺口、添加和替換的技術(shù)來確定序列相似性。
例如，使用利用程序lalign (由Huang和Miller開發(fā)，Adv. Appl. Math. 12:337-357， 1991，《sim》程序)的局部比對(duì)工具，可以確定序列 相似性。選項(xiàng)和環(huán)境變量是第一個(gè)殘基缺口的^#_罰分(默認(rèn)-14); -經(jīng)#_缺口中每個(gè)其它殘基的罰分(默認(rèn)-4) ， -sstr (SMATRIX)可選 擇的計(jì)分矩陣文件的文件名。對(duì)于蛋白質(zhì)序列，通過默認(rèn)-w #_(LINLEN )序列比對(duì)輸出線長度(60)來使用PAM250。 II. SEQIDNO: l相關(guān)多肽
SEQIDNO: 1相關(guān)多肽含有與SEQ ID NO: 1至少85%相同的氨 基酸序列。提到"多肽"時(shí)不提供最小或最大大小限制。
至少85%相同于SEQ ID NO: 1的多肽含有SEQ ID NO: 1的多 至約28個(gè)氨基酸改變。每個(gè)氨基酸改變獨(dú)立地是氨基酸替換、刪除或 添加。在不同的實(shí)施方式中，SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽至少90%、至少 94%或至少99%相同于SEQIDNO: 1;與SEQ ID NO: 1不同0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或20個(gè)氨基酸改變；或基本上由SEQIDNO: 1組成。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及多肽免疫原，其包含或基本上由至少 85%、至少95%或100%相同于SEQIDNO: 1的氨基酸178-189的序 列組成。在另一些實(shí)施方式中，包含SEQIDNO: 1的氨基酸H8-189 的多肽由總共不超過13、 15、 20、 25、 50、 100或150個(gè)氨基酸組成； 和/或整個(gè)多肽至少85%、至少90。/?；蛳嗤赟EQIDNO: 1區(qū)域并包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸178-189?？赡艽嬖诘钠渌被岚ㄆ渌?的SEQ ID NO: 1氨基酸或其它氨基酸區(qū)域。優(yōu)選的其它氨基酸是氨 基末端甲硫氨酸。
提到"基本上由"指明的氨基酸"組成"表明存在所指的氨基酸 并且可能存在其它氨基酸。其它氨基酸可以是在羧基或氨基末端。在 不同的實(shí)施方式中，存在1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個(gè)其它氨基酸。
可以對(duì)SEQIDNO: 1多肽或其片段進(jìn)行改變，來獲得誘導(dǎo)針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫的衍生物。例如，可以進(jìn)行改變來獲得保持了誘 導(dǎo)針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫能力的衍生物，或來獲得除了提供保護(hù) 性免疫之外還具有可以實(shí)現(xiàn)特定目的的區(qū)域的衍生物。
附圖2中提供的序列比較和與其它S. aureus AhpC序列的比較， 可以用于指導(dǎo)設(shè)計(jì)潛在的改變。此外，可以考慮氨基酸的已知性質(zhì)進(jìn) 行改變。
一般地，在取代不同氨基酸以保持活性的過程中，交換具有相似 性質(zhì)的氨基酸是優(yōu)選的。對(duì)于氨基酸替換而言，可以考慮的因素包括 氨基酸大小、電荷、極性和疏水性。不同的氨基酸R基團(tuán)對(duì)氨基酸性質(zhì)的影響是本領(lǐng)域7〉知的。(參見，例如Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002， Appendix 1C.)
在交換氨基酸以維持活性的過程中，置換氨基酸應(yīng)具有一種或多 種相似的性質(zhì)，例如大約相同的電荷和/或大小和/或極性和/或疏水性。 例如，纈氨酸對(duì)亮氨酸、精氨酸對(duì)賴氨酸、和天冬酰胺對(duì)谷氨酰胺的 替換是不引起多肽功能變化的良好候選。
實(shí)現(xiàn)特定目的的改變包括被設(shè)計(jì)以有利于多肽的生產(chǎn)或效力的那 些；或編碼核酸的克隆的那些。通過使用適合于重組表達(dá)的起始密碼 子(例如，編碼甲硫氨酸)可以便于多肽生產(chǎn)。甲硫氨酸稍后可以在 細(xì)胞加工期間被除去。例如，通過引入可伴隨有氨基酸添加或改變的 限制性位點(diǎn)，可以協(xié)助克隆。
可以通過表位強(qiáng)化來增強(qiáng)多肽誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的效力?？梢允褂貌?同的技術(shù)進(jìn)行表位強(qiáng)化，所述技術(shù)例如，涉及改變錨定殘基來改善肽 對(duì)MHC分子的親和性的那些，以及提高肽-MHC復(fù)合物對(duì)T細(xì)胞受 體的親和性的那些。(Berzofsky et al.， Nature Review 1:209-219， 2001.)
優(yōu)選地，所述多肽是純化的多肽。"純化的多肽"存在于缺乏一 種或多種下述其它多肽的環(huán)境中，所述其它多肽天然地與之相關(guān)和/或 以存在的總蛋白中的至少約10%存在.在不同的實(shí)施方式中，純化的 多肽在樣品或制品中代表總蛋白的至少約50%、至少約"％或至少約 95%。
在一種實(shí)施方式中，多肽是"基本上純化的"。基本上純化的多 肽存在于缺少與之天然相關(guān)的所有或大多數(shù)其它多肽的環(huán)境中。例 如，基本上純化的S. aureus多肽存在于缺少所有或大多數(shù)其它S. aureus多肽的環(huán)境中。環(huán)境可以是，例如，樣品或制品。
提到"純化的"或"基本上純化的"不需要多肽經(jīng)歷任何純化， 可以包括，例如，沒有被純化的化學(xué)上合成的多肽。
可以通過修飾多肽羧基或氨基末端來增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性?？赡艿男?飾的例子包括氨基末端保護(hù)基團(tuán)，例如，乙酰基、丙基、丁二酰基、 苯甲基、芐氧基羰基或t-丁氧羰基；和羧基末端保護(hù)基團(tuán)，例如酰胺、 曱酰胺和乙酰胺。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，多肽免疫原是下述免疫原的部分， 所述免疫原含有在羧基末端或氨基末端與所述多肽共價(jià)連接的一個(gè)或多個(gè)其它區(qū)域或部分，其中每個(gè)區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種
以下性質(zhì)的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫應(yīng)答，有利于純化或有利于多肽穩(wěn) 定性。例如，使用可以存在于氨基或羧基末端的基團(tuán)如聚乙二醇，可 以增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性。
可以通過向羧基或氨基末端添加基團(tuán)以有利于純化來增強(qiáng)多肽純 化。可用來有利于純化的基團(tuán)的例子包括提供親合性標(biāo)簽的多肽。親 合性標(biāo)簽的例子包括六組氨酸標(biāo)簽、trpE、谷胱甘肽和麥芽糖結(jié)合蛋 白。
可以使用通常能增強(qiáng)免疫應(yīng)答的基團(tuán)來增強(qiáng)多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答的 能力?？梢耘c多肽連接來增強(qiáng)針對(duì)所述多肽的免疫應(yīng)答的基團(tuán)的例子 包括細(xì)胞因子，例如IL國2。 ( Buchan et al.， 2000. Molecular Immunology 37:545-552.)
