溶液，錫紙避光保存，即配即用。
[0134] (2)扣PPH·]法測(cè)定生物活性膚的抗氧化活性 陽135] 在1. 5血EP管中加入500μL濃度為0.Immol/L扣PPH·]甲醇溶液、按表2分別 加入500μL不同濃度的待測(cè)樣品和去離子水作為空白對(duì)照。
[0136] 待檢測(cè)樣品加樣完畢后，混合均勻，室溫靜置30min后取200微升至96孔板中，用 酶標(biāo)儀在517nm處檢測(cè)吸光值。按照下式計(jì)算自由基清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。 陽137] 公式：扣PPH·]自由基清除率=(A〇-As)/A〇X100%
[0138] 其中A。表示空白對(duì)照組的吸光值，Ag表示樣品組的吸光值。
[0139] 表2DPPH法測(cè)定生物活性多膚的總抗氧化能力結(jié)果
[0140]
陽141] 通過郵PH·]法對(duì)生物活性多膚NQFYQKF體外總抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其 具有清除自由基能力，具體ICwmg/mU值見表2。根據(jù)相關(guān)抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)定發(fā)明的 生物活性多膚GTQYTD具有較好的抗氧化能力。
[0142] 2、ABTS法測(cè)定生物活性膚的體外抗氧化活性 陽143] 1)實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
[0144] 試劑：總抗氧化力試劑盒（ABTS法），碧云天公司生產(chǎn)；甲醇，上海國藥公司提供； 合成實(shí)施例1中得到的乳源性生物活性多膚。
[0145] 主要儀器：Pro200酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司產(chǎn)品；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國 Millipore公司制造。 陽146]。實(shí)驗(yàn)方法
[0147] (l)ABTS工作液的配置
[0148] 取40微升ABTS溶液與40微升氧化劑溶液配制成ABTS工作母液，配制后避光存 放12-16小時(shí)后使用，配好的ABTS工作母液在室溫下避光存放，2-3天內(nèi)穩(wěn)定。使用前，把 ABTS工作母液用PBS稀釋成ABTS工作液，大約40倍，要求ABTS工作液的吸光度減去相應(yīng) 的PBS空白對(duì)照后，A734為0. 7 + 0. 05。
[0149] 似Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 陽150] 用樣品配制溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，把lOmMTrolox標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0. 005、0. 01、0. 03、 0. 05、0. 1、0. 25、0. 5和1.OmM。在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入200微升ABTS工作液，標(biāo)準(zhǔn) 曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10微升各種濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，輕輕混勻。室溫解育4分鐘后，用 酶標(biāo)儀在734nm處測(cè)定吸光值。 陽151]Trolox濃度與吸光值呈良好的正比關(guān)系，濃度越高，吸光值越低。本發(fā)明Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖6,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9995，Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的精 密度和準(zhǔn)確度均符合檢測(cè)要求，可用于后續(xù)計(jì)算。
[0152] (3) ABTS法測(cè)定生物活性膚的抗氧化活性 陽15引在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入200微升ABTS工作液，空白對(duì)照孔中加入10微升PBS溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10微升各種樣品，輕輕混勻。室溫解育4分鐘后，用酶標(biāo)儀在 734nm處測(cè)定吸光值。測(cè)定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力?？偪寡趸芰Ρ硎?方式WTrolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。按照下式計(jì)算總抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3: 陽154]
[0K5]表3ABTS法測(cè)定生物活性多膚的總抗氧化能力結(jié)果 陽156]
陽157]通過總抗氧化能力法（ABTS法）對(duì)生物活性多膚GTQYTD體外總抗氧化活性進(jìn)行 了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)生物活性多膚GTQYTD具有抗氧化能力：在多膚濃度為Img/mL情況下，其所對(duì) 應(yīng)的Trolox濃度為0. 7751mmol/L。因此，可認(rèn)定發(fā)明的生物活性多膚GTQYTD具有較好的 抗氧化能力。
[0158] W上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及 其功效，而并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可W做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，運(yùn)些改進(jìn)和補(bǔ)充也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情 況下，當(dāng)可利用W上所掲示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本 發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的 更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的生物活性多肽GTQYTD，其包括 (a) 由SEQIDNO:1所示的氨基酸組成的多肽； (b) 或在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且 具有同等活性的由（a)衍生的多肽。2. 編碼權(quán)利要求1所述生物活性多肽GTQYTD的核苷酸片段。3. 權(quán)利要求1所述生物活性多肽的制備方法，包括如下步驟： 1) 發(fā)酵：將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳； 2) 破壁：對(duì)發(fā)酵乳離心后得到的菌體進(jìn)行超聲，破碎菌壁使胞內(nèi)肽游離，獲得菌肽混 合液； 3) 多肽的粗提：對(duì)步驟2)中的菌肽混合液的進(jìn)行低溫離心分離，取上清液； 4) 多肽的純化： a.對(duì)步驟3)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液； b.固相萃取柱分離：收集的濾液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集生物 活性多肽混合物； 5) 多肽的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟4)的生物活性多肽混合物，獲得生 物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵 溫度36~38°C，發(fā)酵時(shí)間6~8h。5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述離心條件為20°C，4000~ 5000rpm，離心15min.;步驟2)所述破壁條件為菌體濃度0. 0238g/ml，破碎功率300W，破碎 總時(shí)間26min。6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述低溫離心的條件為： 4°C，8000 ~lOOOOrpm，離心 15 ~30min。7. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3)a所述超濾處理所采用的是截留 分子量分別為3kDa的超濾管；所述超濾處理過程中，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時(shí)間為30min，離心 溫度為4°C。8. 權(quán)利要求1所述生物活性多肽GTQYTD或所述生物活性多肽的衍生物在制備抗氧化 和/或增強(qiáng)機(jī)體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。9. 一種抗氧化藥物，包含如權(quán)利要求1所述生物活性多肽GTQYTD或所述生物活性多肽 的衍生物。10. -種增強(qiáng)機(jī)體免疫力藥物，包含如權(quán)利要求1所述生物活性多肽GTQYTD或所述生 物活性多肽的衍生物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種來源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽GTQYTD。本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的生物活性多肽具有抗氧化生物學(xué)活性和促進(jìn)細(xì)胞免疫的活性；研究結(jié)果表明本發(fā)明的這種乳源性生物活性肽作為一類小分子物質(zhì)具有潛在的延緩衰老的功能。另外，模擬消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)的這條生物活性多肽在通常的動(dòng)物體內(nèi)消化條件下穩(wěn)定存在，不會(huì)被進(jìn)一步降解，能夠被動(dòng)物機(jī)體直接吸收利用發(fā)揮其具有的生物活性功能，對(duì)開發(fā)具有抗氧化功能、增強(qiáng)免疫功能及延緩衰老的乳制品、保健品及藥物具有十分重要的意義。
【IPC分類】A61P39/06, C12P21/06, C12N15/12, A23L33/18, A61K38/17, A23L33/00, C07K14/47, C12R1/225, C12P21/02, A61P37/04
【公開號(hào)】CN105254739
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510672549
【發(fā)明人】張少輝, 高揚(yáng), 胡亞菁, 錢蕙佶, 程志才, 沈鵬, 盧飛, 李婉如
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日