Fv3基因、大腸桿菌ToplO和Rosetta2菌、克隆載體 pGEM-T Easy Vector、限制性內(nèi)切酶 BamH1、Hind II1、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶(、表達載體PQE80L、膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒，含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體，抗GBM抗體，快速純化系統(tǒng)儀器；
[0039]B、單鏈抗體scFv3基因的PCR擴增，以重組噬菌粒pCANTAB_scFv3為模板，XPl和XP2為引物，進行PCR擴增；PCR擴增的引物序列:正義鏈5' TGGATCCCTGAGGGCCGGTTGTTTTTACC3丨;擴增條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸40秒，循環(huán)35次，72°C延伸5分鐘至4°C ;預(yù)期擴增產(chǎn)物片段scFv3DNA長度為750bp ;
[0040]C、克隆載體PGEM-scFv3的構(gòu)建和鑒定，PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM_T Easy載體進行連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌ToplO，轉(zhuǎn)化后的菌液接種含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。通過藍白斑篩選，選出陽性菌落。再接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，370C 250r/min振蕩過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)BamH 1、Hind III雙酶切，電泳驗證片段大小，將重組質(zhì)粒進行測序；
[0041 ] D、表達載體pQE80-l scFv3的構(gòu)建和鑒定，將測序驗證正確的重組質(zhì)粒PGEM-scFv3和pQE80L質(zhì)粒分別用BamHI1、Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝電泳后回收；將scFv3與表達載體pQE80L進行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta2菌，挑取陽性克隆進行酶切鑒定，命名為pQE80L-SCFv3 ;
[0042]E、單鏈抗體scFv3在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達；將含有pQE80L_scFv3重組質(zhì)粒的單菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；按1:50將過夜培養(yǎng)物接種與新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600nm為0.8，加異丙基硫代半乳糖苷IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)，30°C振蕩培養(yǎng)6小時；
[0043]F、表達產(chǎn)物的純化，取Iml誘導(dǎo)表達菌液，12000r/min多次離心I分鐘收集沉淀，再用Iml菌液定容，用超聲破碎儀破碎誘導(dǎo)表達菌；破碎條件為:功率200W，超聲時間3秒，間隔時間3秒，超聲次數(shù)3次，循環(huán)6次；超聲破碎后，3000r/min離心30分鐘，取上清進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達的scFv3存在于破碎上清；利用N_i NTA親和層析法，從破碎上清中純化可溶性scFv3蛋白
[0044]G,Western blot檢測scFv3的免疫活性，步驟F中純化的表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜，滴加5%脫脂奶粉/PBS封閉37°C I小時；用PBS漂洗NC膜，加入一抗(抗GBM抗體)，于4°C孵育過夜；用PBS洗3次，加入二抗(含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體)，37°C孵育2小時；用PBS洗15分鐘，再加入BCIP/NBT顯色后觀察結(jié)果。
[0045]其中，在步驟E中“37°C振蕩培養(yǎng)至0D600nm為0.8”，也可以為0.6、0.7、0.9或1.0，當(dāng)然也可以為0.6-1.0中的其它數(shù)值，同樣步驟F中，破碎條件中的循環(huán)次數(shù)也可以為7次。
[0046]文中提到的材料或型號:
[0047]T4DNA 連接酶為美國 Promega ；
[0048]表達載體PQE80L、膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒均為德國Qiagen ；
[0049]含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體為美國Genelabs Diagnostics)；
[0050]抗GBM抗體為德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司；
[0051]快速純化系統(tǒng)儀器為美國GE Healthcare公司生產(chǎn)；
[0052]引物XPl和XP2由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成；
[0053]重組質(zhì)粒的測序，是在上海博尚生物技術(shù)有限公司進行測序的。
【主權(quán)項】