III. AhpC-AhpF免疫原
AhpC-AhpF免疫原是含有AhpC和AhpF組件的組合物。AhpC 組件由SEQIDNO: l相關(guān)多肽組成。AhpC組件由SEQ ID NO: 3相 關(guān)多肽組成。
SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽含有與SEQ ID NO: 1至少85%相同的氨 基酸序列。SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽的不同的實(shí)施方式在上文II節(jié)中 有所描述。
SEQ ID NO: 3相關(guān)多肽含有與SEQ ID NO: 3至少85%相同的氨 基酸序列。每個(gè)氨基酸改變獨(dú)立地是氨基酸替換、刪除或添加。在不 同的實(shí)施方式中，SEQ ID NO: 3相關(guān)多肽至少90%、至少94%、至 少99%或相同于SEQIDNO: 3;與SEQ ID NO: 3不同0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20 個(gè)氨基酸改變；或基本上由SEQIDNO: 3組成。
對(duì)SEQ ID NO: 3相關(guān)多肽進(jìn)行改變來獲得與SEQ ID NO: 1相 關(guān)多肽組件一同使用的衍生物。例如，可以進(jìn)行改變，來獲得保持了 誘導(dǎo)針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫能力的完整組合物，或來獲得除了提
供保護(hù)性免疫之外還具有可以實(shí)現(xiàn)特定目的的區(qū)域的完整組合物。
可用于幫助設(shè)計(jì)AhpF組件的不同的AhpF序列的例子在附圖5A
和5B中提供。產(chǎn)生對(duì)多肽的改變的其他指導(dǎo)在以上的II節(jié)中提供了。 在不同的參考文獻(xiàn)中對(duì)S. aureus AhpF相關(guān)序列給出了不同的名稱。在TIGR (SA0451 ) ; Baba et al.， Lancet 359:1819-1827， 2002 (MW0356) ; Kurodaetal.， Lancet 357:1225-1240， 2001 ( SAV0380 andSA0365);和Enright et al" PNAS 99:9786-9791， 2002 ( SAS0357 andSAR0398).中提供了不同名稱的例子。
優(yōu)選地，使用表達(dá)兩個(gè)組件的構(gòu)建體重組產(chǎn)生AhpC和AhpF組合 物。例如，E. coli菌林可以被工程化來共表達(dá)ahpC和ahpF，可以分 離AhpC和AhpF復(fù)合物。關(guān)于多肽生產(chǎn)的其它指導(dǎo)和例子在下文的 IV節(jié)中提供。
IV.多肽生產(chǎn)
多肽可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來生產(chǎn)，包括涉及化學(xué)合成的那些和涉及 從產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞提純的那些。對(duì)多肽進(jìn)行化學(xué)合成的技術(shù)是本 領(lǐng)域公知的。(參見，例如Vincent, Peptide and Protein Drug Delivery, New York, N.Y., Decker, 1990.)用于重組多肽生產(chǎn)和純化的技術(shù)也 是本領(lǐng)域/>知的。(參見，例如，Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002.)
使用重組核酸技術(shù)來產(chǎn)生多肽有利于從細(xì)胞獲得多肽。用于產(chǎn)生 多肽的重組核酸技術(shù)包括在細(xì)胞中導(dǎo)入或產(chǎn)生編碼所述多肽的重組 基因并表達(dá)所述多肽。
重組基因含有編碼多肽的核酸以及用于多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。重 組基因可以存在于細(xì)胞基因組中，或是表達(dá)載體的部分。
可以作為重組基因的部分存在的調(diào)節(jié)元件包括天然與所述多肽編 碼序列相關(guān)的那些，以及天然不與所述多肽編碼序列相關(guān)的外源的調(diào) 節(jié)元件。外源調(diào)節(jié)元件(例如外源啟動(dòng)子)對(duì)于在特定宿主中表達(dá)重 組基因或提高表達(dá)的水平是有用的。 一般地，重組基因中存在的調(diào)節(jié) 元件包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子以及任選地，存在的 操縱子(present operator)。用于真核細(xì)胞中加工的優(yōu)選元件是多腺 苷酸化信號(hào)。
通過使用表達(dá)載體，有利于重組基因在細(xì)胞中的表達(dá)。優(yōu)選地， 除重組基因之外，表達(dá)載體還含有用于在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制 起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、有限數(shù)量的有用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以及高拷貝 數(shù)的可能性。表達(dá)栽體的例子是克隆載體、經(jīng)修飾的克隆載體、專門 設(shè)計(jì)的質(zhì)粒和病毒。由于遺傳密碼的簡并性，大量的不同編碼核酸序列可以用于編碼 特定的多肽。由于幾乎所有的氨基酸由不同的核苷酸三聯(lián)體組合或"密 碼子，，編碼，從而產(chǎn)生了遺傳密碼簡并性。由密碼子編碼的氨基酸如
下
A-Ala-丙氨酸密碼子GCA， GCC, GCG， GCU C-Cys-半胱氨酸密碼子UGC， UGU D-Asp-天冬氨酸密碼子GAC， GAU E-Glu-谷氨酸密碼子GAA， GAG F-Phe-苯丙氨酸密碼子UUC， UUU G-Gly-甘氨酸密碼子GGA， GGC, GGG， GGU H-His-組氨酸密碼子CAC， CAU I-Ile-異亮氨酸密碼子AUA， AUC， AUU K-Lys-賴氨酸密碼子AAA, AAG
L-Leu-亮氨酸密碼子UUA， UUG， CUA， CUC， CUG, CUU M二Met-甲硫氨酸codon AUG N-Asn-天冬酰胺密碼子AAC， AAU P-Pro,氨酸密碼子CCA， CCC， CCG， CCU Q-Gln-谷氨酰胺密碼子CAA， CAG
