人源化抗腎小球基底膜抗體的單鏈抗體scFv3的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及屬于醫(yī)療生物領(lǐng)域，具體的說涉及單鏈抗體scFv3的制備方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]抗腎小球基底膜病是以循環(huán)中抗GBM抗體陽性和(或)抗GBM抗體在肺和(或)腎臟中沉積為特征的一組自身免疫性疾病，起病急，發(fā)展快，預(yù)后差?？笹BM抗體對于抗GBM病具有診斷意義，它的水平與病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后都有明顯相關(guān)性，提示該抗體在發(fā)病機制中起了重要作用?？笹BM抗體的靶抗原為GBM中IV型膠原α 3鏈的羧基末端球狀非膠原區(qū)(NCl區(qū))。
[0003]目前抗GBM病的主要治療方法是強化血漿置換和免疫抑制劑聯(lián)合治療。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑只能部分減少抗GBM抗體的產(chǎn)生，對于體內(nèi)已存在的致病性抗體卻無能為力。血漿置換可以清除體內(nèi)循環(huán)的抗GBM抗體，并不能解離已與靶抗原結(jié)合的抗體，特異性較差，且價格昂貴。如果我們能獲得抗GBM抗體的特異性抗體，分子量較小，不僅能與血液循環(huán)中游離的抗體結(jié)合，形成小的復(fù)合物，濾過基底膜；也可以封閉抗GBM抗體，使其不能與靶抗原結(jié)合，從而不再繼續(xù)損害腎臟，從而緩解患者的癥狀，縮短病程，改善預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明主要解決目前在治療GBM方面存在的技術(shù)不足，提供了一種在原核細(xì)胞中構(gòu)建并表達(dá)抗腎小球基底膜(GBM)抗體的單鏈抗體scFv3的方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0006]人源化抗腎小球基底膜抗體的單鏈抗體scFv3的制備方法，其特征在于，其制備方法包括以下步驟:
[0007]A、選材，篩選出抗人GBM抗體的單鏈抗體scFv3基因、大腸桿菌ToplO和Rosetta2菌、克隆載體pGEM-T Easy Vector、限制性內(nèi)切酶BamH1、HindII1、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、表達(dá)載體PQE80L、膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒，含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體，抗GBM抗體，快速純化系統(tǒng)儀器；
[0008]B、單鏈抗體scFv3基因的PCR擴增，以重組噬菌粒pCANTAB_scFv3為模板，XPl和XP2為引物，進(jìn)行PCR擴增；
[0009]C、克隆載體PGEM-scFv3的構(gòu)建和鑒定，PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM_T Easy載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌ToplO，轉(zhuǎn)化后的菌液接種含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。通過藍(lán)白斑篩選，選出陽性菌落。再接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，370C 250r/min振蕩過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)BamH 1、Hind III雙酶切，電泳驗證片段大小，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序；
[0010]D、表達(dá)載體PQE80-1 scFv3的構(gòu)建和鑒定，將測序驗證正確的重組質(zhì)粒PGEM-scFv3和pQE80L質(zhì)粒分別用BamHI1、Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝電泳后回收；將scFv3與表達(dá)載體pQE80L進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta2菌，挑取陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定，命名為pQE80L-SCFv3 ;
[0011]E、單鏈抗體scFv3在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)；將含有pQE80L-scFv3重組質(zhì)粒的單菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；按1:50將過夜培養(yǎng)物接種與新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600nm為0.6—1.0,加異丙基硫代半乳糖苷IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)，30°C振蕩培養(yǎng)6小時；
[0012]F、表達(dá)產(chǎn)物的純化，取Iml誘導(dǎo)表達(dá)菌液，12000r/min多次離心I分鐘收集沉淀，再用Iml菌液定容，用超聲破碎儀破碎誘導(dǎo)表達(dá)菌；
