一種鑒定牦牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒定牦牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]肉是我們?nèi)祟悆?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種營(yíng)養(yǎng)素的主要來(lái)源，含有豐富的必須氨基酸和多種微量元素。近年來(lái)，肉的摻假和欺詐行為越來(lái)越受到人們的關(guān)注。在“馬肉風(fēng)波”事件之前，國(guó)內(nèi)早已爆出應(yīng)用化學(xué)藥物處理的“假魚(yú)翅”、以及牛肉膏處理的豬肉或鴨肉冒充牛肉等事件。這不僅涉及到食品摻假欺詐的商業(yè)行為而且涉及到民族和宗教信仰問(wèn)題。因此，基于經(jīng)濟(jì)和宗教方面的考慮，肉的物種鑒定具有非常重要的意義。另一方面，對(duì)加工食品而言，物種的原始可識(shí)別形態(tài)特征消失，使得物種的鑒別變得相對(duì)困難。目前關(guān)于肉的物種鑒定方法有:感官分析，解剖和組織學(xué)鑒定，顯微技術(shù)，化學(xué)方法，電泳法，色譜法以及免疫學(xué)技術(shù)等方法。但是，因加工后的肉品大多已改變其原始形態(tài)，采用這些方法通常不能做出正確判斷。目前迫切需要一些更靈敏和可靠的檢測(cè)方法來(lái)鑒定動(dòng)物食品或動(dòng)物源性加工食品的物種來(lái)源。
[0003]正是在這樣的背景下，發(fā)展了各種基于DNA的分子鑒定技術(shù)，如，PCR、PCR-RFLP,Real-time PCR、DNA條形碼技術(shù)等。盡管目前的分子技術(shù)已經(jīng)用于許多肉的物種鑒定，如豬肉，鴨肉，雞肉，鵝肉，牛肉，鹿肉，魚(yú)肉等。
[0004]牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及紙鄰地區(qū)生活的獨(dú)特畜種，是我國(guó)的主要牛種之一，目前的牦?？倲?shù)量大約為I千4百萬(wàn)頭，這些牦牛為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┘s90%的奶和50%的肉，是西部藏區(qū)經(jīng)濟(jì)支柱，也是西部藏區(qū)少數(shù)民族的主要生產(chǎn)生活資料。牦牛肉質(zhì)鮮美，品質(zhì)優(yōu)良，蛋白質(zhì)含量高，礦物質(zhì)豐富，脂肪少，且脂肪中胡蘿卜素含量豐富，是廣受消費(fèi)者青睞的天然綠色食品。但是，基于牦牛肉的稀少和人們需求的增多，牦牛肉的價(jià)格也變得相對(duì)昂貴，這樣一來(lái)，為了經(jīng)濟(jì)利益，不法商販利用其它肉類加工后充當(dāng)牦牛肉在市場(chǎng)上進(jìn)行銷售，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的權(quán)益，也帶來(lái)了諸多的食品安全隱患。如何進(jìn)行牦牛肉的真?zhèn)舞b定顯得非常重要。目前，關(guān)于牦牛肉真?zhèn)舞b定技術(shù)方面的研究報(bào)道還不多，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)也只有寥寥幾篇，大多數(shù)采用的是PCR-RFLP方法，因此，還需要不斷開(kāi)發(fā)新的更加快速的方法。
[0005]基于以上的分析和目前迫切的需求，本發(fā)明采用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行牦牛肉物種的真?zhèn)舞b定，開(kāi)發(fā)了一種快速鑒定牦牛肉真?zhèn)蔚募夹g(shù)。為目前市場(chǎng)上售賣的牦牛肉及其制品的監(jiān)督提供急需的技術(shù)支持，也為消費(fèi)者的利益提供技術(shù)保障，將具有良好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺乏和不足，本發(fā)明的目的是提供一種能鑒定出牦牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段是: 一種能快速鑒定出牦牛肉真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法，
步驟一、DNA提取:將新鮮的動(dòng)物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細(xì)粉；取0.6g細(xì)粉于2ml的EP管中，加入TE緩沖液共480μ?，放入 68°C水浴 10 min，加入 53μ? 的 10% SDS, ΙΟμ? 的 10mg/mL 的蛋白酶 K，68°C水浴15 min，取出后加入 87μ? 的 5 mol/L NaCl，以及 70μ? 的 CTAB/NaCl，68°C水浴 15min，_20°C放置30 min，取出加入等體積的24:1的氯仿/異戊醇混勾，離心取上清；重復(fù)上述步驟一次；最后用2倍體積的冰的無(wú)水乙醇混勻，-20°C靜置30 min，離心去上清，沉淀用70%的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50 PL雙蒸水中，使用超微量核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀，將DNA濃度稀釋至lOOng/^L左右作為模板。