R-Arg-精氨酸密碼子AGA， AGG， CGA， CGC， CGG， CGU S-Ser-絲氨酸密碼子AGC， AGU， UCA， UCC， UCG， UCU T-Thr-蘇氨酸密碼子ACA， ACC， ACG， ACU V-Va卜纈氨酸密碼子GUA, GUC， GUG， GUU W-Trp-色氨酸codonUGG Y-Tyr-酪氨酸密碼子UAC， UAU
適合用于SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: 3相關(guān)多肽的重組核酸 表達(dá)的細(xì)胞是原核生物和真核生物。原核細(xì)胞的例子包括E. coli; Staphylococcus屬的成員，例如S. aureus; Lactobacillus屬的成員，例 如L. plantarum; Lactococcus屬的成員，例如L. lactis; Bacillus屬的 成員，例如B.subtilis。真核細(xì)胞的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞； 酵母細(xì)胞，例如Saccharomyces屬的成員(例如，S. cerevisiae) 、 Pichia 屬的成員(例如，P. pastoris ) 、 Hansenula屬的成員(例如，H. polymorpha ) 、 Kluyveromyces屬的成員(例如，K. lactis或K. fragilis )和Schizosaccharomyces屬的成員(例如，S. pombe)。
重組基因產(chǎn)生、導(dǎo)入細(xì)胞和重組基因表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知 的。在參考文件中提供了這些技術(shù)的例子，例如Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002和Sambrook et al" Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
如果需要的話，可以通過密碼子優(yōu)化來增強(qiáng)特定宿主中的表達(dá)。 密碼子優(yōu)化包括使用更優(yōu)選的密碼子。在不同宿主中的密碼子優(yōu)化技 術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
多肽可以含有翻譯后修飾，例如，N-連接的糖基化，O-連接的糖 基化，或乙?；?。提到多肽的"多肽"或"氨基酸"序列包括多肽， 其含有來自宿主細(xì)胞(例如酵母宿主)的、 一個(gè)或多個(gè)具有翻譯后修 飾的結(jié)構(gòu)的氨基酸。
翻譯后修飾可以化學(xué)地產(chǎn)生或通過使用適合的宿主產(chǎn)生。例如， 在S. cerevisiae中，倒數(shù)第二個(gè)氨基酸的性質(zhì)看起來決定了 N-末端甲 硫氨酸是否被除去。此外，倒數(shù)第二個(gè)氨基酸的性質(zhì)還決定了 N-末端 氨基酸是否是N、乙?；?Huang et al" Biochemistry 26:8242-8246， 1987)。其它例子包括由于分泌前導(dǎo)區(qū)(例如信號(hào)肽)的存在靶向分 泌的多肽，其中蛋白質(zhì)被N-連接的或O-連接的糖基化修飾。 (Kukumzinskaetal" Ann. Rev. Biochem. 56:915-944， 1987.)
V.佐劑
佐劑是可以在產(chǎn)生免疫反應(yīng)中協(xié)助免疫原的物質(zhì)。佐劑可以通過 不同的機(jī)制起作用，例如以下機(jī)制的一種或多種提高抗原的生物學(xué)
或免疫學(xué)半衰期；改善抗原對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的遞送；改善抗原呈遞細(xì)
胞的抗原加工和呈遞；以及誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。(Vogel， Clinical Infectious Diseases 30 ( suppl. 3) :S266國270， 2000.)
可以采用各種不同種類的佐劑來協(xié)助產(chǎn)生免疫反應(yīng)。特定佐劑的 例子包括氫氧化鋁、磷酸鋁或鋁的其它鹽，磷酸鈣、DNA CpG基序、 單磷?；|(zhì)A、霍亂毒素、E.coli不耐熱腸毒素、白喉毒素、胞壁酰 二肽、Freimd，s不完全佐劑、MF59、 SAF、免疫刺激復(fù)合物、脂質(zhì)體、 生物可降解的微球體、皂角苷、非離子塊共聚物、胞壁酰肽類似物、 聚磷腈(polyphosphazene)、合成的多核苷酸、IFN-y、 IL-2、 IL-12和ISCOMS。
( Vogel Clinical Infectious Diseases 30 ( suppl 3 ) :S266-270， 2000， Klein etal" Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321， 2000， Rimmelzwaan et al" Vaccine 19:1180-1187， 2001 ， Kersten Vaccine 21:915-920， 2003， O，Hagen Curr. Drug Target Infect. Disord.， 1:273-286， 2001.)
VI. 患者
"患者"是指能用S. aureus感染的哺乳動(dòng)物?；颊呖梢员活A(yù)防性 地或治療性地處理。預(yù)防性處理提供了足夠的保護(hù)性免疫來降低S. aureus感染的可能性或嚴(yán)重度。治療性處理可以被進(jìn)行來降低S. aureus感染的嚴(yán)重度。
預(yù)防性治療可以使用含有本文中描述的免疫原的疫苗來進(jìn)行。這 種處理優(yōu)選在人類上進(jìn)行。疫苗可以被施用給普通群體，或處于提高 的S. aureus感染風(fēng)險(xiǎn)下的那些人，
具有提高的S. aureus感染風(fēng)險(xiǎn)的人包括護(hù)理工作者；醫(yī)院患者； 具有減弱的免疫系統(tǒng)的患者；經(jīng)歷手術(shù)的患者；接受異體植入物的患 者，例如導(dǎo)管或脈管設(shè)備；面對(duì)導(dǎo)致減弱的免疫性的治療的患者；和 在具有高風(fēng)險(xiǎn)的灼傷或創(chuàng)傷的職業(yè)中的人。(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer ( ed.) ， Churchill Livingstone Inc. 1997.)