1.人源化抗腎小球基底膜抗體的單鏈抗體scFv3的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括以下步驟: A、選材，篩選出抗人GBM抗體的單鏈抗體scFv3基因、大腸桿菌ToplO和Rosetta2菌、克隆載體pGEM-T Easy Vector、限制性內(nèi)切酶BamH1、Hind II1、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、表達載體PQE80L、膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒，含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體，抗GBM抗體，快速純化系統(tǒng)儀器； B、單鏈抗體scFv3基因的PCR擴增，以重組噬菌粒pCANTAB-scFv3為模板，XPl和XP2為引物，進行PCR擴增； C、克隆載體pGEM-SCFv3的構(gòu)建和鑒定，PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM_TEasy載體進行連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌ToplO，轉(zhuǎn)化后的菌液接種含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。通過藍白斑篩選，選出陽性菌落。再接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，370C 250r/min振蕩過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)BamH 1、Hind III雙酶切，電泳驗證片段大小，將重組質(zhì)粒進行測序； D、表達載體pQE80-lscFv3的構(gòu)建和鑒定，將測序驗證正確的重組質(zhì)粒pGEM-scFv3和PQE80L質(zhì)粒分別用BamHI1、Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝電泳后回收；將scFv3與表達載體PQE80L進行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta2菌，挑取陽性克隆進行酶切鑒定，命名為 pQE80L-scFv3 ； E、單鏈抗體scFv3在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達；將含有pQE80L-SCFv3重組質(zhì)粒的單菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；按1:50將過夜培養(yǎng)物接種與新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600nm為0.6—1.0,加異丙基硫代半乳糖苷IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)，30°C振蕩培養(yǎng)6小時； F、表達產(chǎn)物的純化，取Iml誘導(dǎo)表達菌液，12000r/min多次離心I分鐘收集沉淀，再用Iml菌液定容，用超聲破碎儀破碎誘導(dǎo)表達菌； G、Westernblot檢測scFv3的免疫活性，步驟F中純化的表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜，滴加5%脫脂奶粉/PBS封閉37°C I小時；用PBS漂洗NC膜，加入一抗(抗GBM抗體),于4°C孵育過夜；用PBS洗3次，加入二抗(含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體)，37°C孵育2小時；用PBS洗15分鐘，再加入BCIP/NBT顯色后觀察結(jié)果O2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟B中PCR擴增的引物序列:正義鏈 5' TGGATCCCTGAGGGCCGGTTGTTTTTACC3';擴增條件為:94°C預(yù)變性 5 分鐘，94°C變性 30秒，57°C退火30秒，72°C延伸40秒，循環(huán)35次，72°C延伸5分鐘至4°C ;預(yù)期擴增產(chǎn)物片段 scFv3DNA 長度為 750bp。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于: 步驟F中的破碎條件為:功率200W，超聲時間3秒，間隔時間3秒，超聲次數(shù)3次，循環(huán)6— 7次。超聲破碎后，3000r/min離心30分鐘，取上清進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達的scFv3存在于破碎上清；利用N-1 NTA親和層析法，從破碎上清中純化可溶性scFv3蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人源化抗腎小球基底膜抗體的單鏈抗體scFv3的制備方法，包括選材、PCR擴增、隆載體pGEM-scFv3的構(gòu)建和鑒定、表達載體pQE80-l？scFv3的構(gòu)建和鑒定、單鏈抗體scFv3在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達、pQE80L-scFv3重組質(zhì)粒的單菌的LB培養(yǎng)、純化和檢測scFv3的免疫活性落等步驟，本發(fā)明首次制備出了抗GBM抗體的單鏈抗體scFv3,并對其進行了純化和免疫活性檢測。理論上,scFv3蛋白可抑制抗GBM抗體與靶抗原α3(Ⅳ)NC1的結(jié)合,從而減輕抗GBM抗體介導(dǎo)的抗GBM病，這為探索抗GBM病的治療方法提供了一種新的思路。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/13, C07K16/42
【公開號】CN105131118
【申請?zhí)枴緾N201510669438
【發(fā)明人】劉章鎖
【申請人】劉章鎖
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年10月16日