[0013]G,Western blot檢測scFv3的免疫活性，步驟F中純化的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜，滴加5%脫脂奶粉/PBS封閉37°C I小時；用PBS漂洗NC膜，加入一抗(抗GBM抗體)，于4°C孵育過夜；用PBS洗3次，加入二抗(含堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體)，37°C孵育2小時；用PBS洗15分鐘，再加入BCIP/NBT顯色后觀察結(jié)果。
[0014]作為一種改進(jìn):
[0015]步驟B中，PCR擴增的引物序列:正義鏈 5' TGGATCCCTGAGGGCCGGTTGTTTTTACC3'；擴增條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸40秒，循環(huán)35次，72°C延伸5分鐘至4°C ;預(yù)期擴增產(chǎn)物片段scFv3DNA長度為750bp。
[0016]作為進(jìn)一步的改進(jìn):
[0017]步驟F中的破碎條件為:功率200W，超聲時間3秒，間隔時間3秒，超聲次數(shù)3次，循環(huán)6—7次。超聲破碎后，3000r/min離心30分鐘，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的scFv3存在于破碎上清；利用N-1 NTA親和層析法，從破碎上清中純化可溶性scFv3蛋白。
[0018]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明主要方法為用PCR擴增抗GBM抗體單鏈抗體scFv3基因，即將scFv3DNA與pGEM_T Easy質(zhì)粒連接，構(gòu)建克隆載體pGEM_scFv3 ;用酶切后電泳鑒定構(gòu)建載體的正確性；測序檢測質(zhì)粒重組后序列有無改變；再將scFv3亞克隆入表達(dá)載體PQE-80L,構(gòu)建pQE80L-scFv3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2,酶切鑒定。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后，通過SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物的抗體活性。
[0019]其中，scFv3單鏈抗體有許多優(yōu)點:
[0020](I)分子小，免疫原性低，用于人體不易產(chǎn)生抗異種蛋白反應(yīng)；
[0021](2)容易進(jìn)入血循環(huán)，半衰期短，全身清除快，腎臟蓄積很少；
[0022](3) Fe段，不易與具有Fe受體的非靶細(xì)胞結(jié)合；
[0023](4)由于單鏈抗體不需要糖基化，可用原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)，易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)。
[0024]結(jié)果分析:
[0025]1、scFv3 基因的 PCR 擴增
[0026]以重組噬菌粒PCANTAB-scFv3為模板進(jìn)行PCR擴增，凝膠電泳顯示一條750bp大小的基因片段。
[0027]2、克隆載體pGEM_scFv3的酶切鑒定
[0028]篩選得到的重組pGEM_scFv3用BamH1、Hind III雙酶切顯示兩個片段，分別是3.0kb和750bp,與預(yù)計結(jié)果相同。
[0029]3、測序及表達(dá)載體pQE80-l scFv3的酶切鑒定
[0030]測序結(jié)果顯示，克隆入pGEM-T Easy載體的基因片段與篩選出的單鏈抗體scFv3一致。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH1、Hind III雙酶切。將scFv3亞克隆入表達(dá)載體PQESOLo酶切鑒定顯示有兩條基因片段，一條是750bp，一條是4.7kb，證明重組質(zhì)粒正確的克隆入表達(dá)載體。
[0031]4、scFv3的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0032]將重組菌用IPTG低溫誘導(dǎo)6小時后，菌液超聲破碎，破碎上清用15% SDS-PAGE電泳分析可見一條相對分子量約27kD特異的誘導(dǎo)表達(dá)帶。利用N-1 NTA親和層析法從破碎上清中純化scFv3蛋白。電泳顯示目的蛋白得到了較好的純化。
[0033]5、Western blot 檢測 scFv3 的免疫活性
[0034]將抗GBM抗體稀釋后，作為一抗進(jìn)行Western blot鑒定，在純化后的誘導(dǎo)蛋白相應(yīng)位置處有一明顯的特異性染色條帶，說明誘導(dǎo)表達(dá)的scFv3能與抗GBM抗體特異性結(jié)入口 ο
[0035]結(jié)果討論:
[0036]本發(fā)明主要通過對噬菌體展示技術(shù)所篩選出的抗GBM抗體的單鏈抗體scFv3基因進(jìn)行原核表達(dá)，首次制備出了抗GBM抗體的單鏈抗體scFv3，并對其進(jìn)行了純化和免疫活性檢測。理論上，scFv3蛋白可抑制抗GBM抗體與革E抗原a 3 ( IV )NC1的結(jié)合，從而減輕抗GBM抗體介導(dǎo)的抗GBM病，這為探索抗GBM病的治療方法提供了一種新的思路。
【具體實施方式】
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[0037]實施例1:人源化抗腎小球基底膜抗體的單鏈抗體scFv3的制備方法，其制備方法包括以下步驟:
[0038]A、選材，篩選出抗人GBM抗體的單鏈抗體sc