可能被S. aureus感染的非人類患者包括牛、豬、綿羊、山羊、兔、 馬、狗、貓、猴、大鼠和小鼠。對(duì)非人類患者的處理可用于保護(hù)寵物 和家畜，以及評(píng)估特定處理的效力。
VII. 組合疫苗
本文中描述的免疫原可以單獨(dú)使用，或與其它免疫原組合使用， 來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)?？梢源嬖诘钠渌庖咴?一種或多種其它的S. aureus免疫原，例如在上文的發(fā)明背景中引用的那些；靶向一種或多 種其它Staphylococcus生物體(例如S. epidermidis、 S. haemolyticus、 S. warneri或S. lugunensis )的一種或多種免疫原；和乾向其它感染生
物體的一種或多種免疫原。
VIII. 動(dòng)物模型系統(tǒng)
動(dòng)物模型系統(tǒng)被用于評(píng)估免疫原產(chǎn)生針對(duì)S. aureus的保護(hù)性免疫 應(yīng)答的效力。動(dòng)物模型是緩慢的動(dòng)力學(xué)死亡率模型，包括從穩(wěn)定期的細(xì)胞制備的S. aureus,適當(dāng)?shù)氐味?，并且靜脈內(nèi)施用。這種死亡的緩
慢動(dòng)力學(xué)提供了足夠的時(shí)間用于特定免疫防御來排斥細(xì)菌性感染(例 如，10天而不是24小時(shí))。
穩(wěn)定期的S. aureus細(xì)胞可以從培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上的細(xì)胞獲得。 它們也可以從液體獲得，然而固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果更有重 現(xiàn)性。細(xì)胞可以在固體培養(yǎng)基上被方便地培養(yǎng)過夜。例如，S. aureus 可以在倍增時(shí)間為約20-30分鐘的條件下被培養(yǎng)約18到約24小時(shí)。
S. aureus可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離自固體或液體培養(yǎng)基，以維持S. aureus效力。例如，分離的S. aureus可以保存于-701C ，作為在含甘油 的磷酸鹽緩沖鹽水中的經(jīng)洗滌高密度懸浮液(>109集落形成單位 (CFU) /mL)被保存。
S. aureus攻擊(challenge)應(yīng)當(dāng)在自第一天或第二天開始的約7 到IO天期間在動(dòng)物模型中提供約80%到90%死亡的效力，可以使用動(dòng) 物模型進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)來監(jiān)視保存的S. aureus接種物的效力。滴定實(shí)驗(yàn) 可以在接種試驗(yàn)前約一到兩周進(jìn)行。
IX.抗體
含有SEQIDNO: 1相關(guān)多肽和AhpC-AhpF組合物的免疫原可以 用于產(chǎn)生結(jié)合免疫原或S. aureus的結(jié)合蛋白.這種結(jié)合蛋白具有不同 的用途，包括在多肽純化、S. aureus鑒定或在針對(duì)S. aureus感染的預(yù) 防或治療處理中使用。優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白基本上沒有血清蛋白。
結(jié)合蛋白包含第一可變區(qū)和第二可變區(qū)。所述可變區(qū)具有來自重 鏈或輕鏈的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)?？贵w重鏈和輕鏈可變區(qū)含有間插到框架 上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)。互補(bǔ)決定區(qū)對(duì)于識(shí)別特定表位負(fù)有主要責(zé)任。 抗體結(jié)合蛋白的例子包括單鏈抗體、完整抗體、抗體片段和其衍生物。
優(yōu)選的抗原結(jié)合蛋白是單克隆抗體。提到"單克隆抗體"表示具 有相同的、或基本上相同的互補(bǔ)決定區(qū)和結(jié)合特異性的一組抗體。單 克隆抗體中的變異是這樣的變異如果抗體從相同的構(gòu)建體產(chǎn)生其將 會(huì)發(fā)生。
例如，可以從特定的雜交瘤，以及從含有編碼抗體的一種或多種 重組基因的重組細(xì)胞來產(chǎn)生單克隆抗體。抗體可以由超過一個(gè)重組基 因編碼，其中，例如， 一個(gè)基因編碼重鏈， 一個(gè)基因編碼輕鏈。
含有抗體可變區(qū)的抗體片段包括Fv、 Fab和Fab2區(qū)域。每個(gè)Fab區(qū)域含有由可變區(qū)和恒定區(qū)組成的輕鏈以及含有可變區(qū)和恒定區(qū)的重
鏈區(qū)域。輕鏈通過恒定區(qū)由二硫鍵連接到重鏈。Fab區(qū)域的輕鏈和重鏈 可變區(qū)提供了參與抗原結(jié)合的Fv區(qū)域。
抗體可變區(qū)也可以是含有可變區(qū)的蛋白質(zhì)，例如單鏈抗體和微型 抗體(minibody)的一部分。單鏈抗體含有通過接頭連接在一起的輕 鏈和重鏈可變區(qū)。接頭可以是，例如，約5到16個(gè)氨基酸。微型抗體 是單鏈-CH3融合蛋白，其自身組裝成約80kDa的二價(jià)二聚體。
可變區(qū)的特異性由三個(gè)高變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū))決定，它們 插入獄更保守的側(cè)翼區(qū)域(也稱為框架區(qū))之間?？梢匀鏚abatetal.， Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991所述，對(duì)與框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)相
連的氨基酸進(jìn)行編號(hào)和比對(duì)。
產(chǎn)生抗原結(jié)合蛋白(例如單鏈抗體、抗體或抗體片段)的技術(shù)是 本領(lǐng)域公知的。這些技術(shù)的例子包括噬菌體展示技術(shù)的使用、對(duì)嚙齒 動(dòng)物抗體的鑒定和人源化，以及4吏用XenoMouse或Trans-Chromo小 鼠產(chǎn)生人類抗體。 (E.g. ， Azzazy et al. ， Clinical Biochemistry 35:425-445, 2002， Berger et al.， Am. J. Med. Sci. 324( 1 ) :14-40， 2002.)