[0008]步驟二、PCR=PCR擴(kuò)增采用20 μ?的體系，DNA模板I μ?，不含Mg2+的10XPCR緩沖液 2 μ?，濃度為 25 mmol/L 的 MgCl2L 6 μ?，濃度為 2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μ?，牦牛肉特征引物Yak-F和Yak-B的10Mmol/L混合物1PL，5U/^L的Taq DNA聚合酶0.2 μ?，加超純水補(bǔ)充至20 μ? ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性40 s，60°C退火50 s，72°C延伸40 s;35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0009]步驟三、電泳檢測(cè):取10 μ? PCR產(chǎn)物與WL的6 X Loading buffer (上樣緩沖液)混合，1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，120V條件下電泳40min，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0010]步驟四、結(jié)果鑒定:觀察電泳結(jié)果，牦牛肉的擴(kuò)增片段大小為1003bp，如有上述大小的片段，則認(rèn)為結(jié)果為陽(yáng)性，樣品是牦牛肉；如無(wú)上述大小片段，則認(rèn)為是陰性，樣品不是牦牛肉。
[0011]進(jìn)一步，所述步驟一中TE 緩沖液為 10 mmol/T, Tris.Cl，I mmol/L EDTA，pH 8.0 ；CTAB/NaCl 為 1% CTAB，0.73 moL/L NaCl0
[0012]進(jìn)一步，所述步驟二中牦牛肉特征引物10 Mmol/L混合物，上游序列為:Yak_F_5’-GACCTTCCAGCTCCATCAAACAITTCATCATGG-3’ ；下游序列為:Yak-B_5’ -CTAGTTGTCCAATGATAATGTATG-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為 1003bp。
[0013]進(jìn)一步，所述步驟三中的1.0%的瓊脂糖凝膠中添加有?μ?的Goldview核酸染料。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物只是針對(duì)牦牛物種的細(xì)胞色素b基因序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，其它哺乳動(dòng)物不能擴(kuò)增出來(lái)，并且采用普通PCR即可進(jìn)行牦牛肉的鑒定，不需要進(jìn)行酶切和測(cè)序。本發(fā)明操作方便，檢測(cè)時(shí)間短，具有很好的應(yīng)用前景，滿足于市場(chǎng)監(jiān)督檢測(cè)。
[0015]【具體實(shí)施方式】I
為了便于直觀理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在四川紅原縣采集新鮮牦牛樣品9份，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0016]1、DNA 提取
將新鮮的動(dòng)物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細(xì)粉；取0.6g細(xì)粉于2ml的EP管中，加入TE緩沖液共480μ?，放入68°C水浴10 min，加入53μ?的10% SDS，10μ?的10mg/mL的蛋白酶K，68°C水浴15 min，取出后加入 87μ? 的 5 mol/L NaCl,以及 70μ? 的 CTAB/NaCl，68°C水浴 15min，-20°C放置 30 min，取出加入等體積的24:1的氯仿/異戊醇混勻，離心取上清；重復(fù)上述步驟一次；最后用2倍體積的冰的無(wú)水乙醇混勻，_20°C靜置30 min，離心去上清，沉淀用70%的乙醇洗滌，干燥，沉淀溶于50μ?雙蒸水中，使用超微量核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀，將DNA濃度稀釋至10ng/μ L左右作為模板。
[0017]2、PCR
PCR擴(kuò)增采用20 μ L的體系，DNA模板I μ?，不含Mg2+的10XPCR緩沖液2 μ?,濃度為25 mmol/L的MgCl2L 6 μ?，濃度為2.5mmol/L dNTPs 1.2 μ?，牦牛肉特征引物Yak-F和Yak-B的10 Mmol/L混合物?μ?，5U/^L的Taq DNA聚合酶0.2 μ?，加超純水補(bǔ)充至20 μ? ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s，60°C退火50s，72°C延伸40s;35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8min;4°C保存。
[0018]3、電泳檢測(cè)
取10 μ? PCR產(chǎn)物與WL的6XLoading buffer (上樣緩沖液)混合，1.0 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，120V條件下電泳40min，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0019]4、結(jié)果鑒定
觀察電泳結(jié)果，上述9份牦牛肉的擴(kuò)增片段大小都為1003bp，結(jié)果為陽(yáng)性，9份樣品證實(shí)都是牦牛肉，結(jié)果見(jiàn)附圖1。
[0020]【具體實(shí)施方式】2
為了便于直觀理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在市場(chǎng)上采集新鮮牛肉，雞肉，豬肉，鴨肉，兔肉，羊肉和牦牛肉按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0021]1、DNA 提取
將新鮮的動(dòng)物肌肉組織取下一小塊，切碎后放入研缽中加入液氮，快速將組織在液氮中搗碎并研磨成細(xì)粉；取0.6g細(xì)粉于2ml的EP管中，加入TE緩沖液共480μ?，放入68°C水浴10 min，加入53μ?的10% SDS，ΙΟμ?的10mg/mL的蛋白酶K，68°C水浴15 min，取