鼠抗體可以被人源化，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將CDRs移植
到人類抗體框架上。通過將鼠可變區(qū)移植到人類抗體框架上，如果需 要的話，進(jìn)行進(jìn)一步的修飾來人源化鼠抗體，在這些方面對(duì)這些技術(shù) 進(jìn)行了 一般'法描述。(例如O，Brien et al" Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting, p 81-100， From Methods in Molecular Biology Vol 207: Recombinant antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols (Eds. Welschof and Krauss ) Humana Press, Totowa， New Jersey, 2003.)
優(yōu)選使用重組核酸技術(shù)或通過使用雜交瘤來產(chǎn)生抗原結(jié)合蛋白。 重組核酸技術(shù)包括構(gòu)建用于蛋白質(zhì)合成的核酸模板。雜交瘤是產(chǎn)生抗 原結(jié)合蛋白的永生化細(xì)胞系。
編碼抗原結(jié)合蛋白的重組核酸可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述宿主 細(xì)胞實(shí)際上充當(dāng)了編碼的蛋白質(zhì)的工廠。重組核酸可以提供編碼抗原 結(jié)合蛋白的重組基因，其自主存在于宿主細(xì)胞基因組之外，或者是宿 主細(xì)胞基因組的部分。重組基因含有編碼蛋白質(zhì)的核酸以及用于蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)元 件。 一般而言，重組基因中存在的調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、核糖體 結(jié)合位點(diǎn)、終止子以及任選地存在的操縱子。用于在真核細(xì)胞中加工 的優(yōu)選元件是多腺苷酸化信號(hào)。還可以存在抗體相關(guān)的內(nèi)含子。用于
抗體或抗體片段生產(chǎn)的表達(dá)盒的例子是本領(lǐng)域公知的。(例如，Persic et al.， Gene 187:9-18， 1997， Boel et al. ， J. Immunol. Methods 239:153-166， 2000, Liang et al.， J. Immunol. Methods 247:119-130， 2001.)
使用表達(dá)載體有利于重組基因在細(xì)胞中的表達(dá)。優(yōu)選地，除重組 基因之外，表達(dá)載體還含有用于在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、 選擇性標(biāo)記、有限數(shù)量的有用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和高拷貝數(shù)的可能 性。用于抗體和抗體片段生產(chǎn)的表達(dá)栽體的例子是本領(lǐng)域公知的。 (E.g., Persic etal" Gene 187:9-18， 1997, Boel et al" J. Immunol. Methods 239:153-166， 2000， Liang et al. ， J. Immunol. Methods 247:119-130， 2001.)
如果需要的話，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將編碼抗體的核酸整 合進(jìn)宿主染色體中。(參見，Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998， Mark et al., U.S. Patent No. 6,743,622.)
可以使用各種不同的細(xì)胞系用于重組抗原結(jié)合蛋白表達(dá)，包括來 自原核生物的(例如，E. coli、 Bacilli和Streptomyces )以及來自真核 生物(例如，酵母、Baculovirus和哺乳動(dòng)物)的那些。(Breitling et al" Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektmm Akademischer Verlag， 1999，)
用于重組抗原結(jié)合蛋白表達(dá)的優(yōu)選宿主是能產(chǎn)生具有適當(dāng)?shù)姆g 后修飾的抗原結(jié)合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。翻譯后修飾包括二硫鍵形成 和糖基化。另一種類型的翻譯后修飾是信號(hào)肽裂解。
適當(dāng)?shù)奶腔瘜?duì)于抗體功能可能是重要的。(Yooetal" Journal of Immunological Methods 261:1-20， 2002.)天然存在的抗體含有附著于 重鏈的至少一個(gè)N-連接的碳水化合物。(Id.)其它N-連接的碳水化合 物和O-連接的碳水化合物可能存在，并且對(duì)于抗體功能可能是重要 的。(Id.)不同類型的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以用于提供有效的翻譯后修飾。
這種宿主細(xì)胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO) 、 HeLa、 C6、 PC12 和骨髓瘤細(xì)胞。 (Yoo et al,， Journal of Immunological Methods 261:1-20， 2002， Persic etal.， Gene 187:9-18， 1997.)
可以4吏用例如在 Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998， Harlow et al. ， Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988和Kohler et al" Nature256， 495-497， 1975中描述的技術(shù)來產(chǎn)生雜交瘤。
X.施用
使用本文提供的指導(dǎo)以及本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可以配制免疫原和 結(jié)合蛋白并施用給患者。 一般的藥物施用原則在例如Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein， W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences 20thEdition, Ed. Gennaro， Mack Publishing, 2000;和Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker， Inc., 1990中提供，通過引用將每一份并入本文。
藥學(xué)上可接受的載體有利于免疫原的保存和向患者的施用.藥學(xué) 上可接受的載體可以含有不同的組分，例如緩沖液、滅菌注射水、生 理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水、蔗糖、組氨酸、鹽和聚山梨酸酯。
免疫原和結(jié)合蛋白可以通過不同的途徑，例如皮下的、肌肉內(nèi)的 或粘膜的途徑來施用。皮下的和肌肉內(nèi)的施用可以使用例如針頭或噴 射注射器來進(jìn)行。
考慮本領(lǐng)域公知的因素，包括患者的年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)狀 況；給藥途徑；期望的效果；和采用的特定化合物，優(yōu)選地確定合適 的給藥方式。免疫原或結(jié)合蛋白可以以多劑量形式使用。預(yù)期的是， 劑量將由1.0嗎到l.Omg總多肽的范圍組成，在本發(fā)明不同的實(shí)施方 式中，所述范圍是0.01 mg到1.0 mg和0.1 mg到1.0 mg。
給藥的時(shí)機(jī)取決于本領(lǐng)域公知的因素。在初次施用之后，可以隨 后施用一次或多次強(qiáng)化劑量來維持或強(qiáng)化抗體滴度。給藥方式的例子 將是第1天、第1個(gè)月、在第4、 6或U個(gè)月的第三次給藥，以及以 所需的時(shí)間間隔進(jìn)行的其它強(qiáng)化.實(shí)施例
下面提供實(shí)施例，以進(jìn)一步闡述本發(fā)明的不同特征。這些實(shí)施例 還闡述了實(shí)踐本發(fā)明的有用的方法。這些實(shí)施例不對(duì)要求保護(hù)的發(fā)明 加以限制。
實(shí)施例1:保護(hù)性免疫
這個(gè)實(shí)施例闡述了 SEQ ID NO: 1相關(guān)多肽在動(dòng)物模型中提供保 護(hù)性免疫的能力。SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: l的His標(biāo)記的衍生 物，被用于提供保護(hù)性免疫。
SEQ ID NO: 2克隆和表達(dá)
由COL SA0452編碼的蛋白質(zhì)被設(shè)計(jì)為從pET16b載體(EMD Biosciences, Madison, WI)表達(dá)，該栽體具有N-末端組氨酸殘基和 由載體編碼的終止密碼子。還由該載體編碼的是組氨酸t(yī)ag后的九個(gè)另 外的氨基酸，和在羧基末端的三個(gè)另外的氨基酸。設(shè)計(jì)PCR引物來擴(kuò) 增COLSA0452，從第一個(gè)絲氨酸密碼子開始，在末端異亮氨酸殘基處 的終止密碼子之前結(jié)束.正向和反向引物分別是 5，GGGAATTC￡A1A1GTCATTAATTAACAAAGAAATCTTACC3，
( SEQ ID NO : 7 ) 和
5，GGG￡1￡AG￡GATTTTACCTACTAAATCTAAACCAG3， ( SEQ ID NO: 11)，含有其它的限制性位點(diǎn)(下劃線的)，即NdeI(正向引物) 和Bpul10211 (反向引物)和GC夾(clamp)以有利于向表達(dá)載體中 克隆。
從S. aureus COL菌林MB5393純化基因組DNA并將其用作為 PCR的模板。在DifcoTryptic Soy Broth (Becton Dickinson, Sparks, MD)中在37TC對(duì)50 mL培養(yǎng)物培養(yǎng)過夜，通過離心收集細(xì)胞。在5 mL 10 mM Tris pH 7.5、 25°/ 蔗糖中洗滌細(xì)胞一次，重懸浮于含50 pg/mL 溶葡萄菌素(Sigma, St. Louis， MO)的相同溶液中。在371C孵育混 合物1小時(shí)，隨后添加2.5 mL 0.25 MEDTApH 8.0。在冰上孵育15分 鐘之后，添加7.5 mL 2% sarkosyl，輕輕地渦旋(swirl)混合物，并令 其在冰上再保持30分鐘。添加0.1 M醋酸鈉中5 mg/mL的l50 |uL RNAse，混合物在37X:孵育一'J、時(shí)。然后，添加25 mg/mL的0.6 mL 蛋白酶K，繼續(xù)孵育2小時(shí)，繼之以在41C孵育過夜。通過在室溫下輕 輕旋轉(zhuǎn)30.分鐘，用15mL水飽和的苯酚來提取溶胞產(chǎn)物。為了分相，在室溫下在4，000rpm對(duì)混合物離心10分鐘。收集水 相，苯盼提取重復(fù)兩次或更多次。然后，用等體積的氯仿提取水相10 次。在最后的提取之后，收集水相，測(cè)量體積，添加一半體積的7.5M 乙酸銨。
通過添加兩倍體積的100%乙醇來沉淀DNA，通過用玻璃棒巻繞 來收集。將DNA溶于含有4 ^L焦碳酸二乙酯的5.0 mLTE中，在4 "C過夜。乙醇沉淀重復(fù)兩次或更多次。
在以一式兩份制備的50 ^L體積反應(yīng)物中通過PCR擴(kuò)增ahpC基 因。每體系含有250 ng基因組DNA、 125 ng每種正向和反向引物、1 微升10 mM dNTPs、 2.5單位天然Pfu聚合酶和IX Pfu緩沖液 (Stratagene， LaJollaCA)。熱循環(huán)條件如下941C 5分鐘的一個(gè)循 環(huán)；94TC 45秒、56*C 45秒、72*C l分鐘的30個(gè)循環(huán)；721C 10分鐘 的一個(gè)循環(huán)。用合適的限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA序列(584 bp)， 按廠商說明書使用Gene Clean II ( QBIOgene， Carlsbad, CA)進(jìn)行 凝膠純化。使用已經(jīng)工程化到PCR引物中的Ndel/Bpu11021位點(diǎn)將 DNA連接進(jìn)pET16b載體，并導(dǎo)入E. coli NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞(EMD Biosciences)。
轉(zhuǎn)化混合物在37"在低鹽Lennox L Broth瓊脂平板上被培養(yǎng)過 夜，所述瓊脂平板含有各IOO pg/mL的氨節(jié)青霉素、IPTG和X-gal, 才艮據(jù)廠家的i兌明書4吏用imMediaTM Amp Agar (Invitrogen， Carlsbad, CA )制備。選擇克隆，在具有50 |ng/mL氨節(jié)青霉素的Luria Broth( LB) 中對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生DNA微制備物(miniprep) (Promega)，通 過限制性內(nèi)切酶消化來確定合適的插入物。對(duì)來自兩份微制備物的質(zhì) 粒DNA進(jìn)行測(cè)序，選擇不含有對(duì)期望序列的DNA改變的克隆，并命 名為pAhpC5。
用pAhpC5轉(zhuǎn)化E. coli BLR ( DE3 )感受態(tài)細(xì)胞(EMD Biosciences)，并在含有氨節(jié)青霉素(100|ng/mL)的LB平板上生長。 為了測(cè)試ahpC的表達(dá)，將分離的菌落接種到5 mL液體LB (氨芐青 霉素)中，在37匸、220rpm孵育6小時(shí)。培養(yǎng)物在4TC保持過夜，次 日接種到20.0 mL LB肉湯(氨芐青霉素)中，使得起始OD600等于 0.02。培養(yǎng)物在37t:、 220rpm孵育四小時(shí)到OD600=0.8。在三種不同 溫度下比較表達(dá)的誘導(dǎo)。將45微升100 mM IPTG添加到三個(gè)4.5 mL培養(yǎng)物體積中(IPTG終濃度lmM)，并在37TC孵育3小時(shí)，25TC或 181C 24小時(shí)，所有的都在220rpm搖動(dòng)。對(duì)于溶胞產(chǎn)物制備，通過離 心收集來自未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的分別的1.5 mL和1.0 mL培養(yǎng)物 體積，并重懸浮于300 mL BugBuster HT ( EMD Sciences)和3 mL Proteinase Inhibitor Cocktail ( Sigma， St. Louis, MO)中?；旌衔镌?冰上保持5分鐘，隨后超聲三次10秒，中間每次進(jìn)行冷卻。為了獲得 "可溶的"和"不可溶的"部分，混合物在4TC在14,000 rpm離心五 分鐘'上清液被稱為"可溶的"，將團(tuán)粒重懸浮在300 mL BugBuster HT 和3 mL Proteinase Inhibitor Cocktail中，并稱為"不可溶的"。通過 BIO-RAD Protein Assay Dye Reagent系統(tǒng)(BIO-RAD， Hercules, CA ),
根據(jù)廠家的說明書測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
為了通過SDS-PAGE凝膠的Coomassie染色分析ahpC(由SEQ ID NO: 3編碼)的表達(dá)，在還原和變性條件下，在1 x Tris甘氨酸SDS 緩沖液(BIO-RAD)中，在4-15%梯度Tris-HCl Criterion凝膠劑
(BIO-RAD)上，對(duì)樣品進(jìn)行電泳。為了估計(jì)蛋白質(zhì)大小，將15和 250 kDa之間的標(biāo)準(zhǔn)物(BIO-RAD)與溶胞產(chǎn)物平行地運(yùn)行(run)。 根據(jù)廠家的方案用Bio陽Safe Coomassie--Coomassie G250染料
(BIO-RAD)來對(duì)凝膠染色。
在從所有三種溫度誘導(dǎo)的樣品制備的溶胞產(chǎn)物中都特異性地檢測(cè) 到了 24 kDa蛋白質(zhì)。在所有三種溫度下獲得了良好的表達(dá)，ahpC定 位到可溶和不可溶的級(jí)分中。25TC的誘導(dǎo)是產(chǎn)生可溶ahpC的最適溫 度。
SEQ ID NO: 2純化
實(shí)現(xiàn)了下述目的將上述小規(guī)模步驟直接擴(kuò)大到20升工作體積的 攪拌罐發(fā)酵器(30升規(guī)模)。在含有50 mL Luria-Bertani (LB)培養(yǎng) 基(加氨芐青霉素)的250 mL燒瓶中培養(yǎng)接種物，用lmL冷凍的種 子培養(yǎng)物接種，并培養(yǎng)6小時(shí)。1 mL這種種子被用于接種含有500 mL LB培養(yǎng)基(加氨芐青霉素)的2升燒瓶，并孵育16小時(shí)。用20升LB 培養(yǎng)基(加氨節(jié)青霉素)培養(yǎng)大規(guī)模發(fā)酵器升規(guī)模)。發(fā)酵器的 發(fā)酵參數(shù)是壓力-5psig，攪動(dòng)速度-300rpms、氣流=7.5升/分鐘和溫 度=3710 。將細(xì)胞孵育到600 nm波長處1.3光密度單位的光密度(OD )， 用異丙基-(3-K-硫代半乳糖苷(IPTG)以1 mM的濃度誘導(dǎo)。IPTG誘導(dǎo)時(shí)間是兩小時(shí)。通過將溫度降低到151C來收獲細(xì)胞，通過穿過 500KMWCO空心纖維盒來濃縮，以8,000倍重力在41C離心20分鐘來 離心。輕輕倒出上清液，將重組E. coli濕細(xì)胞團(tuán)粒在-70"C冷凍。
將冷凍的重組E. coli細(xì)胞糊(24克)解凍，并重懸浮于兩體積的 裂解緩沖液(50 mM磷酸鈉、pH8.0、 0.15 M NaCl、 2 mM氯化鎂、 10mM咪唑、20mM2-巰基乙醇、0.1% Tween-80和蛋白酶抑制物混 合物(Complete ,無EDTA， Roche #_1873580—每50 mL裂解緩沖 液一片)中。Benzonase (EM #_1.01697.0002 )以125單位/mL添加到 細(xì)胞懸液中)。用微流化劑制備溶胞產(chǎn)物。在41C對(duì)溶胞產(chǎn)物攪拌三小 時(shí)，通過在4TC在10，000 xg離心10分鐘來澄清。上清液濾經(jīng)玻璃-纖 維預(yù)過濾微孔，從5 M j^備溶液將NaCl添加到0.5 M的終濃度。過濾 的上清液被上樣到Ni-NTA瓊脂糖層析樹脂(Qiagen #_30250)，漿液 在4"C混合過夜。將層析樹脂的漿液注入層析柱，通過重力從柱出口收 集未結(jié)合的級(jí)分。用IO倍柱體積的洗滌緩沖液(50 mM磷酸鈉、pH 8.0、 0.5MNaCI、 2 mM氯化鎂、lOmM咪唑、20mM2-巰基乙醇、 0.1。/o Tween-80和蛋白酶抑制物混合物(CompleteTM，無EDTA， Roche #_1873580—每50 mL洗滌緩沖液一片)對(duì)柱進(jìn)行洗滌。用洗脫緩沖液 (50 mM磷酸鈉(pH 7.4) 、 0.3 M咪唑、2 mM氯化鎂、0.1% Tween-80 和20 mM 2-巰基乙醇)對(duì)柱進(jìn)行洗脫。通過在用Ponceau-S染色的硝
化纖維膜上點(diǎn)滴印跡來鑒定含有蛋白質(zhì)的級(jí)分，將含有最高蛋白質(zhì)濃 度的級(jí)分合并來產(chǎn)生Ni-IMAC產(chǎn)物。Ni-IMAC產(chǎn)物通過SEC分餾。 通過Coomassie染色的SDS/PAGE來鑒定含有產(chǎn)物蛋白質(zhì)的SEC級(jí) 分。合并含有產(chǎn)物的SEC級(jí)分來產(chǎn)生SEC產(chǎn)物。將SEC產(chǎn)物無菌過 濾，以0.2 mg/mL的終濃度吸附在氬氧化磷酸鋁佐劑上。 S. aureus攻擊的制備
S. aureus在37TC在TSA平板上培養(yǎng)過夜。通過添加5 mL PBS到 平板上來從TSA平板洗下細(xì)菌，用無菌的涂布器(spreader)輕輕地 重懸浮細(xì)菌。使用Sorvall RC-5B離心機(jī)(DuPont Instruments)將細(xì) 菌懸浮液在6000 rpm旋轉(zhuǎn)20分鐘。團(tuán)粒在16%甘油中重懸浮，分為 小份在-70lC冷凍保存。
使用之前，將接種物解凍，適當(dāng)?shù)叵♂尣⒂糜诟腥?。每個(gè)原種滴 定至少3次來確定在天然小鼠中誘導(dǎo)緩慢的死亡動(dòng)力學(xué)的合適的劑量。時(shí)常地監(jiān)視細(xì)菌接種物的效力(80到90%死亡率)來確保模型的 重現(xiàn)性。每個(gè)攻擊實(shí)驗(yàn)前十天， 一組10只對(duì)照動(dòng)物(用單獨(dú)的佐劑免 疫的)被攻擊和監(jiān)視。
對(duì)SEQIDNO: 2多肽的保護(hù)研究
在兩項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，二十只BALB/c小鼠中每只用氫氧化磷酸鋁佐 劑(450 |ug每次注射))上的SEQ ID NO: 2多肽(20 每次注射) 三次劑量來免疫，20只小鼠每只用氫氧化磷酸鋁佐劑(450)Lig每次注 射)免疫。氫氧化磷酸鋁佐劑(AHP)由Klein et al.， Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321， 2000描述。在第0、 7和21天以 兩處50itiL肌肉注射來施用材料，在笫28天使小鼠出血，通過ELISA 篩選它們的血清對(duì)SEQIDNO: 2的反應(yīng)性。
在每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的第35天，通過S. aureus的靜脈內(nèi)注射(劑量7 x 108 CFU/mL)來攻擊小鼠。在11天中監(jiān)視小鼠的存活率。在第一項(xiàng)實(shí)驗(yàn) 結(jié)束時(shí)，在SEQIDNO: 2多肽免疫的組中12只小鼠存活，相比之下， AHP對(duì)照組中5只存活。結(jié)果在附圖6A中闡示。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束 時(shí)，在SEQIDNO: 2多肽免疫的組中11只小鼠存活，相比之下，AHP 對(duì)照組中7只存活。結(jié)果在附圖6B中闡示。
其它實(shí)施方式也在以下的權(quán)利要求之內(nèi)。盡管已經(jīng)展示和描述了 幾個(gè)實(shí)施例，但是可以對(duì)此進(jìn)行各種修改和替換而不背離本發(fā)明的精 神和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種多肽免疫原，其包含與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的片段至少85％相同的氨基酸序列，其中所述多肽提供了針對(duì)S.aureus的保護(hù)性免疫，并且其中所述多肽免疫原不是SEQ ID NO1的多肽。
2. 權(quán)利要求l的多肽，其中所迷氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1 的氨基酸178-189。
3. 權(quán)利要求2的多肽，其中所述氨基酸序列至少95Y。相同于SEQ ID NO: 1。
4. 權(quán)利要求3的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸 22-213組成。
5. 權(quán)利要求3的多肽，其中所迷多肽是基本上純化的。
6. —種免疫原，其包含至少85。/o相同于SEQIDNO: 1的氨基酸 序列，和在羧基末端或氨基末端與所述氨基酸序列共價(jià)連接的一個(gè)或 多個(gè)其它區(qū)域或部分，其中每個(gè)區(qū)域或部分獨(dú)立地選自具有至少一種 以下性質(zhì)的區(qū)域或部分增強(qiáng)免疫應(yīng)答，有利于純化或有利于多肽穩(wěn) 定性。
7. —種純化的免疫原，其包含至少85%相同于SEQIDNO: l的 多肽和至少85%相同于SEQIDNO: 3的多肽。
8. —種能在患者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的組合物，其包含免疫有 效量的權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的免疫原和藥學(xué)上可接受的載體。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含佐劑。
10. —種包含重組基因的核酸，所述重組基因包含編碼權(quán)利要求 1-5的任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
11. 權(quán)利要求10的核酸，其中所述核酸是表達(dá)載體。
12. —種包含重組基因的重組細(xì)胞，所述重組基因包含編碼權(quán)利要 求1-5的任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
13. —種產(chǎn)生提供保護(hù)性免疫的& fl""MS多肽的方法，包括步驟(a) 在其中所述多肽被表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的重組細(xì) 胞；以及(b) 純化所述多肽。
14. 一種分離的結(jié)合蛋白，包含與權(quán)利要求7的免疫原結(jié)合的可變區(qū)。
15. 權(quán)利要求14的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白由包括以下步驟 的方法產(chǎn)生(a) (1)使用所述免疫原來選擇所述結(jié)合蛋白；或(a) (2) 使用所述免疫原來誘導(dǎo)所述結(jié)合蛋白的產(chǎn)生；以及(b) 基本上純化所述抗原結(jié)合蛋白。
16. 權(quán)利要求15的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白是抗體，或包含 抗體片段。
17. —種針對(duì)S. fl"reiw感染治療患者的方法，包括向所述患者施 用一種或多種以下物質(zhì)的步驟(a) 免疫有效量的免疫原，包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的片段至少85%相同的氨基酸序列，其中所述多肽提供了針對(duì)& ""/ eiw的保護(hù)性免疫(b) 免疫有效量的權(quán)利要求l-7的任一項(xiàng)的免疫原；或(c) 有效量的權(quán)利要求14的結(jié)合蛋白。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所迷患者是人類。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中針對(duì)&"MW"s感染對(duì)所述患者進(jìn)行 預(yù)防性治療。
20，權(quán)利要求18的方法，其中所述免疫原是權(quán)利要求1-7的任一 項(xiàng)的免疫原。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含與SEQ ID NO1結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸序列的多肽或其片段、S.aureus AhpC-AhpF組合物，以及此類多肽和組合物的用途。SEQ ID NO1具有全長S.aureus AhpC序列。含有氨基His-tag和三個(gè)額外羧基氨基酸的SEQ ID NO1的衍生物被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生針對(duì)S.aureus的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101432017SQ200680002556
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月21日
發(fā)明者L·D·舒爾茨, M·A·米勒, M·D·耶格, R·凱利, T·麥克尼利 申請(qǐng)人:默克公司